Technika mikroprzepływowa do badania odkształcalności komórek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie zdolności do deformacji różnych typów komórek przy użyciu prostego testu opartego na mikrofluidyce. Osiąga się to poprzez wytworzenie urządzenia mikroprzepływowego z polidimetylossukanu lub PDMS do sondowania skali czasowej przejścia komórki przez sekwencję skali mikronowej Zwężenia przepływu napędzanego ciśnieniem są następnie wykorzystywane do kierowania komórkami przez ich kanały mikroprzepływowe, co umożliwia badanie deformacji i zależnej od czasu relaksacji poszczególnych komórek. Następnie uruchamiany jest program do automatycznej analizy obrazu w celu przetworzenia filmów i uzyskania histogramu danych dotyczących czasu przejścia.

Wyniki pokazują, że różne typy komórek wykazują różnice w zdolności do deformacji komórek w oparciu o czas ich przejścia przez serię zwężeń. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak mikroskopia sił atomowych lub aspiracja mikropipetami, jest to, że urządzenia mikroprzepływowe mogą z powodzeniem pracować z dużą przepustowością. Podczas gdy inne urządzenia mikroprzepływowe mogą być również używane do oznaczania deformowalności komórek.

Projektujemy nasze urządzenie w taki sposób, aby komórki przechodziły przez sekwencyjne zwężenia, geometrię powszechną w kontekstach fizjologicznych, takich jak łożysko kapilarne płuc. Aby rozpocząć, zaprojektuj urządzenie mikroprzepływowe, wybierając szerokość kanałów matrycy zwężonej na około 30 do 50% średniej średnicy komórki, a wysokość kanału na co najmniej 50% średnicy komórki. Dołącz filtr w portach wejściowych, aby usunąć zanieczyszczenia i zdezagregować klastry komórek.

Przed przystąpieniem do eksperymentu należy wykonać urządzenie wzorcowe przy użyciu standardowych technik mikroobróbki litograficznej. Sprawdź wysokość elementów szyku za pomocą profilometru. Następnie napraw źródło powietrza dla przepływu napędzanego ciśnieniem za pomocą zbiornika sprężonego powietrza oraz sekwencji regulatorów powietrza i armatury.

Najpierw ustaw zbiornik powietrza doprowadzającego powietrze i regulator ręczny. Następnie ustaw elektronicznie sterowany regulator ciśnienia zgodnie z regulatorem ręcznym. Użyj prostego kodu napisanego w LabVIEW, aby wprowadzić żądane ciśnienie.

Przetwornica elektropneumatyczna wykorzystuje wewnętrzną pętlę sprzężenia zwrotnego do regulacji ciśnienia wylotowego zaworu w celu dopasowania do określonego ciśnienia w urządzeniu mikroprzepływowym. Ustawić komorę ciśnieniową, aby napędzać przepływ zawiesiny komórek, montując komorę zawieszenia komórek ze standardowej rurki cytometru przepływowego i obrabianej maszynowo nasadki, która tworzy szczelne uszczelnienie na rówce. Nasadka komory ciśnieniowej zawiera dwa otwory, wlot, który łączy się ze zbiornikiem sprężonego powietrza oraz wylot, przez który komórki przepływają z komory ciśnieniowej do urządzenia.

Następnie ustaw odwrócony mikroskop wyposażony w kamerę, która ma szybkość akwizycji co najmniej 100 klatek na sekundę. Aby uchwycić obrazy komórek przepływających przez matrycę zwężoną, należy przygotować podstawowy roztwór środka powierzchniowo czynnego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS, ponieważ dodanie niewielkiej ilości środka powierzchniowo czynnego do roztworu pożywki komórkowej pomoże zminimalizować przyleganie komórek do ścian PDMS. Aby wytworzyć blok PDMS z kanałami mikroprzepływowymi, dodaj jeden gram utwardzacza do 10 gramów bazy PDMS i dokładnie wymieszaj.

Wlej mieszaninę na urządzenie. Mistrz Degas w słoiku dzwonowym z zastosowaną próżnią, aż uwięzione bąbelki znikną lub na około 10 do 20 minut. Po tym czasie na interfejsie AIR PDMS mogą nadal pojawiać się bąbelki, co jest normalne.

Zazwyczaj rozpraszają się one podczas pieczenia. Następnie piecz urządzenie Degas w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez cztery godziny po ostygnięciu urządzenia. Wyjmij urządzenia mikroprzepływowe z formy głównej.

Zacznij od delikatnego podniesienia jednego rogu urządzenia. Powolne i delikatne peelingowanie w przeciwieństwie do podnoszenia Blok PD DMS skierowany prosto do góry zmniejsza obciążenie zarówno PDMS, jak i urządzenia nadrzędnego Wytnij poszczególne urządzenia mikroprzepływowe z bloku PDMS za pomocą żyletki i wyjmij urządzenie z urządzenia głównego Przebij otwory w urządzeniu PDMS, aby utworzyć porty połączeniowe zapewniające dostęp między rurkami a mikrokanałami. Wykonaj otwory od strony kanału do zewnętrznej strony urządzenia za pomocą stempla do biopsji.

Opłucz urządzenie PDMS izopropanolem, aby usunąć kurz i osadzać kawałki PDMS. Upewnij się, że wybite otwory są wolne od zanieczyszczeń, kierując przez nie stały strumień czystego izopropanolu z butelki do wyciskania. Wysuszyć suszarką z przefiltrowanym powietrzem.

Wyczyść szklane podłoże, spłukując je metanolem. Następnie wysusz suszarką przefiltrowanym powietrzem i umieść na płycie grzejnej o temperaturze 200 stopni Celsjusza na pięć do 10 minut, aby upewnić się, że szkło jest całkowicie czyste i suche przed obróbką plazmową. Zgodnie z opisem w protokole tekstowym należy sprawdzić urządzenie mikroprzepływowe pod mikroskopem.

Upewnij się, że kanały nie są zapadnięte ani uszkodzone oraz że zarówno otwory wlotowe, jak i wylotowe łączą się bezpośrednio z kanałami urządzenia za pomocą obiektywu o niskiej mocy. Umieść zawiesinę komórek w probówce cytometru przepływowego i podłącz do nasadki ciśnieniowej przed podłączeniem rurki do urządzenia mikroprzepływowego, dostosuj ciśnienie do około 14 do 21 kilopaskali i spłukuj, aż zawiesina komórek wyłoni się z końcówki rurki. Następnie umieść urządzenie na płaskiej powierzchni, aby włożyć rurkę do wlotu urządzenia.

Ponieważ szkiełko pokrywy przyklejone do spodu urządzenia PDMS jest kruche. Włóż końcówkę rurki zawierającej zawiesinę komórek do wlotu urządzenia. Następnie włóż kawałek rurki do portu wyjściowego i poprowadź go do pustej rurki do zbierania odpadów, takiej jak pusta rurka Falcon przyklejona taśmą z boku stolika mikroskopu.

Delikatnie zwiększ ciśnienie do około 28 kilopaskali lub do momentu, gdy komórki przepłyną przez kanały. Ustaw urządzenie tak, aby wiele kanałów znajdowało się w polu view i były prostopadłe do dołu ekranu. Aby rozpocząć analizę danych, otwórz plik m skryptu głównego i uruchom program.

Wybierz pierwszy film wideo do analizy w wyświetlonym oknie Eksploratora Windows. Określ liczbę klatek na sekundę dla wybranego filmu i naciśnij enter. Pojawi się rysunek, który prosi użytkownika o wybranie prostokątnego okna przycinania.

W przypadku pierwszego filmu wybierz okno, które obejmuje wszystkie kanały od lewej do prawej i przecina kanały znajdujące się tuż nad pierwszą żarówką z zestawu kanałów. U góry i u dołu wybierz obszary zwężenia z przyciętego obrazu. Algorytm wyświetla segmentację komórek dla pierwszych 50 klatek każdego filmu.

Uważnie monitoruj obraz w lewym górnym rogu, aby określić, czy algorytm dokładnie lokalizuje komórki. Obraz jest nakładany na źródłowy obraz wideo. Aby zademonstrować lokalizację zidentyfikowanych komórek, wybierz następny film do przetworzenia w oknie Eksploratora Windows.

Algorytm się powtórzy. Dla każdego wybranego filmu wybierz Anuluj. Po dodaniu wszystkich żądanych filmów za pomocą okna Eksploratora Windows, aby poinstruować funkcję, że lista filmów jest kompletna, reprezentatywne wyniki dla czasu tranzytu komórek HL 60 i neutrofili typu HL 60 pokazują skalę czasu, w którym pojedyncza komórka przechodzi przez serię tranzytów zwężeń.

Czas jest mierzony dla populacji pojedynczych komórek przy każdym zwężeniu o siedem mikrometrów w serii siedmiu zwężeń. Przy ciśnieniu 28 kilopaskali HL 60 komórek tymczasowo zamyka pierwsze zwężenie na medianę czasu 9,3 milisekundy przed upakowaniem przez kolejne zwężenia. Natomiast komórki neutrofilowe typu HL 60 zamykają pierwsze zwężenie tylko na 4,3 milisekundy przed pakowaniem.

Raz przez pierwsze zwężenie komórki przechodzą szybciej przez pozostałe zwężenia od dwóch do siedmiu, z medianą czasu przejścia wynoszącą 4,0 milisekundy dla komórek HL 60 i 3,3 milisekundy dla komórek typu neutrofilowego. Porównując czas pasażu między populacjami komórek, można ujawnić różnice w informowalności komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć zdolność do odkształcania różnych typów komórek za pomocą prostego testu mikroprzepływowego.

W tym przypadku przepływ sterowany ciśnieniem jest wykorzystywany do kierowania komórkami przez kanały mikroprzepływowe, co umożliwia deformację i relaksację poszczególnych komórek.