Technika mikroprzepływowa do badania odkształcalności komórek

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zbadanie zdolności do deformacji różnych typów komórek przy użyciu prostego testu opartego na mikrofluidyce. Osiąga się to poprzez wykonanie mikrofluidycznego urządzenia z polidimetylosiloksanu (PDMS), aby zbadać czas przejścia komórek przez sekwencję zwężeń w skali mikronowej. Następnie wykorzystuje się przepływ wymuszony ciśnieniem do przesuwania komórek przez kanały mikrofluidyczne, co umożliwia analizę deformacji i zależnej od czasu relaksacji poszczególnych komórek. W dalszej kolejności uruchamiany jest zautomatyzowany program analizy obrazu w celu przetworzenia filmów i uzyskania histogramu danych dotyczących czasu przejścia.

Wyniki wskazują, że różne typy komórek wykazują różnice w podatności na odkształcanie w zależności od czasu ich przejścia przez serię zwężeń. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia sił atomowych czy aspiracja mikropipetą, jest możliwość skutecznego działania urządzeń mikroprzepływowych z wysoką wydajnością. Inne urządzenia mikroprzepływowe mogą być również wykorzystywane do badania podatności komórek na odkształcanie.

Projektujemy nasze urządzenie w taki sposób, aby komórki przechodziły przez sekwencyjne zwężenia – jest to geometria powszechnie występująca w kontekstach fizjologicznych, takich jak łożysko kapilar płucnych. W celu rozpoczęcia, zaprojektuj urządzenie mikroprzepływowe, wybierając szerokość kanałów macierzy zwężeń w przedziale od około 30 do 50% średniej średnicy komórki, natomiast wysokość kanału powinna wynosić co najmniej 50% średnicy komórki. W portach wlotowych zamontuj filtr, aby usunąć zanieczyszczenia i rozbić agregaty komórkowe.

Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wykonać matrycę urządzenia, stosując standardowe techniki litograficznej mikrobobróbki. Wysokość elementów wzoru należy zweryfikować za pomocą profilometru. Następnie należy przygotować źródło powietrza do przepływu sterowanego ciśnieniem, wykorzystując zbiornik ze sprężonym powietrzem oraz układ regulatorów i złączy powietrznych.

W pierwszej kolejności należy przygotować zbiornik z zasilaniem powietrznym oraz regulator ręczny. Następnie należy zainstalować elektroniczny regulator ciśnienia szeregowo z regulatorem ręcznym. Do wprowadzenia pożądanego ciśnienia należy użyć prostego kodu napisanego w środowisku LabVIEW.

Konwerter elektropneumatyczny wykorzystuje wewnętrzną pętlę sprzężenia zwrotnego do regulacji ciśnienia na wylocie zaworu, aby dopasować je do określonego ciśnienia w urządzeniu mikroprzepływowym. Należy przygotować komorę ciśnieniową do wymuszenia przepływu zawiesiny komórkowej poprzez złożenie komory z zawiesiny komórkowej z zestawu obejmującego standardową probówkę do cytometrii przepływowej oraz obrobioną zaślepkę, która zapewnia szczelne zamknięcie probówki. Zaślepka komory ciśnieniowej posiada dwa otwory: wlot łączący się ze zbiornikiem sprężonego powietrza oraz wylot, przez który komórki przepływają z komory ciśnieniowej do urządzenia.

Następnie należy przygotować odwrócony mikroskop wyposażony w kamerę o częstotliwości akwizycji wynoszącej co najmniej 100 klatek na sekundę. Aby zarejestrować obrazy komórek przepływających przez układ zwężeń, należy przygotować roztwór zapasu surfaktantu w soli fosforanowej lub PBS, ponieważ dodanie niewielkiej ilości surfaktantu do roztworu pożywki komórkowej pomoże zminimalizować adhezję komórek do ścianek PDMS. Aby wytworzyć blok PDMS z kanałami mikroprzepływowymi, należy dodać jeden gram utwardzacza do 10 gramów bazy PDMS i dokładnie wymieszać.

Wlej mieszaninę na urządzenie. Odgazuj całość w dzwonie próżniowym przy zastosowaniu próżni do momentu zniknięcia uwięzionych pęcherzyków powietrza, lub przez około 10 do 20 minut. Po tym czasie na styku fazy powietrza i PDMS mogą nadal występować pęcherzyki, co jest zjawiskiem normalnym.

Zazwyczaj znikną one podczas wypiekania. Następnie wygrzej urządzenie do odgazowania w temperaturze 65 °C przez cztery godziny po ostygnięciu urządzenia. Wyjmij urządzenia mikroprzepływowe z formy matki.

Zacznij od delikatnego odniesienia jednego narożnika urządzenia. Powolne i ostrożne odklejanie, w przeciwieństwie do gwałtownego podniesienia bloku PDMS pionowo w górę, zmniejsza naprężenia zarówno w PDMS, jak i w matrycy. Wytnij poszczególne urządzenia mikroprzepływowe z bloku PDMS za pomocą żyletki i oddziel urządzenie od matrycy. Wywierć otwory w urządzeniu z PDMS, aby stworzyć porty połączeniowe umożliwiające dostęp między przewodami a mikrokanałami. Wykonaj otwory od strony kanału aż do zewnętrznej strony urządzenia, używając wycinaka do biopsji.

Przepłucz urządzenie z PDMS izopropanolem, aby usunąć kurz i drobne fragmenty PDMS. Upewnij się, że wycięte otwory są wolne od zanieczyszczeń, kierując jednostajny strumień czystego izopropanolu z butelki z dozownikiem przez otwory. Wysusz zdmuchując powietrzem filtrowanym.

Oczyść szklany podłoże, płucząc je metanolem. Następnie osusz je za pomocą przefiltrowanego powietrza i umieść na płycie grzejnej o temperaturze 200 °C na pięć do 10 minut, aby upewnić się, że szkło jest całkowicie czyste i suche przed obróbką plazmową. Zgodnie z opisem w protokole tekstowym, sprawdź urządzenie mikroprzepływowe pod mikroskopem.

Używając obiektywu o niskim powiększeniu, należy upewnić się, że kanały nie są zapadnięte ani przerwane oraz że otwory wlotowe i wylotowe łączą się bezpośrednio z kanałami urządzenia. Umieść zawiesinę komórek w probówce do cytometrii przepływowej i podłącz do nakrętki ciśnieniowej przed podłączeniem przewodów do urządzenia mikroprzepływowego, ustaw ciśnienie na około 14 do 21 kilopascals i przepłukuj, aż zawiesina komórek pojawi się na końcu przewodu. Następnie umieść urządzenie na płaskiej powierzchni, aby wprowadzić przewód do wlotu urządzenia.

Ponieważ szklana lamella przytwierdzona do dolnej strony urządzenia z PDMS jest krucha, należy zachować ostrożność. Wprowadź końcówkę rurki zawierającej zawiesinę komórek do wlotu urządzenia. Następnie wprowadź fragment rurki do portu wylotowego i poprowadź go do pustej probówki służącej do zbierania odpadów, np. do pustej probówki Falcon przymocowanej taśmą do boku stolika mikroskopu.

Stopniowo zwiększaj ciśnienie do około 28 kilopascals lub do momentu, aż komórki zaczną przepływać przez kanały. Ustaw urządzenie tak, aby w polu widzenia znajdowało się kilka kanałów, a one same były prostopadłe do dolnej krawędzi ekranu. Aby rozpocząć analizę danych, otwórz główny plik skryptu m i uruchom program.

W wyświetlonym oknie Eksploratora Windows wybierz pierwsze wideo do analizy. Określ liczbę klatek na sekundę dla wybranego filmu i naciśnij enter. Pojawi się obraz z prośbą o zaznaczenie prostokątnego obszaru kadrowania.

W przypadku pierwszego filmu wybierz okno obejmujące wszystkie kanały od lewej do prawej, które przecina kanały tuż nad pierwszą wypustką macierzy kanałów. Na górze i na dole wybierz obszary zwężenia z przyciętego obrazu. Algorytm wyświetla segmentację komórek dla pierwszych 50 klatek każdego filmu.

Uważnie monitoruj obraz w lewym górnym rogu, aby ocenić, czy algorytm prawidłowo lokalizuje komórki. Obraz przetworzony jest nałożony na wideo źródłowe. Aby zademonstrować lokalizację zidentyfikowanych komórek, wybierz z okna Eksploratora Windows następny film do przetworzenia.

Algorytm będzie się powtarzać. Dla każdego wybranego filmu wybierz anuluj. Po dodaniu wszystkich pożądanych filmów za pomocą okna Eksploratora Windows, aby poinformować funkcję, że lista filmów jest kompletna, reprezentatywne wyniki czasu przejścia dla komórek HL 60 oraz neutrofili typu HL 60 przedstawiają skalę czasową przejścia pojedynczej komórki przez serię zwężeń.

Czas pomiaru dla populacji pojedynczych komórek wykonuje się przy każdym z siedmiu zwężeń o szerokości 7 µm w serii siedmiu zwężeń. Przy ciśnieniu napędowym 28 kPa komórki HL 60 tymczasowo zamykają pierwsze zwężenie przez medianowy czas 9,3 ms przed przejściem przez kolejne zwężenia. W przeciwieństwie do nich, komórki HL 60 typu neutrofilowego zamykają pierwsze zwężenie jedynie przez 4,3 ms przed przejściem.

Po przejściu przez pierwsze zwężenie komórki szybciej przemieszczają się przez pozostałe zwężenia od drugiego do siódmego, przy czym medianowy czas przejścia wynosi 4,0 milisekund dla komórek HL 60 oraz 3,3 milisekund dla komórek typu neutrofilnego. Poprzez porównanie czasu przejścia między populacjami komórek można ujawnić różnice w ich odkształcalności. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak mierzyć odkształcalność różnych typów komórek przy użyciu prostego testu mikroprzepływowego.

W niniejszej metodzie wykorzystano przepływ wymuszony ciśnieniem do przesuwania komórek przez kanały mikrofluidyczne, co umożliwia analizę deformacji i relaksacji poszczególnych komórek.