Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa
May 12th, 2023
Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.
Badania te koncentrują się na rozregulowaniu mitochondriów w chorobach neurodegeneracyjnych. Wierzymy, że badania te mogą być wykorzystane do zrozumienia potencjalnych przyczyn wystąpienia choroby, które mogą prowadzić do terapii zwalczających choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona i ALS. Techniki takie jak mikroskopia superrozdzielcza, taka jak STED i SIM, lub mikroskopia ekspansywacyjna poprawiły zdolność dokładnego zrozumienia rozmieszczenia białek w poszczególnych organellach i rozmieszczenia mitochondriów w komórce.
Wyniki tej techniki mogą być wykorzystane jako punkt wyjścia do badania wpływu mutacji związanych z chorobą Parkinsona na obrót mitochondriów i rozpoczęcia zrozumienia znaczenia regulacji poziomów reaktywnych form tlenu i potencjału błony mitochondrialnej w celu utrzymania zdrowia neuronów. Nasze laboratorium ma na celu mechanistyczne scharakteryzowanie poszczególnych mitochondrialnych ścieżek kontroli jakości, aby zrozumieć wzajemne oddziaływanie między tymi szlakami. Mając wgląd w dynamikę szlaków, można zrozumieć, w jaki sposób mitochondria są utrzymywane i jak dysregulacja mitochondriów przyczynia się do wystąpienia choroby neurodegeneracyjnej.
Zacznij od zmieszania 200 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy z 2 mikrogramami dowolnego DNA w kratę oddzielnie w sterylnej probówce do mikrowirówki 1. Powtórz to dla dwóch innych plazmidów w oddzielnych probówkach. Następnie w nowej probówce 2 wymieszaj 200 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy z 6 mikrolitrami odczynnika do transfekcji i wymieszaj zawartość przez pipetowanie.
Inkubować probówki przez pięć minut w temperaturze pokojowej przed zmieszaniem zawartości probówki 2 z probówką 1. W oddzielnych probówkach powtórz mieszanie pozostałych dwóch plazmidów z odczynnikiem do transfekcji. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie dodaj kompleksy transfekcji do szalek obrazowania z nasionami kultur komórkowych HeLa, zapewniając równomierne rozprowadzenie w całej szalce. Na godzinę przed obrazowaniem otwórz zawór zbiornika dwutlenku węgla i włącz sterownik środowiskowy mikroskopu. Za pomocą strzałek w górę iw dół na panelu dotykowym ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, a dwutlenek węgla na 5%, naciśnij Set po zakończeniu.
Aby dostosować ustawienia lasera, włącz laser światła białego, klikając kartę Acquire (Pobierz) i wybierając opcję Open Laser Overview (Otwórz przegląd lasera). W oknie dialogowym przełącz laser światła białego na Wł.Wprowadź moc lasera jako 85%Kliknij przycisk Kontrola wzbudzenia i wybierz Moc maksymalna z menu rozwijanego. Rozpocznij eksperyment z tetrametylorodaminą, perkolatem estru etylowego lub TMRE, ustawiając laser wzbudzający na 514 nanometrów i okno widm emisyjnych na 524 do 545 nanometrów dla YFP.
Następnie, dla MitoTracker Deep Red, ustaw laser wzbudzający na 641, a okno widm emisyjnych na 650 do 750 nanometrów. Podobnie dla TMRE ustaw laser wzbudzający na 555 nanometrów, a okno widm emisyjnych na 557 do 643 nanometrów. Rozpocznij ustawianie akwizycji obrazu, wybierając kartę Pobieranie i dostosowując format do 1024 x 1024.
Ustaw prędkość na 600 w menu rozwijanym. Następnie kliknij przycisk Średnia liniowa i z menu rozwijanego wybierz 3. Włącz skanowanie dwukierunkowe i ustaw fazę oraz współczynnik powiększenia odpowiednio na 22,61 i 1,50.
Po zakończeniu wybierz komórki na podstawie sygnału fluorescencyjnego YFP, klikając ustawienie YFP 1 i naciskając Fast Live. Następnie dostosuj wzmocnienie i intensywność YFP, a następnie wybierz komórki na podstawie sygnału fluorescencyjnego YFP. Aby zobrazować płytkę kontrolną DMSO w eksperymencie TMRE, dostosuj wzmocnienie i intensywność ustawienia sygnału TMRE 2 tak, aby intensywność sieci mitochondrialnej była tuż poniżej nasycenia.
Utrzymuj stałe wzmocnienie i intensywność TMRE. Następnie dostosuj wzmocnienie i intensywność ustawienia MitoTracker 1 tak, aby sieć mitochondrialna była widoczna, ale przyciemniona. Po zakończeniu ustawień wzmocnienia i intensywności kliknij przycisk Start, aby uzyskać obraz.
Uzyskaj obrazy 20 komórek w każdym warunku eksperymentalnym. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji transfekowanych komórek HeLa w oprogramowaniu ImageJ, kliknij Plik i wybierz Otwórz. W oknie dialogowym wybierz pliki obrazowania do eksperymentu i kliknij przycisk OK. Gdy pojawi się okno Opcje importu formatów biologicznych, wybierz Podziel kanały i kliknij OK.In eksperymenty z tetrametylorodaminą, perkolatem estru etylowego lub TMRE, YFP jest pierwszym kanałem.
MitoTracker jest drugim kanałem, a TMRE jest trzecim kanałem. Dostosuj jasność, wybierając Obraz, następnie Dostosuj, a następnie Jasność. Następnie załaduj zapisany obszar zainteresowania lub ROI, klikając Analizuj, następnie Narzędzia, a następnie Menedżer ROI.
W Menedżerze ROI kliknij Więcej, a następnie Otwórz z listy i wybierz zapisany ROI. Następnie zmierz intensywność fluorescencji pięciu losowych regionów w jednej komórce, wybierając zapisany zwrot z inwestycji z menedżera zwrotu z inwestycji i przenosząc zwrot z inwestycji w losowe miejsce w komórce. Aby zmierzyć intensywność fluorescencji, naciśnij M na klawiaturze i powtórz tę czynność z czterema dodatkowymi, nienakładającymi się obszarami.
Gdy pojawi się okno dialogowe z wartościami obszaru i średniej szarości, skopiuj wartości i wklej je do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy. Wyniki dotyczące intensywności fluorescencji TMRE i MitoSOX wykazały, że leczenie znanym czynnikiem rozprzęgającym CCCP zmniejszyło intensywność fluorescencji TMRE w porównaniu z warunkami kontrolnymi. Ponadto 20-mikromolowe leczenie CCCP indukowało produkcję ponadtlenkową i zwiększało intensywność fluorescencji MitoSOX.
W łagodnych lub pięciomikromolowych warunkach stresu CCCP ekspresja Parkin Wild-Type i Parkin T240R skutkowała wyższą intensywnością TMRE w porównaniu z pustym wektorem kontrolnym YFP. Intensywność MitoSOX była niższa w komórkach eksprymujących Parkinę typu dzikiego i Parkinę T240R w porównaniu z komórkami eksprymującymi wektor kontrolny YFP, co sugeruje, że ekspresja Parkiny pomaga utrzymać zdrowie sieci mitochondrialnej poprzez zachowanie wyższych potencjałów błony mitochondrialnej i niskich poziomów ponadtlenków.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie bada dysregulację mitochondrialną w chorobach neurodegeneracyjnych, szczególnie koncentrując się na komórkach HeLa. Badania eksplorują wpływ mutacji związanych z chorobą Parkinsona na zdrowie mitochondrialne, stosując zaawansowane techniki obrazowania do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów nadtlenków.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Dysfunkcja mitochondrialna w chorobach neurodegeneracyjnych
- Skupienie się na chorobie Parkinsona i ALS
- Stres komórkowy i zdrowie mitochondrialne
Tło
- Znaczenie kontroli jakości mitochondrialnej
- Rola reaktywnych form tlenu w zdrowiu neuronów
- Poszukiwanie potencjalnych celów terapeutycznych w neurodegeneracji
Zastosowane metody
- Fluorescencyjne techniki obrazowania na żywo
- Modelowy system komórek HeLa
- Mikroskopia super-rozdzielczościowa, testy TMRE i MitoTracker
Główne wyniki
- Wpływ CCCP na potencjał błony mitochondrialnej i poziomy nadtlenków
- Rola ekspresji Parkin w utrzymaniu zdrowia mitochondrialnego
- Pomiar intensywności fluorescencji wskazujący na integralność sieci mitochondrialnej
Wnioski
- Badanie ilustruje krytyczny związek między funkcją mitochondrialną a mechanizmami chorób neurodegeneracyjnych.
- Uzyskane informacje mogą wpłynąć na przyszłe strategie terapeutyczne dotyczące zdrowia mitochondrialnego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative live-cell imaging of mitochondrial membrane potential and superoxide levels enables mechanistic de-risking in early neurodegeneration research. This fluorescence-based workflow supports predictive confidence in target validation for mitochondrial quality control pathways, directly informing portfolio decisions in neurodegenerative disease programs. The approach provides actionable data for triaging targets linked to mitochondrial dysfunction, such as Parkin mutations relevant to Parkinson's disease.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial quality control mechanisms implicated in neurodegenerative disease onset.
- Supports functional validation of disease-linked mutations, such as Parkin T240R, in cellular models.
- Provides quantitative readouts for mechanistic de-risking of mitochondrial targets.
- Facilitates prioritization of targets based on impact on mitochondrial health metrics.
Screening & Assay Development
- Establishes validated fluorescence-based assays for mitochondrial membrane potential and superoxide quantification.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for compound screening or genetic perturbation studies.
- Enables standardization of imaging and analysis parameters across experimental conditions.
- Supports scalability for screening mitochondrial modulators in cell-based systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial health metrics with disease-relevant cellular phenotypes for translational continuity.
- Provides a platform for evaluating the impact of candidate therapeutics on mitochondrial function in preclinical models.
- Supports risk-adjusted advancement of targets with validated mitochondrial effects.
- Enables mechanistic linkage between genetic mutations and cellular dysfunction in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence-based quantification method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research in neurodegeneration pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on mitochondrial quality control and pathway dynamics.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative outputs for evaluating genetic or chemical modulators.
- Analytics: Delivers fluorescence intensity measurements for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges cellular phenotypes to disease-relevant mechanisms, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable workflow for mitochondrial health assessment across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mitochondrial target validation and mechanistic understanding.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of live-cell imaging assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking genetic mutations to functional mitochondrial outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodegeneration targets based on quantitative mitochondrial metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell fluorescence imaging and quantitative image analysis.
- Demands access to advanced microscopy platforms and analytical software such as ImageJ.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data analysis workflows.
- Adaptation may be needed for different cell types or disease-relevant models.
- Practical limitations include throughput constraints and the need for careful control of experimental variables.
