System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki

Ogólnym celem tej procedury eksperymentalnej jest zbadanie efektów biologicznych wywołanych kawitacją w uwięzieniu mikroprzepływowym przy użyciu wzorcowania powierzchni w celu precyzyjnej kontroli wytwarzania pęcherzyków tandemowych oraz lokalizacji i kształtu poszczególnych komórek docelowych. Ten system mikroprzepływowy umożliwia eksperymentowanie z pęcherzykami i komórkami kawitacji tranzytowej, co jest istotne dla publikacji terapeutycznych i dźwiękowych oraz operacji dźwiękowych. Główną zaletą tej techniki jest poprawa precyzji wzoru powierzchniowego.

Pozwala nam badać efekty biologiczne poszczególnych komórek i jest dużym obciążeniem strumienia wynikającym z niezawodnej interakcji pęcherzyka-pęcherzyk. Wizualna demonstracja procedur ma kluczowe znaczenie, ponieważ wzór powierzchni i przygotowanie komórek na etapach chipa są złożone i obejmują różne techniki i końcówki. Wykonuj wszystkie procedury mikroprodukcji w czystym pomieszczeniu, nosząc kombinezon do czystego pokoju.

Zaprojektuj obszar każdej złotej kropki w zakresie od 25 do 30 mikronów kwadratowych, tak aby był wystarczająco duży, aby pochłaniać energię lasera do generowania pęcherzyków, ale wystarczająco mały, aby uniknąć przylegania do niego pojedynczych komórek. Wyczyść szkiełko w kapturze chemicznym zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie przejdź do kaptura z powłoką wirową. Zaprogramuj koder wirowy tak, aby przyspieszył do 1000 obr./min w ciągu dwóch sekund i utrzymywał tę prędkość przez pięć sekund, a następnie zwiększ go do 3000 obr./min w ciągu trzech sekund i utrzymuj tę prędkość przez 30 sekund.

Następnie przymocuj szklane szkiełko do kodera wirowego za pomocą odkurzacza. Następnie przykryj szkiełko P20 i rozpocznij cykl wirowania. Następnie nałóż negatywny fotorezystor NFR w tym samym cyklu.

Teraz piecz szkiełko na gorącej płycie w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 60 sekund. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej wykonaj fotolitografię. Zamontuj chromowaną maskę na wyrównywaczu maski i upewnij się, że strona z wzorem jest skierowana w dół w kierunku szkiełka.

Następnie ustaw przepis fotolitograficzny na tryb twardej ekspozycji z dziewięciosekundową ekspozycją na promieniowanie UV i wyrównaj szklane podłoże z maską. Po ekspozycji na promieniowanie UV piecz szkiełko w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez minutę, a następnie pozwól mu ostygnąć jak poprzednio. Aby rozwinąć wzór na szkiełku, umieść go w roztworze wywoływacza na 60 sekund, a następnie umyj szkiełko wodą destylowaną i osusz je gazowym azotem.

Po potwierdzeniu wzoru za pomocą oględzin mikroskopowych piecz szkiełko w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez pięć minut i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Teraz wyczyść szkiełko plazmą w maszynie do trawienia jonów reaktywnych przez 90 sekund przy 500 torach i 100 watach. Za pomocą parownika z wiązką elektronową przykleić próbkę do uchwytu płytki.

Zaprogramuj maszynę tak, aby nakładała 5-nanometrową warstwę tytanu, a następnie 15-nanometrową warstwę złota. Po zakończeniu tej pozycji przewietrz maszynę. Następnie namocz szkiełko przez noc w zlewce z rozpuszczalnikiem do usuwania fotorezystu, aby usunąć złoto spoczywające na wierzchu rezystu NFR.

Następnego dnia umyj szkiełko acetonem, a następnie IPA, a następnie osusz azotem. Opłucz szkiełko wodą demineralizowaną i ponownie osusz azotem. Teraz podgrzej szkiełko w temperaturze 115 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie wyczyść szkiełko ze wzorem złotej kropki za pomocą ashera plazmy tlenowej o mocy 100 watów przez 90 sekund. Ustaw obszar każdej wyspy kodowanej fibronektyną tak, aby mieścił się w zakresie od 700 do 900 mikronów kwadratowych, aby ułatwić odpowiednie rozprzestrzenianie się komórek hela w kwadratowym obszarze, jednocześnie minimalizując szanse na agregację wielu komórek na wyspie. Produkcja jest bardzo podobna do wzoru złota.

Zakręć szkiełko jak poprzednio za pomocą dodatniego fotorezystu S18 i wypal na kodowaniu w temperaturze 115 stopni Celsjusza. Następnie należy wykonać fotolitografię, wyrównując ślady na masce z tymi na podłożu. Sprawdź wzór na środkowej części, aby potwierdzić prawidłowy kąt i dostosuj odległość odstępu od złotych kropek do wzoru H.

Uruchom ekspozycję na promieniowanie UV na dziewięć sekund bez pieczenia. Kolejna różnica polega na tym, że etap rozwoju zajmuje tylko 45 sekund. W przypadku reaktywnego trawienia jonowego ustaw parymetry na 500 tor 100 watów i 90 sekund.

Następnie nałóż kroplę roztworu pasywującego PLLG peg na kawałek folii parafinowej i ułóż roztwór na stronie wzoru szkiełka. Unikaj zatrzymywania bąbelków. Po 45 minutach wyjmij szkiełko z folii.

Opłucz szkiełko wodą DI, a następnie osusz je azotem. Następnie namocz szkiełko kolejno w zmywaczu fotorezystu 1165. Następnie 50 procent 1165 w wodzie DI.

Potem po prostu woda DI. Podczas każdej kąpieli mieszaj roztwór w kąpieli ultradźwiękowej przez 90 sekund. Teraz wysusz szkiełko na gorącej płycie, a następnie zamknij je w eksykatorze i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Zmontuj slajdy w układzie mikrokanałowym zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zwróć szczególną uwagę, aby osłonić wzorzysty obszar szklanego podłoża małą płytą PDMS przed użyciem reaktywnego trawienia jonowego w celu usunięcia kołka PLLG z obszaru obwodowego. Wyjmij wzorzyste szkło z maszyny RIE i usuń małą płytę PDMS.

Po potraktowaniu mikrokanałowego PDMS zmniejszoną dawką plazmy tlenowej, dopasuj go do wzorzystego szklanego podłoża pod stereoskopem. Doprowadź mikrokanałowy PDMS i wzorzyste szklane podłoże do konforemnego kontaktu. Teraz przystąp do korzystania z chipa.

Najpierw zalej chip, przepływając PBS w dół mikrokanału przez 30 minut z prędkością jednego mikrolitra na minutę. Następnie wlej chip roztworem fibronektyny przez 45 minut z tą samą szybkością przepływu. Czekając, przygotuj komórki w ilości pięciu milionów komórek na mililitr.

Zdrowy stan i wysoka konfluencja mają kluczowe znaczenie dla tej procedury. Później zastąp roztwór przepływający przez chip PBS i zwiększ natężenie przepływu do dziesięciu mikrolitrów na minutę. Pozwól PBS płynąć przez pięć minut.

Następnie wstrzyknąć przygotowane komórki do chipa za pomocą strzykawki. Gdy jedna kropla wypłynie z rurki, należy przerwać wtrysk i zacisnąć wylot. Następnie umieść chip w inkubatorze na 30 minut.

Później zwolnij wylot i przepłucz chip pożywką do hodowli komórkowych w ilości dziesięciu mikrolitrów na minutę przez pięć minut. Po pięciu minutach zmniejsz przepływ do 0,75 mikrolitra na minutę i przenieś chip i pompę do inkubatora na dwie godziny. Po dwóch godzinach przystąp do generowania pęcherzyków w tandemie, oglądając chip pod odwróconym mikroskopem z dwoma impulsowymi laserami NDI na regulatorach czasu skierowanych na wzór złotej kropki i za pomocą szybkiej kamery gotowej do uchwycenia wyników.

W przypadku pęcherzyków o wielkości 50 mikronów ustaw opóźnienie między dwoma laserami na 2,5 mikrosekundy i ustaw ich moc na dziesięć mikrodżuli. Następnie zsynchronizuj nagrywanie z kamery z dużą szybkością z laserami i twórz zapisy z prędkością dwóch milionów klatek na sekundę przy 200 nanosekundach ekspozycji. W ten sposób rejestrowana jest dynamika rozszerzania się pęcherzyka, interakcji bańka-bańka i powstawania dżetów.

Interakcje pęcherzyk-pęcherzyk i różnorodne efekty biologiczne wywołane kawitacją badano na poziomie pojedynczej komórki przy użyciu opisanej techniki, takiej jak przejściowe oddziaływania pęcherzyków tandemowych z powstawaniem dżetu, wizualizacja wynikowego pola przepływu i obliczanie prędkości strumienia. Kierunkowy przepływ strumieniowy wokół pęcherzyka tandemowego wynosi około dziesięciu metrów na sekundę, ma szerokość około dziesięciu mikronów, a zatem jest w stanie wytworzyć impulsywny i zlokalizowany czysty stres i gradient naprężeń na pobliskich komórkach docelowych. Badano również deformację błony komórkowej wywołaną pęcherzykami tandemu.

Deformacja i regeneracja błony są podkreślone przez przemieszczenie funkcjonalizowanych kulek przymocowanych do przedniej krawędzi błony komórkowej. Na podstawie współrzędnych triady sąsiadujących ze sobą koralików obliczono lokalne odkształcenie obszarowe. Ten schemat przedstawia maksymalną zmianę obszaru w różnych miejscach na powierzchni komórki.

Krawędź natarcia jest przede wszystkim rozciągnięta, podczas gdy krawędź spływu lub boczne boki komórki są ściskane, co wskazuje na niejednorodność i deformację komórki spowodowaną przepływem natryskowym wywołanym przez tandem pęcherzykowy. Czasowa zmienność odkształcenia obszaru na krawędzi natarcia komórki składa się z kilku gwałtownych oscylacji, po których następuje duże i długotrwałe rozciąganie przez około 100 mikrosekund, a następnie stopniowe odzyskiwanie w skali czasowej kilku milisekund. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić kontrolowaną interakcję pęcherzyka-bąbelek, aby zbadać bioefekty pojedynczych komórek o kontrolowanym kształcie i lokalizacji na podstawie wzoru powierzchniowego.

Po tej procedurze można dalej wykonywać inne środki, takie jak przerzedzenie cytoszkieletu i obrazowanie małżeńskie, w celu zbadania przegrupowania cytoszkieletu komórkowego podczas leczenia pęcherzykami tandemowymi. Po opracowaniu, technika ta utoruje drogę naukowcom zajmującym się ultradźwiękami subpretycznymi do zbadania efektów biologicznych wywołanych kapcją na poziomie pojedynczej komórki. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o utrzymaniu dobrej konfluencji komórek i warunków powodzenia podczas tworzenia wzoru komórkowego.

Nie zapominaj, że praca z chemikaliami i laserami w pomieszczeniach czystych może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawic i gogli laserowych.