Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

Badania te koncentrują się na rozregulowaniu mitochondriów w chorobach neurodegeneracyjnych. Wierzymy, że badania te mogą być wykorzystane do zrozumienia potencjalnych przyczyn wystąpienia choroby, które mogą prowadzić do terapii zwalczających choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona i ALS. Techniki takie jak mikroskopia superrozdzielcza, taka jak STED i SIM, lub mikroskopia ekspansywacyjna poprawiły zdolność dokładnego zrozumienia rozmieszczenia białek w poszczególnych organellach i rozmieszczenia mitochondriów w komórce.

Wyniki tej techniki mogą być wykorzystane jako punkt wyjścia do badania wpływu mutacji związanych z chorobą Parkinsona na obrót mitochondriów i rozpoczęcia zrozumienia znaczenia regulacji poziomów reaktywnych form tlenu i potencjału błony mitochondrialnej w celu utrzymania zdrowia neuronów. Nasze laboratorium ma na celu mechanistyczne scharakteryzowanie poszczególnych mitochondrialnych ścieżek kontroli jakości, aby zrozumieć wzajemne oddziaływanie między tymi szlakami. Mając wgląd w dynamikę szlaków, można zrozumieć, w jaki sposób mitochondria są utrzymywane i jak dysregulacja mitochondriów przyczynia się do wystąpienia choroby neurodegeneracyjnej.

Zacznij od zmieszania 200 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy z 2 mikrogramami dowolnego DNA w kratę oddzielnie w sterylnej probówce do mikrowirówki 1. Powtórz to dla dwóch innych plazmidów w oddzielnych probówkach. Następnie w nowej probówce 2 wymieszaj 200 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy z 6 mikrolitrami odczynnika do transfekcji i wymieszaj zawartość przez pipetowanie.

Inkubować probówki przez pięć minut w temperaturze pokojowej przed zmieszaniem zawartości probówki 2 z probówką 1. W oddzielnych probówkach powtórz mieszanie pozostałych dwóch plazmidów z odczynnikiem do transfekcji. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj kompleksy transfekcji do szalek obrazowania z nasionami kultur komórkowych HeLa, zapewniając równomierne rozprowadzenie w całej szalce. Na godzinę przed obrazowaniem otwórz zawór zbiornika dwutlenku węgla i włącz sterownik środowiskowy mikroskopu. Za pomocą strzałek w górę iw dół na panelu dotykowym ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, a dwutlenek węgla na 5%, naciśnij Set po zakończeniu.

Aby dostosować ustawienia lasera, włącz laser światła białego, klikając kartę Acquire (Pobierz) i wybierając opcję Open Laser Overview (Otwórz przegląd lasera). W oknie dialogowym przełącz laser światła białego na Wł.Wprowadź moc lasera jako 85%Kliknij przycisk Kontrola wzbudzenia i wybierz Moc maksymalna z menu rozwijanego. Rozpocznij eksperyment z tetrametylorodaminą, perkolatem estru etylowego lub TMRE, ustawiając laser wzbudzający na 514 nanometrów i okno widm emisyjnych na 524 do 545 nanometrów dla YFP.

Następnie, dla MitoTracker Deep Red, ustaw laser wzbudzający na 641, a okno widm emisyjnych na 650 do 750 nanometrów. Podobnie dla TMRE ustaw laser wzbudzający na 555 nanometrów, a okno widm emisyjnych na 557 do 643 nanometrów. Rozpocznij ustawianie akwizycji obrazu, wybierając kartę Pobieranie i dostosowując format do 1024 x 1024.

Ustaw prędkość na 600 w menu rozwijanym. Następnie kliknij przycisk Średnia liniowa i z menu rozwijanego wybierz 3. Włącz skanowanie dwukierunkowe i ustaw fazę oraz współczynnik powiększenia odpowiednio na 22,61 i 1,50.

Po zakończeniu wybierz komórki na podstawie sygnału fluorescencyjnego YFP, klikając ustawienie YFP 1 i naciskając Fast Live. Następnie dostosuj wzmocnienie i intensywność YFP, a następnie wybierz komórki na podstawie sygnału fluorescencyjnego YFP. Aby zobrazować płytkę kontrolną DMSO w eksperymencie TMRE, dostosuj wzmocnienie i intensywność ustawienia sygnału TMRE 2 tak, aby intensywność sieci mitochondrialnej była tuż poniżej nasycenia.

Utrzymuj stałe wzmocnienie i intensywność TMRE. Następnie dostosuj wzmocnienie i intensywność ustawienia MitoTracker 1 tak, aby sieć mitochondrialna była widoczna, ale przyciemniona. Po zakończeniu ustawień wzmocnienia i intensywności kliknij przycisk Start, aby uzyskać obraz.

Uzyskaj obrazy 20 komórek w każdym warunku eksperymentalnym. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji transfekowanych komórek HeLa w oprogramowaniu ImageJ, kliknij Plik i wybierz Otwórz. W oknie dialogowym wybierz pliki obrazowania do eksperymentu i kliknij przycisk OK. Gdy pojawi się okno Opcje importu formatów biologicznych, wybierz Podziel kanały i kliknij OK.In eksperymenty z tetrametylorodaminą, perkolatem estru etylowego lub TMRE, YFP jest pierwszym kanałem.

MitoTracker jest drugim kanałem, a TMRE jest trzecim kanałem. Dostosuj jasność, wybierając Obraz, następnie Dostosuj, a następnie Jasność. Następnie załaduj zapisany obszar zainteresowania lub ROI, klikając Analizuj, następnie Narzędzia, a następnie Menedżer ROI.

W Menedżerze ROI kliknij Więcej, a następnie Otwórz z listy i wybierz zapisany ROI. Następnie zmierz intensywność fluorescencji pięciu losowych regionów w jednej komórce, wybierając zapisany zwrot z inwestycji z menedżera zwrotu z inwestycji i przenosząc zwrot z inwestycji w losowe miejsce w komórce. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji, naciśnij M na klawiaturze i powtórz tę czynność z czterema dodatkowymi, nienakładającymi się obszarami.

Gdy pojawi się okno dialogowe z wartościami obszaru i średniej szarości, skopiuj wartości i wklej je do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy. Wyniki dotyczące intensywności fluorescencji TMRE i MitoSOX wykazały, że leczenie znanym czynnikiem rozprzęgającym CCCP zmniejszyło intensywność fluorescencji TMRE w porównaniu z warunkami kontrolnymi. Ponadto 20-mikromolowe leczenie CCCP indukowało produkcję ponadtlenkową i zwiększało intensywność fluorescencji MitoSOX.

W łagodnych lub pięciomikromolowych warunkach stresu CCCP ekspresja Parkin Wild-Type i Parkin T240R skutkowała wyższą intensywnością TMRE w porównaniu z pustym wektorem kontrolnym YFP. Intensywność MitoSOX była niższa w komórkach eksprymujących Parkinę typu dzikiego i Parkinę T240R w porównaniu z komórkami eksprymującymi wektor kontrolny YFP, co sugeruje, że ekspresja Parkiny pomaga utrzymać zdrowie sieci mitochondrialnej poprzez zachowanie wyższych potencjałów błony mitochondrialnej i niskich poziomów ponadtlenków.