Oznaczanie potencjału błony mitochondrialnej i reaktywnych form tlenu w żywych neuronach korowych szczurów

Celem tej procedury jest określenie potencjału błony mitochondrialnej i poziomów reaktywnych form tlenu w pierwotnych neuronach korowych za pomocą odpowiednio sond fluorescencyjnych, TMRM i H 2D CFD. W tym celu należy najpierw przygotować zapasy i stężenia robocze TMRM i H 2D CFDA. Drugim krokiem jest inkubacja neuronów korowych za pomocą TMRM i H 2D CFDA w temperaturze pokojowej przez 45 minut w buforze tajlandzkich dróg.

Trzecim krokiem jest zobrazowanie intensywności fluorescencji TMRM i DCF w żywych neuronach korowych przy użyciu odpowiednio 5 15 5 17 nanometrów i 4 88 5 15 nanometrów i 4 88 5 15 nanometrów. Zmiany TMR we fluorescencji będą monitorowane w obecności mitochondrialnego unco FCCP, natomiast zmiany we fluorescencji DCF będą monitorowane w obecności nadtlenku wodoru. Ostatnim krokiem tej procedury jest zebranie, normalizacja i analiza danych.

Ostatecznie wyniki uzyskuje się poprzez wykreślenie wykresu, który pokazuje względne poziomy intensywności fluorescencji TMRM i DCF odpowiednio przed i po leczeniu FCCP i nadtlenkiem wodoru. Cześć, nazywam się Joanna Koska. Witam w moim laboratorium na Uniwersytecie Loyola w Chicago.

Dzisiaj pokażemy, jak mierzyć potencjał błony mitochondrialnej i reaktywne formy tlenu w neuronach korowych szczurów. Procedura zostanie zademonstrowana przez dhi. Cześć, nazywam się Denise Jossi.

Korzystając z tej procedury, potencjał błony mitochondrialnej można zmierzyć na pojedynczej etykiecie mitochondrialnej, a reaktywne formy tlenu na etykiecie pojedynczej komórki. Więc zacznijmy. Przygotować 10-milimolowy zapas TMRM, rozpuszczając pięć miligramów TMRM w jednym mililitrze bezwodnego wiru tlenku dimetylosulfy przez jedną minutę.

Następnie spraw, aby podwielokrotności przechowywały podwielokrotności w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Chronić przed światłem i zużyć w ciągu jednego miesiąca. Następnie przygotuj 10-milimolowy zapas H 2D CFDA, rozpuszczając 4,87 miligrama H 2D CFDA w jednym mililitrze bezwodnego tlenku dimetylosulfonu.

Podobnie, wiruj przez minutę, a następnie zrób porcje i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Chronić przed światłem i użyć w ciągu tygodnia, aby najpierw załadować neurony korowe szczura TMRM. Umyj wyhodowane neurony trzykrotnie buforem tyro.

Następnie przygotuj 20 nanomolowych TMRM, rozcieńczając 10-milimolowy TMRM 1000 razy w tb. Następnie dodać dwa mikrolitry rozcieńczonego TMRM na jeden mililitr tb. Inkubuj neurony za pomocą TMRM przez 45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.

Po 45 minutach zamontuj naczynie hodowlane na stoliku mikroskopu i rozpocznij obrazowanie, aby załadować neurony korowe szczura H 2D CFDA, umyj wyhodowane neurony trzykrotnie gruźlicą. Następnie przygotuj dwa mikromole H 2D CFDA, rozcieńczając 10-milimolowy zapas H 2D CFDA 10 razy w tb. A następnie dodaj dwa mikrolitry rozcieńczonego H 2D CFDA na jeden mililitr tb.

Następnie inkubuj neurony z H 2D CFDA przez 45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej po 45 minutach. Czterokrotnie przemyj neurony gruźlicą w celu usunięcia nadmiaru wskaźnika fluorescencyjnego przed uzyskaniem obrazów w celu wykonania obrazowania na żywo neuronów inkubowanych za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej TMRM z zastosowaniem programu szeregów czasowych na żywo. Zastosuj niską rozdzielczość i stłumioną moc lasera, aby zminimalizować czas potrzebny na uzyskanie obrazów i uniknąć wybielania zdjęć.

Następnie dostosuj ostrość zamontowanych neuronów załadowanych TMRM za pomocą światła odbitego. Zbadaj fluorescencję TMRM przez oświetlenie przy pięciu 14 nanometrach i detekcję przy pięciu 70 nanometrach. Ustaw wzmocnienie detekcji kamery tuż poniżej poziomu nasycenia po ustawieniu wszystkich parametrów, takich jak rozdzielczość, detekcja mocy lasera, wzmocnienie kamery i interwał poklatkowy w celu uzyskania obrazów.

Nie zmieniaj tych ustawień między eksperymentami. Następnie zmień pole. Rozpocznij zbieranie obrazów, aby przetestować zmiany w bodźcu delta PSY M, takie jak zastosowanie jednego mikromola FCCP lub dwóch mikrogramów na mililitr oligomycyny, co odpowiednio znacznie zdepolaryzuje lub hiperpolaryzuje potencjał błony mitochondrialnej.

Zmiany te będą odzwierciedlone przez zmniejszenie intensywności fluorescencji TMRM w porównaniu z wyjściową intensywnością fluorescencji w przypadku FCCP lub wzrost intensywności fluorescencji TMRM. W przypadku LIGA myin sin do wykonania obrazowania na żywo neuronów inkubowanych za pomocą H 2D CFDA najpierw zamontuj szalkę hodowlaną na stoliku mikroskopu, dostosuj ostrość komórek za pomocą odbitego światła. Zbadaj fluorescencję DCF przez wzbudzenie w 4 88 nanometrach i emisję w pięciu 15 nanometrach.

Następnie dostosuj moc lasera do pięciu do 7%wykryj wzmocnienie i rozdzielczość 2 56 na 2 56. Nie zmieniaj tych ustawień między eksperymentami. Następnie ustaw częstotliwość uzyskiwania obrazów na żywo.

Korzystając z programu Szeregi czasowe, wybierz nowe pole i rozpocznij pobieranie obrazów w celu wykrycia zmian na poziomach Rőos. Potraktuj komórki 100 do 200 mikromolami nadtlenku wodoru. Znajdzie to odzwierciedlenie we wzroście intensywności fluorescencji DCF w porównaniu z poziomem wyjściowym.

Użyj narzędzia obszaru zainteresowania z programu LSM, aby wybrać obszary. Następnie wybierz ROI z regionów mitochondrialnych lub ROI z całego ciała komórki w komórkach obrazu. Do pomiaru intensywności fluorescencji odpowiednio TMRM lub ROS.

Zaznacz regiony obok komórek. Aby obliczyć intensywność fluorescencji tła, wykonaj kilka pomiarów i aby obliczyć średnią intensywność tła, odejmij średnią intensywność fluorescencji tła od średniej intensywności fluorescencji obszarów zainteresowania w każdej komórce dla każdego punktu czasowego za pomocą programu Microsoft Excel. Po odjęciu intensywności tła znormalizuj intensywność fluorescencji TMRM lub DCF do fluorescencji wyjściowej.

Korzystając z tego wzoru, użyj programu wykres Sigma, aby wygenerować wykres przedstawiający zmiany intensywności fluorescencji w czasie. Oto przykład fluorescencyjnego obrazu neuronów korowych szczura inkubowanych za pomocą TMRM. Dodatek F-C-C-P-A mitochondrialnego unco prowadzi do depolaryzacji mitochondriów i utraty intensywności fluorescencji TMRM.

Wyjściowy poziom fluorescencji TMRM pozostaje stabilny przed dodaniem FCCP. Analiza ilościowa zmian fluorescencji TMRM w czasie wykazuje znaczny spadek fluorescencji TMRM po dodaniu FCCP. Oto przykład fluorescencyjnego obrazu neuronów kory mózgowej szczura załadowanych DCF.

Wyjściowy poziom fluorescencji DCF pozostaje niezmieniony w ciągu pierwszych 120 sekund przed zastosowaniem nadtlenku wodoru. Dodanie nadtlenku wodoru powoduje wzrost intensywności fluorescencji DCF w ciałach komórkowych. Pomiary poklatkowe fluorescencji DCF pokazują jej stały poziom, który wzrósł po zabiegach nadtlenkiem wodoru.

W tej procedurze ważne jest, aby pamiętać o użyciu niskiej mocy lasera i dużej prędkości skanowania, aby uniknąć artefaktów spowodowanych wybielaniem zdjęć i fototoksycznością. Powodzenia w eksperymencie.