Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Protokół ten umożliwia ocenę funkcji mitochondriów wewnątrz nerwu poprzez parcelację izolowanych mitochondriów, co jest trudną procedurą w małej tkance, która zawiera ograniczoną liczbę mitochondriów. Technika ta daje możliwość jednoczesnej analizy funkcji mitochondriów, takich jak zużycie tlenu i produkcja ROS w zachowanych mitochondriach in situ. Z wieloma substratami, inhibitorami i protokołami projektowania rozsprzęgaczy.

Kilka chorób ma wspólną funkcję mitochondriów, w szczególności neuropatie wywołane cukrzycą typu drugiego lub chemioterapią. W tych chorobach upośledzenie mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej jest jedynym objawem, który dyktuje rozwój choroby. Metoda ta zapewnia wgląd w neurobiologię, biochemię i farmakologię, z badaniem mechanizmów chorób mitochondrialnych, poszukiwaniem terapii, takich jak wzmacniacze mitochondriów lub łagodzenie bólu neuropatycznego.

Na początek skalibruj czujniki tlenu, pipetując 2,1 mililitra buforu MR do każdej komory. Zamknij go korkami i wciągaj powietrze do komory, aż utworzy się pęcherzyk. Mieszaj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę w trybie kalibracji, aż strumień tlenu na masę ustabilizuje się.

Za pomocą oprogramowania HRR wykonaj kalibrację powietrza polarograficznych czujników tlenu zgodnie z instrukcjami producenta. W celu przygotowania tkanki umieść nerw kulszowy na szalce Petriego z wystarczającą ilością buforu TP, aby go przykryć. Przytrzymaj jeden koniec nerwu kleszczami, a drugą parą kleszczy wyciągnij wiązki nerwowe poziomo.

Najpierw przenieś wyświetlaną tkankę do małego naczynia zawierającego jeden mililitrowy bufor TP w celu przepuszczalności tkanek. Aby rozpocząć przepuszczalność, przenieś tkankę za pomocą kleszczy do innego naczynia zawierającego jeden mililitr buforu TP, zawierającego 50 mikrogramów na mililitr saponiny. Umieść płytkę w wytrząsarce do mikropłytek i delikatnie mieszaj przez 30 minut.

Następnie przenieś tkankę za pomocą kleszczyków do świeżego naczynia zawierającego jeden mililitr buforu MR i delikatnie mieszaj przez 10 minut. Przenieś tkankę za pomocą kleszczy do skalibrowanej komory HRR. Napełnij komory HRR 2,1 mililitra buforu MR.

Dodaj Amplex Red i peroksydazę do końcowego stężenia odpowiednio pięciu mikromoli i dwóch jednostek na mililitr. Następnie dodaj przepuszczalny nerw kulszowy. Zamocuj czujniki fluorescencyjne przyrządu.

Następnie wyłącz światła w sekcji sterowania oprogramowania i kliknij połącz z oksygrafem"Przejdź do edycji protokołów"w oprogramowaniu i wprowadź masę tkanki. Przejdź do układu i wybierz konkretny strumień na jednostkę próbki"opcja. Następnie wybierz wykresy, aby jednocześnie uzyskać dostęp do odczytu zużycia tlenu i, jeśli to wymagane, do produkcji nadtlenku wodoru.

Odczekaj około 10 minut. Wstrzyknąć dwa impulsy nadtlenku wodoru, każdy z nich do końcowego stężenia 260 mikromolów w celu kalibracji komory. Wstrzyknij 20 mikrolitrów bursztynianu, substratu mitochondrialnego kompleksu II, aby aktywować mitochondrialny system transportu elektronów.

Dodaj 20 mikrolitrów ADP, aby aktywować syntezę ATP. Po kolei dodaj pięć mikrolitrów cytochromu c jako wskaźnik integralności błony. Miareczkować podwielokrotnościami 0,2 mikrograma na mililitr oligomycyny do momentu, gdy nie obserwuje się dalszego spadku zużycia tlenu.

Miareczkować podwielokrotnościami 0,5 mikromola na litr FCCP, rozprzęgaczem mitochondriów, aż nie zaobserwuje się dalszego wzrostu zużycia tlenu. Aby zakończyć eksperyment, wstrzyknij dwa mikrolitry antymycyny A, wykonaj końcowe stężenie pięciu milimoli i poczekaj, aż przepływ się ustabilizuje. Przejdź do paska poleceń.

Wyszukaj multisensoryczny"w oprogramowaniu. Kliknij kontrolę"następnie naciśnij Zapisz plik"i rozłączyć się. Otwórz zapisany plik i wybierz strumień tlenu na tacę masową, aby uzyskać eksperymentalne wyniki zużycia tlenu.

Ręcznie wybierz okno między wstrzyknięciami, naciskając shift i lewy przycisk myszy. Przejdź do znaczników i wybierz statystyki, aby zwizualizować wyniki dla każdego wstrzyknięcia substratów, inhibitorów i protokołu rozprzęgania. W przypadku produkcji nadtlenku wodoru należy wykonać tę samą procedurę ze śladem nachylenia amperów.

Spadek potencjału błonowego promowany przez aktywność sythazy ATP przyspieszał zużycie tlenu. Dodatek egzogennego cytochromu C sprzyjał jedynie minimalnej stymulacji oddychania, potwierdzając integralność błony zewnętrznej mitochondriów dla tego preparatu. Zarejestrowano bezwzględne przepływy tlenu i zaobserwowano tylko 6,3% wzrost oddychania, co świadczy o dobrej jakości preparatu tkankowego.

Zużycie tlenu i produkcję ROS mierzono jednocześnie w obecności różnych substratów dostarczających paliwo do systemu transportu elektronów. Dodatek pirogronianu i jabłczanu do kompleksu mitochondrialnego I zwiększył oddychanie. Dalsze dodawanie bursztynianu do kompleksu II również zwiększa zużycie tlenu.

W związku z tym można było testować inne podłoża. Wzrosła również produkcja ROS, co wskazuje na wyciek tlenu z systemu transportu elektronów. Dodanie difosforanu adenozyny w stężeniu nasycającym zwiększyło zużycie tlenu, napędzając tworzenie ATP i zmniejszając produkcję ROS.

W przeciwieństwie do tego, miareczkowanie oligonucyklotyczne zmniejszyło zużycie tlenu i zwiększyło produkcję ROS. Sugerowało to, że permeablowany nerw kulszowy może replikować standardową relację w fizjologii mitochondriów. Dodatek FCCP i retinonu, dostosowany do oczekiwanych zmian strumienia tlenu, potwierdza, że fizjologia mitochondriów i profil bioenergetyczny zostały zachowane w permeablowanym nerwie kulszowym.

Najważniejszym krokiem jest delikatne przygotowanie wycinka tkanki, upewnienie się, że wszystkie otwory komory są odpowiednio oczyszczone. Zmiany w funkcjonowaniu mitochondriów mogą być spowodowane dysfunkcją lub niższą liczbą mitochondriów. dlatego zaleca się potwierdzenie aktywności syntazy i zawartości mitochondrialnego DNA metodą PCR.