Name: Technika mikroprzepływowa do badania odkształcalności komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj technikę mikroprzepływową do badania odkształcalności komórek przy użyciu urządzeń PDMS. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustową analizę czasu tranzytu przez mikroskopijne zwężenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Lloydowi Ungowi za konstruktywny wkład we wczesne wersje tej techniki, Dr. Jeremy'emu Agresti za wskazówki dotyczące projektowania nasadki ciśnieniowej oraz Dr. Dongping Qi za pomoc w produkcji nasadki ciśnieniowej. Jesteśmy wdzięczni laboratoriom M. Teitella i P. Gunaratne za dostarczenie różnorodnych próbek komórek do testów. Jesteśmy wdzięczni Narodowej Fundacji Nauki (CAREER Award DBI-1254185), UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center oraz UCLA Clinical and Translational Science Institute za wsparcie tej pracy.

1. Konstrukcja urządzenia mikroprzepływowego
UWAGA: Konstrukcja urządzenia ma cztery podstawowe obszary funkcjonalne: port wejściowy, filtr komórkowy, tablica zwężeń i port wyjściowy (Rysunek 1). Ogólny projekt można zastosować do szerokiej gamy typów komórek, z niewielkimi korektami wymiarów. Poniżej znajduje się kilka podstawowych zaleceń projektowych wraz z parametrami urządzenia, które są skuteczne w przypadku wyboru zarówno komórek pierwotnych, jak i unieśmiertelnionych.
<ol>
	<li>Wybierz szerokość kanałów matrycy zwężonej (Rysunek 1B) tak, aby wynosiła około 30-50% średniej średnicy komórki; ten stosunek zwężenia do wielkości komórki powoduje znaczną deformację komórki, ale minimalne zatkanie. Biorąc pod uwagę typ ogniwa, który nie był wcześniej testowany, rozsądnie jest zaprojektować zakres szerokości zwężenia od ~30-50% średnicy ogniwa, aby znaleźć optymalną szerokość. Podobnie jak w przypadku wielu typów urządzeń mikroprzepływowych, ponad 120 form wzorcowych urządzeń można wzorować na jednej 4-calowej płytce krzemowej, co umożliwia wytwarzanie szeregu różnych projektów urządzeń w jednym procesie produkcyjnym.</li>
	<li>Wybierz wysokość kanału tak, aby wynosiła co najmniej 50% średnicy komórki; gwarantuje to, że komórka jest ograniczona w 2 wymiarach. Aby zapobiec zapadaniu się kanału podczas łączenia, upewnij się, że proporcje kanału nie są mniejsze niż 1:10 (wysokość:szerokość) w całym urządzeniu. W przypadku kanałów, które muszą przekraczać ten współczynnik proporcji, dodaj słupki wsparcia, aby zapobiec zawaleniu. Umieść słupki wsporcze w odległości co najmniej dwukrotnie większej niż średnica komórki, aby nie utrudniać przepływu komórek.</li>
	<li>Umieść filtr w portach wejściowych, aby usunąć zanieczyszczenia i zdezagregować klastry komórek (Rysunek 1B). Dostosuj rozmiar i odstępy między słupkami filtra tak, aby odległość między słupkami była w przybliżeniu równa średnicy jednej komórki. 
	UWAGA: Dolna granica rozmiaru elementu jest określana przez rozdzielczość, w jakiej drukowana jest maska litograficzna. Upewnij się, że wszystkie funkcje mieszczą się w limicie rozdzielczości określonym przez dostawcę maski.</li>
</ol>
2. Zaopatrzenie i przygotowanie
UWAGA: Przed rozpoczęciem jakiegokolwiek eksperymentu, należy przygotować następujące elementy. Schemat całej konfiguracji znajduje się na rysunku 1.
<ol>
	<li>Wykonać wzorzec urządzenia przy użyciu standardowych technik mikroobróbki litograficznej14,15. Sprawdź wysokość elementów wzoru za pomocą profilometru. 
	UWAGA: Podczas gdy wzorce można łatwo wytworzyć w pomieszczeniu czystym, niektóre laboratoria opracowały niedrogie metody litografii do stosowania w półczystym środowisku16,17.</li>
	<li>Przygotuj źródło powietrza do przepływu napędzanego ciśnieniem, używając zbiornika sprężonego powietrza oraz sekwencji regulatorów powietrza i armatury (Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Ustaw zbiornik powietrza doprowadzającego powietrze i regulator ręczny. 
		UWAGA: Kompozycja 5% CO2 w powietrzu utrzymuje podobne środowisko jak typowy inkubator do hodowli komórkowych, ale można również stosować inne mieszaniny gazów.</li>
		<li>Ustaw elektronicznie sterowany regulator ciśnienia w jednej linii z regulatorem ręcznym. Użyj przetwornicy elektropneumatycznej, aby regulować i utrzymywać stabilny spadek ciśnienia na kanałach, przy wahaniach ciśnienia mniejszych niż 2 kPa. Użyj prostego kodu napisanego w LabVIEW (Informacje dodatkowe), aby wprowadzić żądane ciśnienie. 
		UWAGA: Przekształtnik elektropneumatyczny wykorzystuje wewnętrzną pętlę sprzężenia zwrotnego do regulacji ciśnienia wylotowego zaworu w celu dopasowania do określonego ciśnienia w urządzeniu mikroprzepływowym.</li>
		<li>Ustawić komorę ciśnieniową, aby napędzać przepływ zawiesiny komórek. Zmontuj komorę zawieszenia komórek ze standardowej rurki cytometru przepływowego i obrabianej maszynowo nasadki, która tworzy szczelne uszczelnienie na probówce. 
		UWAGA: Nasadka komory ciśnieniowej zawiera dwa otwory: wlot, który łączy się ze zbiornikiem sprężonego powietrza, oraz wylot, przez który komórki przepływają z komory ciśnieniowej do urządzenia (rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw odwrócony mikroskop wyposażony w kamerę, która ma szybkość akwizycji co najmniej 100 klatek na sekundę, aby uchwycić obrazy komórek przepływających przez układ zwężeń. Połącz kamerę z kartą przechwytującą wideo i komputerem.</li>
	<li>Przygotuj podstawowy roztwór środka powierzchniowo czynnego o stężeniu 10% w/w Pluronic F-127 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), ponieważ dodanie niewielkiej ilości F127 do roztworu pożywki komórkowej pomoże zminimalizować przyleganie komórek do ścian PDMS. Aby przygotować roztwór F127, należy delikatnie podgrzać i podgrzać w temperaturze 37 °C, aby rozpuścić F127. Przed użyciem przepuścić roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotuj roztwór środka powierzchniowo czynnego z wyprzedzeniem, ponieważ wirowanie i filtrowanie wygeneruje pęcherzyki, które utrzymają się przez ponad 24 godziny.</li>
</ol>
3. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych
<ol>
	<li>Wyprodukuj blok PDMS z kanałami mikroprzepływowymi.
	<ol>
		<li>Dokładnie wymieszać PDMS w stosunku 1:10 (w/w) utwardzacza do bazy.</li>
		<li>Wlej mieszaninę na mistrza urządzenia (krok 2.1). Odgazuj w słoiku dzwonowym z zastosowaną próżnią, aż uwięzione pęcherzyki znikną lub przez około 10-20 min. 
		UWAGA: Po tym czasie na granicy faz powietrze-PDMS mogą nadal pojawiać się pęcherzyki, co jest normalne; Zazwyczaj rozpraszają się one podczas pieczenia. Najważniejsze jest, aby upewnić się, że w pobliżu kanałów nie pozostały żadne pęcherzyki.</li>
		<li>Piecz odgazowane urządzenie w temperaturze 65 °C przez 4 godziny. Aby zapobiec zapadaniu się kanałów, upiecz urządzenie przez noc, aby jeszcze bardziej usieciować PDMS w celu uzyskania urządzenia o wyższym module sprężystości, które jest bardziej odporne na zapadanie się kanału. Należy jednak pamiętać, że przedłużone pieczenie również powoduje kruchość PDMS i może prowadzić do pękania podczas dziurkowania otworów (krok 3.3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij urządzenia mikroprzepływowe z formy głównej. Wytnij poszczególne urządzenia mikroprzepływowe z bloku PDMS za pomocą żyletki i wyjmij urządzenie z urządzenia głównego. Zacznij od delikatnego podniesienia jednego rogu urządzenia; powolne i delikatne peelingowanie, w przeciwieństwie do podnoszenia bloku PDMS prosto do góry, zmniejsza stres zarówno u PDMS, jak i mastera.</li>
	<li>Przebij otwory w urządzeniu PDMS, aby utworzyć porty połączeniowe umożliwiające dostęp między rurkami a mikrokanałami. Otwory należy wykonać za pomocą dziurkacza do biopsji i przebić od strony kanału do zewnętrznej strony urządzenia. 
	UWAGA: Dziurkacz do biopsji o średnicy otworu 0,75 mm tworzy otwory, które idealnie łączą się z rurkami z polieteroeteroketonu (PEEK) (średnica zewnętrzna = 1/32" lub 0,79 mm) lub rurkami polietylenowymi (PE-20, średnica zewnętrzna = 0,043" lub 1,09 mm). Użyj lampy pierścieniowej, aby pomóc w wizualizacji otworów w urządzeniach z płytkimi kanałami18. Upewnij się, że cios biopsyjny jest ostry; Po wielokrotnym użyciu krawędź tnąca stępia się, a stempel do biopsji należy wyrzucić i wymienić.</li>
	<li>Wypłucz urządzenie PDMS izopropanolem (klasa HPLC), aby usunąć kurz i osadzone kawałki PDMS. Upewnij się, że wybite otwory są wolne od zanieczyszczeń, kierując przez nie stały strumień czystego izopropanolu z butelki do wyciskania. Wysuszyć suszarką z przefiltrowanym powietrzem. Po oczyszczeniu umieść bloki PDMS kanałami skierowanymi do góry na czystej szalce Petriego, aby utrzymać urządzenie w czystości. W razie potrzeby przechowuj urządzenia w tej formie do czasu sklejenia.</li>
	<li>Oczyść szklane podłoże przez spłukanie metanolem (klasa HPLC), wysusz przefiltrowanym powietrzem i umieść na płycie grzejnej o temperaturze 200 °C na 5-10 minut, aby upewnić się, że szkło jest całkowicie czyste i suche przed obróbką plazmową. 
	UWAGA: Szklane podłoże tworzy dno każdego kanału. Zazwyczaj wystarcza szklane szkiełko, ponieważ obiektyw 10X lub 20X jest idealny do obrazowania wielu kanałów równolegle. Aby uzyskać obrazowanie o wyższej rozdzielczości, przymocuj urządzenie do szkiełka nakrywkowego (grubość #1.5).</li>
	<li>Przymocuj urządzenie PDMS do szklanego podłoża.
	<ol>
		<li>Plazma tlenowa traktuje stronę kanału bloku PDMS i 1 stronę szkiełka podstawowego. 
		UWAGA: W przypadku ręcznego urządzenia wyładowczego należy stosować czas zabiegu wynoszący 1 minutę, ale zoptymalizować czas leczenia dla każdego aparatu plazmy tlenowej.</li>
		<li>Natychmiast po zabiegu umieścić stronę kanałową PDMS na wierzchu leczonej strony szkła.</li>
		<li>Trzymaj razem z lekkim naciskiem przez ~10 sekund, aby ułatwić wiązanie. Piecz całe urządzenie w podwyższonej temperaturze (60-80 °C) przez co najmniej 15 minut, aby poprawić siłę wiązania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Deformacja komórek przez zwężone kanały
<ol>
	<li>Sprawdź urządzenie mikroprzepływowe pod mikroskopem. Upewnij się, że kanały nie są zagięte ani uszkodzone oraz że zarówno otwory wlotowe, jak i wylotowe łączą się bezpośrednio z kanałami urządzenia za pomocą obiektywu o małej mocy (10X). Oznacz wadliwe urządzenia, nacinając powierzchnię PDMS żyletką i nie używaj ich do eksperymentów.</li>
	<li>Przygotować próbki kultur komórkowych do oznaczenia. Hodowla komórek w standardowych warunkach.
	<ol>
		<li>Na przykład hodowla komórek HL-60 w pożywce RPMI-1640 uzupełniona 1% roztworem penicyliny-streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej w 5% inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>W przypadku komórek przylegających należy je zebrać przez trypsynizację i ponownie zawiesić w świeżej pożywce wzrostowej. Użyj standardowego protokołu trypsynizacji; Na przykład, dodać ~0,5 ml trypsyny do kolby z powierzchnią hodowli 25cm2 i ponownie zamieszać w ~30 ml świeżej pożywki. Różnicować komórki HL-60 w komórki typu neutrofilowego za pomocą all-trans retinoicznej (ATRA) w końcowym stężeniu 5 μM na 1 x 105 komórek/ml, jak opisano wcześniej19,20.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty, ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki do odpowiedniej gęstości końcowej w świeżej pożywce hodowlanej z 0,1% v/v F-127.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz komórki za pomocą licznika Coultera, hemacytometru lub cytometru przepływowego. Dostosować zawiesinę komórek do gęstości 1 x 106 do 5 x 106 komórek/ml. Po ustawieniu gęstości zawiesiny uzupełnić około 0,1% v/v F-127. 
	UWAGA: Gęstość komórek i stężenie środków powierzchniowo czynnych mogą wymagać modyfikacji w zależności od poszczególnych systemów komórkowych; Tabela 1 zawiera zapis poprzednio stosowanych stężeń komórek i F-127 dla różnych typów komórek.</li>
	<li>Umieść zawiesinę komórek w probówce cytometru przepływowego i podłącz do nasadki ciśnieniowej. Przed podłączeniem rurki do urządzenia mikroprzepływowego należy wyregulować ciśnienie na około 14-21 kPa i spłukiwać, aż zawiesina komórek wydostanie się z końcówki rurki. Pomoże to zminimalizować pęcherzyki powietrza w wężyku i urządzeniu.</li>
	<li>Włóż końcówkę rurki zawierającej zawiesinę komórek do wlotu urządzenia. Jeśli urządzenie jest połączone ze szkiełkiem nakrywkowym, przed podłączeniem rurki umieść urządzenie na płaskiej, twardej powierzchni, takiej jak stolik mikroskopu; Szkiełko nakrywkowe jest delikatne i w przeciwnym razie może pęknąć.</li>
	<li>Włóż kawałek rurki do portu wyjściowego i poprowadź go do pustej rurki do zbierania odpadów, takiej jak pusta rurka Falcon przyklejona taśmą z boku stolika mikroskopu. Aby zapewnić spójność ogólnej odporności płynnej urządzenia między eksperymentami, należy upewnić się, że rurki doprowadzające i wylotowe mają tę samą średnicę i w przybliżeniu tę samą długość dla każdego eksperymentu.</li>
	<li>Delikatnie zwiększ ciśnienie do około 28 kPa lub do momentu, gdy komórki przepłyną przez kanały. Ustaw urządzenie tak, aby wiele kanałów znajdowało się w polu view i były prostopadłe do dołu ekranu. Jeśli kamera jest ograniczona rozmiarem danych, uzyskaj wiele filmów, aby wygenerować wystarczającą liczbę niezależnych punktów danych. Dostosuj liczbę klatek na sekundę zgodnie z potrzebami dla żądanego wyjścia danych. Aby uchwycić zmiany w kształcie komórki, użyj obrazowania z dużą szybkością 300 klatek na sekundę (fps); Aby zmierzyć czas tranzytu komórek, użyj szybkości klatek około 100 kl./s.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz plik Master_script.m (Downloadable Supplemental File) i uruchom program.</li>
	<li>Wybierz pierwszy film wideo do analizy w wyświetlonym oknie Eksploratora Windows. Określ liczbę klatek na sekundę dla wybranego filmu i naciśnij enter. 
	UWAGA: Pojawi się rysunek, który poprosi użytkownika o wybranie prostokątnego okna przycinania dla pierwszego filmu.</li>
	<li>Wybierz okno, które obejmuje wszystkie kanały od lewej do prawej i przecina kanały tuż nad pierwszą żarówką z zestawu kanałów na górze i na dole (Rysunek 3).</li>
	<li>Wybierz obszary zwężenia z przyciętego obrazu. Zwróć szczególną uwagę, aby zachować stałą odległość pikseli między górną i dolną granicą okna dla każdego wybranego filmu. 
	UWAGA: Górna krawędź okna określa najwyższe zwężenie, a dolna krawędź okna określa najniższe zwężenie (Rysunek 4); Pośrednie zwężenia są przybliżane na podstawie tych danych wejściowych użytkownika. Następnie algorytm wyświetla segmentację komórek dla pierwszych 50 klatek każdego filmu (rysunek 5).</li>
	<li>Uważnie monitoruj obraz w lewym górnym rogu (Rysunek 5A), aby określić, czy algorytm dokładnie lokalizuje komórki; binaryzowany obraz jest nakładany na źródłowy obraz wideo, aby zademonstrować lokalizację zidentyfikowanych komórek. 
	UWAGA: Poszczególne okna (rysunki 5B-5D) służą do diagnozowania kodu i demonstrują klatki wideo po określonych operacjach przetwarzania obrazu.</li>
	<li>Wybierz następny film do przetworzenia w oknie Eksploratora Windows. 
	UWAGA: Algorytm powtórzy kroki 5.2-5.5 dla każdego wybranego filmu.</li>
	<li>Wybierz opcję Anuluj, gdy wszystkie żądane filmy zostaną dodane za pomocą okna Eksploratora Windows, aby poinstruować funkcję, że lista filmów jest kompletna. 
	UWAGA: Algorytm wykona pozostałe operacje bez ingerencji użytkownika. Zajmie to około 1-2 godzin, w zależności od liczby przetworzonych filmów i wydajności komputera. Po zakończeniu algorytm utworzy histogram danych o czasie przejścia i zapisze dane w katalogu jako plik MATLAB .mat i plik .xls programu Microsoft Excel.</li>
</ol>

<ol><li>Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+neutrophil+and+capillary+diameters+and+their+relation+to+neutrophil+sequestration+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung.</a> Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+cancer+metastasis%3A+the+%60seed+and+soil%E2%80%99+hypothesis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited.</a> Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).</li>
<li>Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+microfluidic+device+for+the+study+of+cell+migration+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis.</a> Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).</li>
<li>Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformability+study+of+breast+cancer+cells+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+microdevices%22%5BJournal%5D)">Deformability study of breast cancer cells using microfluidics.</a> Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).</li>
<li>Byun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+deformability+and+surface+friction+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Characterizing deformability and surface friction of cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).</li>
<li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+cell+mechanics+in+hematologic+diseases+with+microfluidic+biophysical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry.</a> Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+cell+types+using+a+microfluidic+device+for+mechanical+and+electrical+measurement+on+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3174(2011).</li>
<li>Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+biophysical+measurement+of+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput biophysical measurement of human red blood cells.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2560(2012).</li>
<li>Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+measurement+of+red+blood+cell+deformability+on+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13 (16), 3275(2013).</li>
<li>Hogg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+kinetics+and+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil kinetics and lung injury.</a> Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).</li>
<li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanics%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).</li>
<li>Yap, B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+remodeling+and+cellular+activation+during+deformation+of+neutrophils+into+narrow+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels.</a> Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).</li>
<li>Bow, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+deformability-based+flow+cytometer+with+application+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria.</a> Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).</li>
<li>Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+single+cells+using+flow+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Physical+Journal+Special+Topics%22%5BJournal%5D)">Probing single cells using flow in microfluidic devices.</a> The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).</li>
<li>Doll, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SU-8+force+sensing+pillar+arrays+for+biological+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements.</a> Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).</li>
<li>Huntington, M. D., Odom, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portable%2C+Benchtop+Photolithography+System+Based+on+a+Solid-State+Light+Source%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source.</a> Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).</li>
<li>Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinky-Dink+microfluidics%3A+rapid+generation+of+deep+and+rounded+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns.</a> Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).</li>
<li>Rowat, A. C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chips+%26+Tips%3A+see+where+to+punch+holes+easily+in+a+PDMS+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).</li>
<li>Meyer, P., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+Acid+Induced+Differentiation+and+Commitment+in+HL-60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells.</a> Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).</li>
<li>Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+Acid+Differentiation+of+HL-60+Cells+Promotes+Cytoskeletal+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization.</a> Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).</li>
<li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Microscopy+of+Nonadherent+Cells%3A+A+Comparison+of+Leukemia+Cell+Deformability+%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability .</a> Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).</li>
<li>Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+HL-60+cell+deformability+during+differentiation+induced+by+DMSO%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO.</a> Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).</li>
<li>Rowat, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Envelope+Composition+Determines+the+Ability+of+Neutrophil-type+Cells+to+Passage+through+Micron-scale+Constrictions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).</li>
<li>Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+exposure+increases+leukemia+cell+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness.</a> Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).</li>
<li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+surface+wettability+of+poly%28dimethyl%29+siloxane+%28PDMS%29+and+glass+under+oxgen-plasma+treatment+and+correlation+with+bond+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microelectromechanical+Systems%22%5BJournal%5D)">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li>
<li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+poly%28dimethylsiloxane%29+surface+modification+to+control+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+and+Interface+Analysis%22%5BJournal%5D)">Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion.</a> Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym miejscu przedstawiamy kompleksową procedurę eksperymentalną do analizy deformacji komórek przechodzących przez zwężone kanały mikroprzepływowe przy użyciu przepływu sterowanego ciśnieniem. Skrypt MATLAB umożliwia automatyczne przetwarzanie danych (Supplemental Material); Aktualizowana wersja kodu jest utrzymywana (<a href="http://www.ibp.ucla.edu/research/rowat" target="_blank">www.ibp.ucla.edu/research/rowat</a>). W szerszym ujęciu, przedstawione tu techniki można zaadaptować w wielu komórkowych testach mikroprzep...

Zmiany w kształcie komórki są krytyczne w wielu kontekstach biologicznych. Na przykład erytrocyty i leukocyty deformują się przez naczynia włosowate, które są mniejsze niż ich własna średnica1. W przypadku przerzutów komórki rakowe muszą deformować się przez wąskie szczeliny śródmiąższowe, a także kręte sieci naczyniowe i limfatyczne, aby wysiać w miejscach wtórnych2. Aby zbadać fizyczne zachowanie poszczególnych komórek, urządzenia mikroprzepływowe stanowią idealną platformę, którą można dostosować do badania szeregu zachowań komórek, w tym ich zdolności do migracji przez wąskie szczeliny3 i pasywnego odkształcania się przez zwężenia w skali mikronowej3-9. Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu (PDMS) są optycznie przezroczyste, co umożliwia wizualizację deformacji komórek za pomocą mikroskopii świetlnej i analizę przy użyciu podstawowych narzędzi do przetwarzania obrazu. Co więcej, można precyzyjnie zdefiniować tablice zwężeń, co umożliwia jednoczesną analizę wielu komórek z przepustowością przekraczającą wiele istniejących technik10,11.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół eksperymentalny do badania deformowalności komórek za pomocą mikroprzepływowego urządzenia PDMS 'Cell Deformer'. Urządzenie zostało zaprojektowane tak, aby komórki przechodziły przez sekwencyjne zwężenia; Ta geometria jest powszechna w kontekstach fizjologicznych, takich jak łożysko kapilarne płuc12. Aby ocenić odkształcalność komórki, czas tranzytu zapewnia wygodną metrykę, którą można łatwo zmierzyć jako czas potrzebny pojedynczej komórce na przejście przez pojedyncze zwężenie4,6. Aby utrzymać stały spadek ciśnienia w zwężonych kanałach podczas tranzytu komórek, stosujemy przepływ sterowany ciśnieniem. Nasz protokół zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące projektowania i produkcji urządzeń, obsługi urządzenia przez przepływ sterowany ciśnieniem, przygotowania i obrazowania komórek, a także przetwarzania obrazu w celu zmierzenia czasu odkształcenia komórek przez serię zwężeń. Jako pliki uzupełniające dołączamy zarówno projekty urządzeń, jak i kod przetwarzania danych wizyjnych. Jako reprezentatywną próbkę danych pokazujemy czas przejścia komórki przez serię zwężeń w funkcji liczby przekroczonych zwężeń. Analiza skali czasowej, w której komórki przechodzą przez wąskie zwężenia urządzenia mikroprzepływowego, może ujawnić różnice w odkształcalności różnych typów komórek4,5,13. Zademonstrowane tutaj urządzenie w unikalny sposób bada tranzyt komórek przez serię zwężeń w skali mikronowej; Taka konstrukcja emuluje krętą ścieżkę, którą komórki doświadczają w krążeniu, a także umożliwia badanie dodatkowych cech fizycznych komórek, takich jak czas relaksacji.

<table><tbody><tr><td>Pluronic F-127 Środek powierzchniowo czynny z kopolimeru blokowego&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>8409400</td><td>Wyprodukowany przez BASF, dostępny również za pośrednictwem</td></tr><tr><td>bazy i środka sieciującego</td><td>Sigma PDMS Essex Brownell</td><td>DC-184-1.1</td><td>Produkt powszechnie nazywany Sylgard 184 Elastomerowa</td></tr><tr><td>jednostka wyładowcza plazmy tlenowej</td><td>Enercon</td><td>Dyne-A-Mite 3D Treater</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0,75 mm)</td> <td>Ted Pella, Inc.</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td>Tulejka dokręcana palcowo, 1/32"Upchurch</td> <td>Scientific</td><td>UP-F-113</td><td></td></tr><tr><td>Złączka doszczelna III, 10-32</td><td>Rurka</td> polieteroeteroketonowa (PEEK) Upchurch Scientific <td>UP-F-300X</td><td></td></tr><tr><td>, średnica zewnętrzna = 1/32"lub 0,79 mm</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25M</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa (PE-20), 0,043" lub 1,09 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Regulator ciśnienia</td><td>Airgas lub rurka</td> poliuretanowa Praxair<td></td><td></td></tr><tr><td>, 5/32" OD</td><td>McMaster Carr</td><td>5648K284</td><td></td></tr><tr><td>Złączki wciskane</td><td>McMaster Carr</td><td>5111K91</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik elektropneumatyczny napięcia na ciśnienie (E / P)</td><td>Omega</td><td>IP413-020</td><td></td></tr><tr><td>16-bitowy, 250 kS/S, 80 wejść analogowych Wielofunkcyjny DAQ</td><td>National Instruments</td><td>NI PCI 6225-779295-01</td><td></td></tr><tr><td>Złącze analogowe Blok-zacisk śrubowy</td><td>National Instruments</td><td>SCB-68-776844-01</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do projektowania systemów LabView</td><td>Oprogramowanie National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc.</td>Kod <td>MATLAB R2012a</td><td>wymaga zestawu narzędzi do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>ekranowany</td><td>National Instruments</td><td>SHC68-68</td><td></td></tr></tbody></table>

technika mikroprzepływowa do badania odkształcalności komórek

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Tutaj szczegółowo opisujemy projekt, produkcję i użycie urządzenia mikroprzepływowego do oceny odkształcalności dużej liczby pojedynczych komórek w efektywny sposób. Zazwyczaj dane dla ~102 komórek można uzyskać w ciągu 1-godzinnego eksperymentu. Zautomatyzowany program do analizy obrazu umożliwia wydajną analizę danych obrazu po eksperymencie, umożliwiając zakończenie przetwarzania w ciągu kilku godzin. Geometria naszego urządzenia jest wyjątkowa, ponieważ komórki muszą odkształcać się poprzez serię zwężeń w skali mikronów, umożliwiając w ten sposób wstępną deformację i zależne od czasu rozluźnienie poszczególnych komórek. Wykazano przydatność tej metody do ludzkich komórek białaczki promielocytowej (HL-60). Kierując komórki do deformacji poprzez zwężenia w skali mikronów za pomocą przepływu sterowanego ciśnieniem, obserwujemy, że ludzkie komórki promielocytarne (HL-60) chwilowo zamykają pierwsze zwężenie na medianę czasu 9,3 ms, zanim szybciej przechodzą przez kolejne zwężenia z medianą czasu przejścia wynoszącą 4,0 ms na zwężenie. W przeciwieństwie do tego, komórki HL-60 traktowane kwasem all-trans retinowym (typu neutrofilowego) zamykają pierwsze zwężenie tylko na 4,3 ms, zanim przejdą przez kolejne zwężenia z medianą czasu pasażu wynoszącą 3,3 ms. Metoda ta może zapewnić wgląd w lepkosprężystą naturę komórek i ostatecznie ujawnić molekularne pochodzenie tego zachowania.

Aby zbadać odkształcalność różnych typów komórek, ludzkie komórki białaczkowe szpiku (HL-60), zróżnicowane komórki neutrofilowe, komórki limfocytów mysich oraz linie komórkowe raka jajnika u ludzi (OVCAR8, HEYA8) są oceniane przy użyciu mikrofluidalnej techniki „Cell Deformer”. Reprezentatywne wyniki czasu przejścia komórek HL-60 i komórek HL-60 typu neutrofilowego pokazują skalę czasową przejścia pojedynczej komórki przez serię zwężeń, co przedstawiono na Rysunku 6. Czas przejścia jest mierzony dla popu...

Pokazujemy test oparty na mikrofluidyce do pomiaru skali czasowej dla komórek do przejścia przez sekwencję zwężeń w skali mikronów.

Technika mikroprzepływowa do badania odkształcalności komórek

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zbadanie zdolności do deformacji różnych typów komórek przy użyciu prostego testu opartego na mikrofluidyce. Osiąga się to poprzez wykonanie mikrofluidycznego urządzenia z polidimetylosiloksanu (PDMS), aby zbadać czas przejścia komórek przez sekwencję zwężeń w skali mikronowej. Następnie wykorzystuje się przepływ wymuszony ciśnieniem do przesuwania komórek przez kanały mikrofluidyczne, co umożliwia analizę deformacji i zależnej od czasu relaksacji poszczególnych komórek. W dalszej kolejności uruchamiany jest zautomatyzowany program analizy obrazu w celu przetworzenia filmów i uzyskania histogramu danych dotyczących czasu przejścia.Wyniki wskazują, że różne typy komórek wykazują różnice w podatności na odkształcanie w zależności od czasu ich przejścia przez serię zwężeń. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia sił atomowych czy aspiracja mikropipetą, jest możliwość skutecznego działania urządzeń mikroprzepływowych z wysoką wydajnością. Inne urządzenia mikroprzepływowe mogą być również wykorzystywane do badania podatności komórek na odkształcanie.Projektujemy nasze urządzenie w taki sposób, aby

a-microfluidic-technique-to-probe-cell-deformability

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Technika mikrofluidyczna do badania zdolności komórek do odkształcenia

Opisujemy protokół wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych, które umożliwiają wychwytywanie i hodowlę komórek. W tym podejściu wykorzystuje się ustrukturyzowane mikrostruktury, takie jak rowki wewnątrz kanałów mikrofluidycznych, aby stworzyć obszary o niskim naprężeniu ścinającym, w których komórki mogą zostać unieruchomione.

Urządzenie mikrofluidyczne z wzorami rowków do badania zachowania komórek

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę pomiaru sztywności komórek. Ogólna zasada tego podejścia polega na pomiarze deformacji błony w odpowiedzi na ściśle określone podciśnienie przyłożone do powierzchni komórki za pomocą mikropipety. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania właściwości biomechanicznych komórek przytwierdzonych do podłoża.

Aspiracja mikropipetą komórek przytwierdzonych do podłoża w celu oszacowania sztywności komórek

Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z systemu w szerokim zakresie zastosowań.

Ściskanie komórek jako solidna, mikroprzepływowa platforma dostarczania wewnątrzkomórkowego

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Ten artykuł zawiera szczegółowe metody wytwarzania i charakteryzowania pneumatycznie uruchamiającego urządzenia mikroprzepływowego do kompresji chondrocytów.

Platforma mikroprzepływowa do stymulacji chondrocytów za pomocą dynamicznej kompresji

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Ta praca przedstawia elastyczny protokół wykorzystania technologii fluorescencyjnie znakowanych elastomerowych powierzchni skurczowych (FLECS) w formacie mikrostudzienki do uproszczonej, bezobsługowej kwantyfikacji sił skurczu pojedynczej komórki na podstawie wizualizacji przemieszczeń mikrowzorów białek fluorescencyjnych.

Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych

Tutaj przedstawiono protokół do budowy szybkiego i nieniszczącego systemu pomiaru ściśliwości komórki lub jądra w oparciu o mikrourządzenie akustyczne. Zbadano zmiany właściwości mechanicznych komórek nowotworowych po przejściu nabłonkowo-mezenchymalnym lub promieniowaniu jonizującym, wykazując perspektywę zastosowania tej metody w badaniach naukowych i praktyce klinicznej.

Pomiar ściśliwości komórki i jądra w oparciu o mikrourządzenie akustyczne

Przedstawiona tutaj jest metoda mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej zwanej mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Platforma ta utrzymuje umiarkowaną przepustowość 1-10 komórek/s, mierząc zarówno elastyczne, jak i lepkie właściwości biofizyczne komórek.

Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek

Prezentowany tutaj jest protokół do badania zmęczenia mechanicznego w przypadku ludzkich czerwonych krwinek przy użyciu metody elektrodeformacji modulowanej amplitudą. To ogólne podejście można wykorzystać do pomiaru systematycznych zmian w cechach morfologicznych i biomechanicznych komórek biologicznych w zawiesinie od cyklicznej deformacji.

Elektrodeformacja z modulacją amplitudy do oceny zmęczenia mechanicznego komórek biologicznych

Poznaj technikę mikroprzepływową do badania odkształcalności komórek przy użyciu urządzeń PDMS. Ta metoda umożliwia wysokoprzepustową analizę czasu tranzytu przez mikroskopijne zwężenia.

Technika mikroprzepływowa do badania odkształcalności komórek

Przeglądaj więcej filmów