Name: System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Poznaj system mikroprzepływowy do badania bioefektów kawitacji na pojedynczych komórkach z precyzyjnym wzorcem powierzchniowym. Ta metoda umożliwia kontrolowane generowanie pęcherzyków i badanie porażenia błony komórkowej oraz odpowiedzi wapniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować za korzystanie z obiektu clean room SMIF na Uniwersytecie Duke'a. Chcemy również podziękować Hao Qiangowi za jego pomoc w pomiarze prędkości dżetu. Autorzy dziękują Toddowi Rumbaughowi z Hadland Imaging za dostarczenie kamery Shimadzu HPV-X użytej w tym badaniu. Prace zostały częściowo sfinansowane przez NIH poprzez granty 5R03EB017886-02 i 4R37DK052985-20.

<ol><li>Wang, D., Bodovitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis%3A+the+new+frontier+in+%27omics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis: the new frontier in 'omics.</a> Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).</li>
<li>Weaver, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+high-throughput+single-cell+microtechnologies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Advances in high-throughput single-cell microtechnologies.</a> Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).</li>
<li>Gossett, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+stretching+of+single+cells+for+large+population+mechanical+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).</li>
<li>Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+single-cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Measurement of single-cell dynamics.</a> Nature. 465 (7299), 736-745 (2010).</li>
<li>Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+single+cell+analysis%3A+from+promise+to+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic single cell analysis: from promise to practice.</a> Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).</li>
<li>Kennedy, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-intensity+focused+ultrasound+in+the+treatment+of+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours.</a> Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).</li>
<li>Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stress+waves+and+cavitation+in+stone+comminution+in+shock+wave+lithotripsy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy.</a> Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).</li>
<li>Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+single+cell+sonoporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled single cell sonoporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).</li>
<li>Itah, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+cavitation+kills+prostate+cells+and+ablates+benign+prostatic+hyperplasia+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue.</a> Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).</li>
<li>Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bubbly+cavitating+flow+generation+and+investigation+of+its+erosional+nature+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).</li>
<li>Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+membrane+poration+by+bubble-induced+microjets+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).</li>
<li>Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yield+Strength+of+Human+Erythrocyte+Membranes+to+Impulsive+Stretching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching.</a> Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).</li>
<li>Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+induced+stretching+of+red+blood+cells+by+oscillating+bubbles+within+a+narrow+gap%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Am+Phys+Soc%22%5BJournal%5D)">Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap.</a> Bull Am Phys Soc. 58, (2013).</li>
<li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101(2010).</li>
<li>Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+microbubble+poration+of+localized+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Laser-induced microbubble poration of localized single cells.</a> Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li>
<li>Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+tandem+bubble+interaction+in+a+microfluidic+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acoust+Soc+Am%22%5BJournal%5D)">Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel.</a> J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).</li>
<li>Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf">http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf</a> (2000).</li>
<li>Yang, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Analysis+of+Tandem+Bubble+Interaction+and+Jet+Formation+in+a+Microfluidic+Channel%22">Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel</a>. , Duke University. (2013).</li>
<li>Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+strains+and+strain+rates+in+motile+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes.</a> Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).</li>
<li>Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+measurements+in+cultured+vascular+smooth+muscle+cells+subjected+to+mechanical+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation.</a> Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).</li>
<li>Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+deformation+and+bioeffects+produced+by+tandem+bubble-induced+jetting+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).</li>
<li>Yin, H., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for single cell analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).</li>
<li>Tay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+NF-kappa+B+dynamics+reveal+digital+activation+and+analogue+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing.</a> Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).</li>
<li>Rand, R. P., Burton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Properties+of+the+Red+Cell+Membrane%3A+I.+Membrane+Stiffness+and+Intracellular+Pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure.</a> Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).</li>
<li>Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+deformation+of+living+cells+using+laser+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Mater%22%5BJournal%5D)">Large deformation of living cells using laser traps.</a> Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).</li>
<li>Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+the+human+red+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of the human red blood cell.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).</li>
<li>Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonoporation+by+single-shot+pulsed+ultrasound+with+microbubbles+adjacent+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells.</a> Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).</li>
<li>van Wamel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrating+microbubbles+poking+individual+cells%3A+Drug+transfer+into+cells+via+sonoporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation.</a> J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).</li>
<li>Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+perforation+and+recovery+dynamics+in+microbubble-mediated+sonoporation%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation.</a> Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).</li>
<li>Dijkink, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+cavitation-cell+interaction%3A+trans-membrane+transport+and+viability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies.</a> Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).</li>
<li>Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+laser+microbeam-induced+cell+lysis%3A+Time-resolved+imaging+and+analysis+of+hydrodynamic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects.</a> Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analiza pojedynczych komórek, w połączeniu z obrazowaniem żywych komórek, znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat dynamicznych i często zmiennych procesów zachodzących w poszczególnych komórkach, takich jak rozwój fenotypu i odpowiedź immunologiczna23. W przeciwieństwie do konwencjonalnych hodowli komórkowych w szalkach lub kolbach, systemy mikroprzepływowe umożliwiają precyzyjną kontrolę mikrośrodowiska, aż do poziomu pojedynczej komórki, w czasie rzeczywistym. W związku z tym postępy w technologii i techni...

Coraz częściej dostrzega się, że heterogeniczność komórkowa, wynikająca ze stochastycznej ekspresji genów, białek i metabolitów, występuje w obrębie dużej populacji komórek i stanowi fundamentalną zasadę biologiczną umożliwiającą adaptację i ewolucję komórek1. W związku z tym stosowanie pomiarów zbiorczych dla całych populacji w celu zrozumienia funkcji poszczególnych komórek oraz ich interakcji jest często niedokładne i niewiarygodne. Opracowanie nowych technologii analizy pojedynczych komórek jest zatem przedmiotem dużego zainteresowania w badaniach biologicznych i farmakologicznych i może być wykorzystane, na przykład, do lepszego zrozumienia kluczowych szlaków sygnałowych i procesów w biologii komórek macierzystych oraz terapii nowotworów2-4. W ostatnich latach pojawienie się platform mikroprzepływowych znacznie ułatwiło analizę pojedynczych komórek, umożliwiając pozycjonowanie, traktowanie oraz obserwację odpowiedzi poszczególnych komórek przy użyciu nowatorskich strategii analitycznych5.
Kawitacja odgrywa istotną rolę w szerokim zakresie zastosowań biomedycznych, w tym w leczeniu nowotworów za pomocą skoncentrowanego ultradźwięków o wysokiej intensywności (HIFU)6, nieinwazyjnej fragmentacji kamieni nerkowych poprzez litotryksję fal uderzeniowych (SWL)7, dostarczaniu leków lub genów poprzez sonoporację8 oraz niedawno opisanej destrukcji komórek lub tkanek za pomocą hydrodynamicznej kawitacji pęcherzykowej9,10. Mimo to dynamiczne procesy oddziaływań pęcherzyków kawitacyjnych z tkanką biologiczną i komórkami nie są jeszcze dobrze poznane. Wynika to z losowości inicjacji kawitacji oraz dynamiki pęcherzyków generowanych przez ultradźwięki, fale uderzeniowe i lokalne ciśnienie hydrauliczne; ponadto brakuje technik umożliwiających analizę z natury złożonych i szybkich odpowiedzi komórek biologicznych, zwłaszcza na poziomie pojedynczej komórki.
Ze względu na te wyzwania nie jest zaskakujące, że w literaturze opisano bardzo niewiele badań nad oddziaływaniami pęcherzyków z komórkami w ściśle kontrolowanych warunkach eksperymentalnych. Na przykład, za pomocą pojedynczych pęcherzyków generowanych laserowo w kanałach mikroprzepływowych zademonstrowano porację błony pojedynczych komórek uwięzionych w zawiesinie11 oraz impulsową dużą deformację ludzkich erytrocytów12. Ta druga technika pozwala jednak na wywołanie jedynie niewielkiej deformacji w komórkach eukariotycznych ze względu na obecność jądra komórkowego13. Co więcej, monitorowanie późniejszych bioefektów podczas traktowania komórek w zawiesinie jest utrudnione. W innych badaniach opisano pobudzenie ultradźwiękowe mikropęcherzyka związanego z komórką (lub środka kontrastowego do USG) w celu wywołania poracji błony i/lub wewnątrzkomórkowych odpowiedzi wapniowych w pojedynczych komórkach przylegających8. Porację błony pojedynczych komórek przylegających można również uzyskać, stosując tandemowe pęcherzyki generowane laserowo w cienkiej warstwie cieczy zawierającej absorbujący światło roztwór błękitu trypanu14, lub za pomocą oscylującego pęcherzyka gazu generowanego przez mikrosekundowe impulsy laserowe naświetlane przez optycznie absorbujący podłoże w mikrokomorach15. W porównaniu z roztworem błękitu trypanu, optycznie absorbujące podłoże ma tę przewagę, że błękit trypanu jest toksyczny dla komórek. Co ważniejsze, pęcherzyki generowane laserowo są łatwiejsze do kontrolowania pod względem rozmiaru i lokalizacji niż pęcherzyki wzbudzane akustycznie. Niemniej jednak we wszystkich tych wcześniejszych badaniach nie kontrolowano kształtu komórek, ich orientacji ani warunków adhezji, co może mieć istotny wpływ na odpowiedź komórkową i bioefekty wywołane naprężeniami mechanicznymi16.
Aby wyeliminować te niedociągnięcia z poprzednich badań, opracowaliśmy niedawno system eksperymentalny do generowania pęcherzyków, wzorowania komórek, badania oddziaływań pęcherzyk-pęcherzyk-komórka oraz bioanaliz odpowiedzi komórkowej w czasie rzeczywistym w chipie mikrofluidycznym, wykonanym przy użyciu unikalnej kombinacji technik mikrofabrykacji. Trzy główne cechy, które odróżniają nasz system eksperymentalny od innych w tej dziedzinie, to: 1) wzorowanie złotych kropek o rozmiarach mikronowych na szklanym podłożu, co umożliwia lokalną absorpcję lasera w celu generowania pęcherzyków17; 2) wzorowanie mikronowych wysepek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) dla adhezji komórek na tym samym podłożu, aby kontrolować zarówno położenie, jak i geometrię poszczególnych komórek; oraz 3) ograniczenie wymiarowości domeny oddziaływań pęcherzyk-pęcherzyk-komórka z przestrzeni 3D do przestrzeni quasi-2D, co ułatwia wizualizację w jednej płaszczyźnie oddziaływań między pęcherzykami, pól przepływu strumieni, deformacji komórek oraz efektów biologicznych, a wszystko to zostało zarejestrowane w jednej, usprawnionej sekwencji obrazowania (Ryc. 1d).
<img alt="Schemat urządzenia mikrofluidycznego: deformacja komórek, poracja, odpowiedź wapniowa; pęcherzyki tandemowe, przepływ strumieniowy." src="/files/ftp_upload/55106/55106fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Chip mikroprzepływowy i schematy różnych analiz. a) Zmontowany chip mikroprzepływowy z kanałami wypełnionymi niebieskim atramentem w celu wizualizacji. b) Obszar wewnątrz chipa mikrofluidycznego z ułożonymi w określony wzór komórkami i złotymi kropkami (odległość między dwiema sąsiadującymi złotymi kropkami wynosi 40 µm). W kanale można rozmieścić wiele par jednostek roboczych. c) Zbliżenie pojedynczej jednostki roboczej składającej się z pary złotych kropek oraz przytwierdzonej do obszaru wzorowania komórek komórki HeLa. d) Schemat działania urządzenia. Pojedyncza komórka przylega i rozprzestrzenia się na wyspie w kształcie litery „H” pokrytej fibronektyną. Para pęcherzyków kawitacyjnych (pęcherzyki tandemowe) z oscylacją przeciwfazową jest wytwarzana poprzez naświetlanie impulsami wiązki lasera złotych punktów (patrz Rycina 4a), co prowadzi do powstania szybkiego i zlokalizowanego strumienia skierowanego w stronę pobliskiej komórki docelowej. W zależności odległości odstępu (S), komórka może ulec deformacji, poracji w celu poboru makrocząsteczek i/lub stymulacji odpowiedzi wapniowej.d) komórki do tandemowej pęcherzyka. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Platformę tę można dodatkowo łączyć z testami fluorescencyjnymi oraz funkcjonalizowanymi kuleczkami przyczepionymi do powierzchni komórek w celu badania bioefektów indukowanych kawitacją. W szczególności platforma ta umożliwia przeprowadzanie wiarygodnych i mierzalnych analiz na poziomie pojedynczej komórki. Do tej pory wykorzystywaliśmy to urządzenie do analizy deformacji błony komórkowej indukowanej tandemowymi pęcherzykami, poracji komórek i pobierania wewnątrzkomórkowego, przeżywalności, apoptozy oraz odpowiedzi wapniowej wewnątrzkomórkowej. W poniższym protokole opisujemy proces produkcji chipa oraz procedurę analizy wspomnianych wyżej różnorodnych bioefektów. Ponadto opisano również zasady działania chipa.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik/Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 mm x 38 mm Zwykłe szkiełka mikroskopowe</td><td>Corning</td><td>2947-75X38</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>320110</td><td>Odczynnik ACS, &ge; 99,5%</td></tr> <tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>W292907</td><td>&ge; 99,7%, FCC, FG</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>320501</td><td>Odczynnik ACS, 95,0-98,0%</td></tr> <tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>216763</td><td>30 % wag. w H2O</td></tr><tr><td>Primer P-20</td><td>Microchem</td><td>MCC Primer 80/20</td><td></td></tr><tr><td>NFR photoresist</td><td>JSR</td><td>NFR016D2</td><td></td></tr><tr><td>Photomask</td><td>Photoplotstore</td><td>N/A</td><td>4x4 Maska bezpośredniego zapisu</td></tr><tr><td>MF-319 Developer</td><td>Shipley (Rohm and Haas)</td><td>Microposit MF-319</td><td></td></tr><tr><td>1165 Photoresist Remover</td><td>Dow Chemical, Co. </td><td>DEM-10018073</td> Fotorezystuł S1813 na <td>bazie 1-metylo-2-pirolidynonu</td></tr><tr><td></td><td>Shipley (Rohm and Haas)</td><td>S1813</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Folia parafinowa</td><td>HACH</td><td>251764</td><td></td></tr><tr><td>SU-2025 fotorezystor</td><td>Microchem</td><td>SU-2025</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do mikrootworów</td><td>Saint-Gobain PPL Corp.</td><td>S-54-HL</td><td></td></tr><tr><td>Metalowe kołki</td><td>New England Small Tube</td><td>NE-1300-01</td><td>Cut Tube (proste), 0,025" OD x 0,017" Średnica wewnętrzna x 0,50 cala Długie</td></tr><tr><td>komórki HeLa</td><td>Zakład Hodowli Komórek Duke'a</td><td>(307-CCL-2) HeLa, p.148</td><td></td></tr><tr><td>Bufor DPBS (1x)</td><td></td><td></td> Pożywka hodowlana ThermoFisher Scientific 14190144 <td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna Białko bydlęce, osocze</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P21493</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery karboksylowe 1.00&nbsp; &mu; m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>08226-15</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery karboksylowe 2.00&nbsp; &mu; m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18327-10</td><td></td></tr><tr><td>EDC (chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Sulfo-NHS (N-hydroksysulfosukcynimid)</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Peptyt-2000</td><td>Zaawansowany BioMatrix</td><td>5020-5MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC Załącznik V</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A13199</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>F-127</td><td>invitrogen</td><td>P6866</td><td>0.2 &micro; m przefiltrowane (10% roztwór w wodzie)</td></tr><tr><td>Zredukowane podłoże surowicy&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma asher</td><td>Emitech</td><td>K-1050X</td><td>O2 / Ar spopielanie plazmowe fotorezystu i innych materiałów organicznych</td></tr><tr><td>Nakładka do masek</td><td>SUSS MicroTec&nbsp;</td><td>Karl Suss MA6/BA6</td><td></td></tr><tr><td>Parownik wiązki elektronicznej</td><td>CHA Industries</td><td>CHA Industries Solution E-Beam</td><td></td></tr><tr><td>RIE</td><td>Trion Technology&nbsp;</td><td>Trion Technology Phantom II</td> <td>(tlenek / azotek / polimer) trawienie</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>AmScope</td><td>American Scope SM-4TZ-FRL</td><td>Mikroskop stereoskopowy</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Chemyx Inc</td><td>NanoJet</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>NuAire</td><td>AutoFlow NU-8500 Płaszcz wodny Inkubator CO2 Szafy</td> bezpieczeństwa biologicznego NuAire NU-425-400 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>VWR</td><td>1122s</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>IEC</td><td>Centra CL2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Laser Nd:YAG&nbsp; (Laser 1)</td><td>Laser New Wave Research</td><td>Tempest</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG&nbsp; (Laser 2)</td><td>Badania Nowej Fali</td> Generator opóźnienia <td>Oriona</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Berkeley Nucleonics&nbsp;</td><td>BNC 565-8c</td><td></td></tr><tr><td>Lampa błyskowa</td><td>Dyna-Lite</td><td>ML1000 lampa błyskowa</td><td></td>ze światłowodem</tr><tr><td></td><td>DRS Hadland</td><td>&nbsp; Kamera szybkoobrotowa Imacon 200</td><td></td></tr><tr>Kamera<td>szybkoobrotowa</td><td>Shimadzu</td><td>HPV-X</td><td></td></tr> Oprogramowanie PIV <tr><td></td><td>Vision Research</td><td>Phantom V7.3</td><td></td></tr><tr><td>Kamera LaVision</td><td></td><td>DaVis 7.2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Oprogramowanie Zeiss</td><td>AxioCam MRc 5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>System Zeiss</td><td>AxioVision</td><td></td></tr><tr><td>PTI</td><td>Horiba</td><td>S/N: 1705 RAM-X</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>EasyRatio Horiba</td><td>Easy Ratio Pro 2</td><td>wersja 2.3.125.86</td></tr><tr><td>63 i razy; obiektyw</td><td>Zeiss</td><td>LD Plan Neofluar</td><td></td></tr></tbody></table>

system mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

W tym manuskrypcie najpierw opisujemy protokół produkcji mikroprzepływowego chipa, ze złotymi kropkami i obszarami pokrytymi fibronektyną na tym samym szklanym podłożu, który precyzyjnie kontroluje generowanie tandemowych pęcherzyków i pojedynczych komórek wzorzystych w pobliżu o dobrze zdefiniowanych lokalizacjach i kształtach. Następnie demonstrujemy generowanie pęcherzyków tandemowych za pomocą dwóch impulsowych laserów oświetlających parę złotych kropek z kilkumikrosekundowym opóźnieniem czasowym. Wizualizujemy interakcję pęcherzyka-pęcherzyk i powstawanie dżetów za pomocą szybkiego obrazowania i charakteryzujemy wynikowe pole przepływu za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV). Na koniec przedstawiamy niektóre zastosowania tej techniki do analizy pojedynczych komórek, w tym porację błony komórkowej z wychwytem makrocząsteczek, zlokalizowaną deformację błony określoną przez przemieszczenia dołączonych kulek wiążących integryny oraz wewnątrzkomórkową odpowiedź wapnia z obrazowania ratiometrycznego. Nasze wyniki pokazują, że szybki i kierunkowy przepływ strumieniowy jest wytwarzany przez tandemową interakcję pęcherzykową, która może wywierać wysoce zlokalizowane naprężenie ścinające na powierzchnię komórki hodowanej w bliskiej odległości. Co więcej, różne efekty biologiczne mogą być wywoływane poprzez zmianę siły przepływu strumieniowego poprzez dostosowanie odległości dystansu od komórki do pęcherzyków tandemowych.

Platforma mikrofluidyczna opisana w niniejszej pracy może być wykorzystana do badania oddziaływań między pęcherzykami oraz do analizy różnorodnych bioefektów indukowanych kawitacją na poziomie pojedynczej komórki. W tej sekcji przedstawiamy kilka przykładów, aby zaprezentować różnorodne badania eksperymentalne i testy biologiczne, które można przeprowadzić w naszym systemie eksperymentalnym. W pierwszej kolejności zilustrujemy przejściowe oddziaływania tandemowych pęcherzyków z formowanie...

Mikroprzepływowy chip został stworzony do produkcji par złotych kropek do generowania pęcherzyków tandemowych i pokrytych fibronektyną wysp do tworzenia wzorów pojedynczych komórek w pobliżu. Wynikowe pole przepływu scharakteryzowano za pomocą prędkości obrazu cząstek i wykorzystano do badania różnych efektów biologicznych, w tym poracji błony komórkowej, deformacji błony i wewnątrzkomórkowej odpowiedzi wapnia.

System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Ogólnym celem tej procedury eksperymentalnej jest zbadanie bioefektów indukowanych kawitacją w ograniczeniu mikrofluidycznym z wykorzystaniem wzorowania powierzchni w celu precyzyjnego kontrolowania generowania tandemowych pęcherzyków oraz lokalizacji i kształtu poszczególnych komórek docelowych. Ten system mikrofluidyczny umożliwia przeprowadzanie eksperymentów z przechodzącymi pęcherzykami kawitacyjnymi i komórkami, co ma znaczenie dla zastosowań terapeutycznych i operacji dźwiękowych. Główną zaletą tej techniki jest zwiększenie precyzji dzięki zastosowaniu wzorowania powierzchni.Pozwala to na badanie bioefektów poszczególnych komórek i zapewnia wysoki strumień ładowania dzięki niezawodnym oddziaływaniom pęcherzyk-pęcherzyk. Wizualna demonstracja procedur jest kluczowa, ponieważ etapy tworzenia wzorów powierzchniowych oraz przygotowania komórek w chipie są złożone i wymagają zastosowania różnych technik oraz wskazówek. Wszystkie procedury mikrofabrykacji należy przeprowadzać w czystym pomieszczeniu, nosząc odzież ochronną przeznaczoną do pracy w clean roomie.Zaprojektuj powierzchnię każdej złotej kropki w zakresie od 25 do 30 mikrometrów kwadratowych, aby była ona wystarczająco d

a-microfluidic-system-with-surface-patterning-for-investigating

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy protokół wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych, które umożliwiają wychwytywanie i hodowlę komórek. W tym podejściu wykorzystuje się ustrukturyzowane mikrostruktury, takie jak rowki wewnątrz kanałów mikrofluidycznych, aby stworzyć obszary o niskim naprężeniu ścinającym, w których komórki mogą zostać unieruchomione.

Urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

Urządzenia mikrofluidyczne mogą być wykorzystywane do wizualizacji złożonych procesów naturalnych w czasie rzeczywistym i w odpowiednich skalach fizycznych. Opracowaliśmy proste urządzenie mikrofluidyczne, które naśladuje kluczowe cechy naturalnych ośrodków porowatych, służące do badania wzrostu i transportu bakterii w podłożu gruntowym.

Okno na mikroświat: Proste systemy mikrofluidyczne do badania transportu drobnoustrojów w ośrodkach porowatych

Źródło: Kurz, D. L. i in. Platforma mikrofluidyczna do badania biozatkania w porowatych ośrodkach. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do badania powstawania biofilmu. Do mikrokanału wprowadzana jest zawiesina bakteryjna, po której następuje inkubacja, umożliwiająca rozwój biofilmu. Następnie wznawia się przepływ, a monitorowanie ciśnienia wraz z obrazowaniem wykorzystuje się do wykrywania powstawania biofilmu i zatkania porów w czasie.

Urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania w czasie rzeczywistym i śledzenia ciśnienia podczas tworzenia biofilmu

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Pokazujemy test oparty na mikrofluidyce do pomiaru skali czasowej dla komórek do przejścia przez sekwencję zwężeń w skali mikronów.

Technika mikroprzepływowa do badania odkształcalności komórek

Przedstawiamy protokół do wykonywania subtraktywnego wzorcowania monowarstw żywych komórek na powierzchni. Osiąga się to poprzez miejscową i selektywną lizę przylegających komórek za pomocą sondy mikroprzepływowej (MFP). Lizat komórkowy pobrany z lokalnych regionów może być wykorzystany do dalszej analizy, umożliwiając badania profilowania molekularnego.

Szybkie subtraktywne modelowanie warstw żywych komórek za pomocą sondy mikroprzepływowej

Prezentowany protokół eksperymentalny może być wykorzystany do wykonywania pomiarów aktywności kawitacyjnej w czasie rzeczywistym w urządzeniu do hodowli komórkowej w celu umożliwienia zbadania warunków wymaganych do skutecznego dostarczania leku i/lub innych efektów biologicznych.

Studiowanie terapii wzmocnionej kawitacją

Zaproponowano szybką i niezawodną technikę kontrolowania oscylacji kształtu pojedynczej, uwięzionej bańki akustycznej, która opiera się na technice koalescencji między dwoma bąbelkami. Oscylacje kształtu pęcherzyków w stanie ustalonym, kontrolowane symetrią umożliwiają analizę przepływu płynu generowanego w pobliżu granicy faz pęcherzyków.

Indukcja mikrostrumieniowania przez niesferyczne oscylacje pęcherzykowe w systemie lewitacji akustycznej

Protokół hodowli i manipulacji tkanką embrionalną myszy na chipie mikroprzepływowym jest dostarczony. Stosując impulsy modulatorów szlaku, system ten może być wykorzystany do zewnętrznego sterowania oscylacjami sygnałowymi w celu funkcjonalnego badania somitogenezy myszy.

Podejście mikrofluidyczne do funkcjonalnego badania oscylacji sygnalizacyjnych rządzących somitogenezą

Prezentujemy technologię, która wykorzystuje wspomagany kapilarność montaż w platformie mikroprzepływowej do modelowania mikroobiektów zawieszonych w cieczy, takich jak bakterie i koloidy, w określone tablice na podłożu z polidimetylosiloksanu.

Modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością

Obecny protokół opisuje platformę mikroprzepływową do badania rozwoju biofilmu w porowatych ośrodkach quasi-2D poprzez połączenie obrazowania mikroskopowego o wysokiej rozdzielczości z jednoczesnymi pomiarami różnicy ciśnień. Platforma określa ilościowo wpływ wielkości porów i natężenia przepływu płynu w porowatych ośrodkach na biozatkanie.

Platforma mikroprzepływowa do badania biozatykania w pożywkach porowatych

Poznaj system mikroprzepływowy do badania bioefektów kawitacji na pojedynczych komórkach z precyzyjnym wzorcem powierzchniowym. Ta metoda umożliwia kontrolowane generowanie pęcherzyków i badanie porażenia błony komórkowej oraz odpowiedzi wapniowej.

System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki (Wideo) | JoVE Journal

System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki

Przeglądaj więcej filmów