Name: Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj metodę oceny funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości. Technika umożliwia jednoczesny pomiar zużycia tlenu i produkcji ROS w permeabilizowanej tkance nerwowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) oraz Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Jesteśmy wdzięczni dr Antonio Galinie Filho, dr Monice Montero Lomeli i dr Claudio Masuda za wsparcie w postaci wyposażenia laboratoryjnego oraz dr Marcie Sorenson za miłe i cenne uwagi dotyczące ulepszania artykułu.

Niniejszy protokół został zatwierdzony przez Komitet Etyki ds. Wykorzystywania Zwierząt w Badaniach, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) oraz wytyczne National Institutes of Health dotyczące opieki i użytkowania zwierząt doświadczalnych. Nerw kulszowy jest izolowany od czteromiesięcznych samców myszy C57BL/6, które zostały poddane eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi instytucji. Kroki protokołu są zoptymalizowane, aby uniknąć pogorszenia stanu mitochondriów. Dlatego w tym protokole kalibracja polarograficznych czujników tlenu została przeprowadzona przed preparacją tkanki nerwowej nerwu kulszowego myszy i przepuszczalnością.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotować bufor do konserwacji tkanek (bufor TP).
	<ol>
		<li>Przygotować następujące odczynniki w roztworze wody ultraczystej: 10 mM buforu Ca-EGTA z 0,1 μM wolnego wapnia, 20 mM imidazolu, 20 mM tauryny, 50 mM K-MES, 0,5 mM DTT, 6,56 mM MgCl2, 5,77 mM ATP, 15 mM fosfokreatyny (patrz tabela materiałów), pH 7,1. Przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj bufor do oddychania mitochondriów (bufor MR).
	<ol>
		<li>Przygotować następujące odczynniki w roztworze wody ultraczystej: 0,5 mM K2EGTA, 3 mM MgCl2, 60 mM MES, 20 mM tauryny, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM D-sacharozy, 1 mg/ml BSA (bez kwasów tłuszczowych) (patrz tabela materiałów), pH 7,4. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy saponin, rozpuszczając 5 mg saponiny (patrz tabela materiałów) w 1 ml buforu TP (krok 1.1) i przechowywać go na lodzie. Saponina jest przygotowywana na świeżo.</li>
	<li>Przygotować Amplex Red poprzez ponowne zawieszenie proszku (patrz Tabela Materiałów) za pomocą DMSO w celu uzyskania stężenia podstawowego 2 mM i przechowywać w temperaturze -20 °C w fiolce zabezpieczonej przed światłem. 
	UWAGA: Aby uniknąć zużycia sondy przez zamrażanie i rozmrażanie, należy wykonać małe porcje do przechowywania nie dłużej niż 6 miesięcy25.</li>
</ol>
2. Kalibracja polarograficznych czujników tlenu do respirometrii o wysokiej rozdzielczości (HRR)
<ol>
	<li>Oczyścić komory HRR instrumentu i strzykawek (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Otwórz komory HRR, napełnij wodą destylowaną do góry i mieszaj przez 5 min 3x. Powtórz z etanolem, a następnie ponownie z wodą. Umyj korki i strzykawki wodą/etanolem/wodą po 3x.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosuj następujące ustawienia kalibracji w oprogramowaniu HRR (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>W sterowaniu programowym HRR dodać temperaturę eksperymentalną (37 °C), parametry czujnika tlenu (wzmocnienie, 2; napięcie polaryzacji, 800 mV) i czujnika amperometrycznego (wzmocnienie, 1000; napięcie polaryzacji, 100 mV).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skalibruj czujniki tlenu.
	<ol>
		<li>Odpipetować 2,1 ml buforu MR (krok 1.2) do każdej komory. Zamknij korkami i wciągaj powietrze do komory, aż utworzy się pęcherzyk. Mieszać w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w trybie kalibracji, aż strumień tlenu na masę ustabilizuje się.</li>
		<li>Wykonaj kalibrację powietrza polarograficznych czujników tlenu w oprogramowaniu zgodnie z protokołem producenta24. 
		UWAGA: Krok kalibracji jest wykonywany tylko raz przed eksperymentem. Dodatkowe eksperymenty w tym samym medium oddechowym i temperaturze można przeprowadzić po samym umyciu komór (krok 2.1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Rozwarstwienie i przepuszczalność nerwu kulszowego
<ol>
	<li>Usuń nerw kulszowy, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Zwierzę należy poddać eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy po wyjęciu z klatki i delikatnym ograniczeniu do odpoczynku na ławce.</li>
		<li>U zwierzęcia poddanego eutanazji wykonaj nacięcie nożyczkami w dolnej części pleców, zaczynając w pobliżu kręgosłupa i idąc w dół uda w kierunku stopy. Usuń skórę i mięśnie przyczepione do nerwu, a następnie przetnij i usuń cały nerw kulszowy.</li>
		<li>Natychmiast zważyć tkankę i umieścić ją w fiolce wypełnionej zimnym buforem TB (4 °C). Wykonaj kroki 3.2-3.3 na ice. 
		UWAGA: Masa mokrej tkanki służy do normalizacji zużycia tlenu i przepływu produkcji ROS w następujących krokach. Jeśli tkanki nie można natychmiast zważyć, należy ją przechowywać w zimnym buforze przeciw gruźlicy. Zabieg wykonywany jest w świeżej tkance i nie wolno go zamrażać, aby uniknąć uszkodzenia mitochondriów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu przygotowania tkanki umieść nerw kulszowy na szalce Petriego z wystarczającą ilością buforu TP, aby go przykryć. Przytrzymaj jeden koniec nerwu kleszczami, a drugą parą kleszczy wyciągnij wiązki nerwowe poziomo. 
	UWAGA: Ta procedura musi być wykonana w mniej niż 10 minut, aby uniknąć pogorszenia stanu tkanek. Tkanka będzie gotowa, gdy będzie można ją zwizualizować jako przezroczyste mgliste warstwy, naprzeciwko poprzedniej białej nieprzezroczystej tkanki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Najpierw przenieś rozłożoną tkankę do małego naczynia zawierającego 1 ml buforu TP w celu przepuszczalności tkanek. Aby rozpocząć przepuszczalność, przenieś tkankę za pomocą kleszczy do naczynia zawierającego 1 ml buforu TP i 10 μl saponiny (z roztworu podstawowego, krok 1.3).
	<ol>
		<li>Wstrząsać delikatnie wytrząsarką do mikropłytek przez 30 minut, następnie przenieść tkankę za pomocą kleszczy do świeżego naczynia zawierającego bufor MR (1 ml) i delikatnie wstrząsać przez 10 minut. Przenieść tkankę za pomocą kleszczyków do skalibrowanej komory HRR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zużycie tlenu i określanie produkcji ROS
<ol>
	<li>Napełnij komory HRR 2,1 ml buforu MR, dodaj Amplex Red (krok 1.4) do końcowego stężenia 5 μM i peroksydazę do 2 U/ml i dodaj przepuszczalny nerw kulszowy (krok 3).
	<ol>
		<li>Podłącz czujniki fluorescencji przyrządu, wyłącz światła w sekcji sterowania oprogramowania i naciśnij Połącz z oksygrafem. W polu "edytuj protokoły" w oprogramowaniu wprowadź masę tkanki zmierzoną w kroku 3.1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejdź do "układu", wybierz opcję "określony strumień na jednostkę próbki" i wybierz Wykresy, aby jednocześnie uzyskać dostęp do odczytu zużycia tlenu i, w razie potrzeby, do produkcjiH2O2. Czekaj ~10 min. 
	UWAGA: Czas ten jest wymagany do ustabilizowania podstawowego przepływu zużycia tlenu bez dodatku substratu (podstawowego). Przed kolejnymi wstrzyknięciami należy upewnić się, że przepływ tlenu jest ustabilizowany.</li>
	<li>Wstrzyknąć dwa impulsyH2O2, każdy do końcowego stężenia 260 μM, w celu późniejszej kalibracji w komorze.</li>
	<li>Wstrzyknąć 20 μl bursztynianu (patrz tabela materiałów), substratu kompleksu mitochondrialnego II, aby aktywować mitochondrialny system transportu elektronów. 
	UWAGA: W tym momencie można dodać różne substraty mitochondrialne, aby ocenić funkcję mitochondriów przez różne kompleksy. Reprezentatywne wyniki z różnymi substratami dla kompleksów mitochondrialnych I i II przedstawiono na Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3. W tym momencie obserwuje się jednocześnie wzrost zużycia O2 i produkcji H2O 2 w <silna klasa="xfig">Rysunek 3.</li>
	<li>Dodać 20 μl difosforanu adenozyny (ADP), aby aktywować syntezę trifosforanu adenozyny (ATP). 
	UWAGA: ADP stymuluje syntezę ATP i zmniejsza potencjał błonowy. Oczekuje się, że zaobserwuje się wzrost zużycia O2 i spadek produkcji H2O2 26,27.</li>
	<li>Kolejno dodać 5 μl cytochromu c (patrz tabela materiałów) jako wskaźnik integralności membrany. 
	UWAGA: Jeśli tkanka jest dobrze przygotowana i przepuszczalna, cytochrom c nie powinien zwiększać zużycia tlenu o więcej niż 15%. W takim przypadku zapoznaj się z sekcją rozwiązywania problemów, aby uzyskać zalecenia.</li>
	<li>Miareczkować podwielokrotnościami 0,2 μg/ml oligomycyny (patrz tabela materiałów) do momentu, gdy nie obserwuje się dalszego spadku zużyciaO2. 
	UWAGA: Oligomycyna działa poprzez hamowanie syntezy ATP, co prowadzi do zmniejszenia przepływu O2 i zwiększenia tworzenia H2O 2, czemu sprzyja wysoki potencjał błonowy26,27.</li>
	<li>Miareczkować podwielokrotnościami 0,5 μmol/l 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu cyjanku karbonylu (FCCP) (patrz tabela materiałów), rozprzęgaczając mitochondria, aż do momentu, gdy nie będzie można zaobserwować dalszego wzrostu zużyciaO2. Aby zakończyć eksperyment, wstrzyknąć 2 μl antymycyny A do końcowego stężenia 5 μM i poczekać na stabilizację przepływu. 
	UWAGA: Obserwuje się spadek produkcjiH2O2z powodu rozpraszania potencjału błonowego po wstrzyknięciu FCCP. Antymycyna A hamuje kompleks III, uniemożliwiając w ten sposób przepływ elektronów. W związku z tym zależna od mitochondriów konsumpcjaO2 jest upośledzona, zmniejszając strumień tlenu na masę i stymulując wyciek elektronów, zwiększając produkcjęH2O2 class26,27.</li>
	<li>Przejdź do paska poleceń, wyszukaj "multisensory" w oprogramowaniu, kliknij Control > Save file i Disconnect. 
	UWAGA: Dodawanie innych substratów i inhibitorów można przeprowadzić zgodnie z badanym pytaniem. Przykład jest opisany w reprezentatywnych wynikach. Kalibracja>H2O2 jest wykonywana po zakończeniu eksperymentu, zgodnie z protokołem producenta28.</li>
	<li>Otwórz zapisany plik i wybierz ślad "Strumień tlenu na masę", aby uzyskać eksperymentalne wyniki zużycia tlenu. Ręcznie wybierz okno między wstrzyknięciami, naciskając Shift + lewy przycisk myszy.
	<ol>
		<li>Przejdź do Marks > Statistics, aby zwizualizować wyniki dla każdego wstrzyknięcia substratu/inhibitorów/niesprzężonego protokołu. W przypadku produkcji H2O2 należy wykonać tę samą procedurę ze śladem "Amp-Slope". 
		UWAGA: Wybierając okno, unikaj artefaktów wstrzyknięć objętościowych, wybierając okno, w którym tlen (lubH2O2) jest bardziej stabilny i stały. Przykłady wybranych okien są reprezentowane przez czarne nawiasy klamrowe w reprezentatywnych wynikach (Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+organization%3A+from+biogenesis+to+networks+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).</li>
<li>Sena, L. A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species.</a> Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).</li>
<li>Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+the+mitochondrion%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell biology of the mitochondrion.</a> Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).</li>
<li>Rugarli, E. I., Langer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+quality+control%3A+A+matter+of+life+and+death+for+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons.</a> EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).</li>
<li>Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fusion+and+fission+in+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fusion and fission in cell life and death.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).</li>
<li>Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+quality+control+mechanisms+in+mitochondrial+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance.</a> Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).</li>
<li>Freeman, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+dysfunction+is+restricted+to+the+sciatic+nerve+in+experimental+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy.</a> Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).</li>
<li>Sheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+biogenesis+contributes+to+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).</li>
<li>Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARK+genes+link+mitochondrial+dysfunction+and+alpha-synuclein+pathology+in+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson's disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).</li>
<li>Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+of+rna+binding+proteins%2C+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS.</a> Antioxidants. 10 (4), 552(2021).</li>
<li>Nakagawa, Y., Yamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+hypothesis+on+metal+dyshomeostasis+and+mitochondrial+dysfunction+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+Potential+pathogenetic+mechanism+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications.</a> European Journal of Pharmacology. 892, 173737(2021).</li>
<li>Franco-Iborra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+HTT+%28huntingtin%29+impairs+mitophagy+in+a+cellular+model+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease.</a> Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).</li>
<li>Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+expansion+of+pathogenic+mitochondrial+DNA+heteroplasmies+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118(2021).</li>
<li>Sajic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+damage+and+%27plugging%27+of+transport+selectively+in+myelinated%2C+small-diameter+axons+are+major+early+events+in+peripheral+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial damage and 'plugging' of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61(2018).</li>
<li>Muke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+characterization+of+mitochondrial+damage+in+experimental+autoimmune+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis.</a> Journal of Neuroinflammation. 343, 577218(2020).</li>
<li>Rodella, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+Miller+Fisher+Syndrome%3A+mitochondrial+hydrogen+peroxide+is+produced+by+the+autoimmune+attack+of+nerve+terminals+and+activates+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells.</a> Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).</li>
<li>Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+HIV-1+TAT+protein-induced+Ppripheral+neuropathy+and+mitochondrial+disruption+by+the+antimuscarinic+pirenzepine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine.</a> Frontiers in Neurology. 12, 663373(2021).</li>
<li>Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoda%2C+RH+%22International+Review+of+Neurobiology%22">International Review of Neurobiology</a>. 145, Elsevier Inc. (2019).</li>
<li>Palavicini, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+disruption+of+nerve+mitochondrial+and+myelin+lipid+homeostasis+in+obesity-induced+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes.</a> JCI Insight. 5 (21), 137286(2020).</li>
<li>Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+deficits+in+peripheral+nerve+mitochondria+in+rats+with+paclitaxel-+and+oxaliplatin-evoked+painful+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy.</a> Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).</li>
<li>Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+bioenergetic+dysfunction+in+trauma-induced+painful+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy.</a> Molecular Pain. 11, 58(2015).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+Bioenergetics%3A+Methods+and+Protocols+%28Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Komlódi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mitochondrial+incubation+media+for+measurement+of+respiration+and+hydrogen+peroxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+III.+The+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state.</a> Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).</li>
<li>Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+protonic+potential+actuates+a+mechanism+of+production+of+reactive+oxygen+species+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria.</a> FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).</li>
<li>Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Mitochondrial+Pathways+and+Respiratory+Control.+An+Introduction+to+OXPHOS+Analysis.+4th+ed%22">Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed</a>. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. 80(2014).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+defects+and+heterogeneous+cytochrome+c+release+after+cardiac+cold+ischemia+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).</li>
<li>Ruas, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underestimation+of+the+maximal+capacity+of+the+mitochondrial+electron+transport+system+in+oligomycin-treated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells.</a> PLoS One. 11 (3), 0150967(2016).</li>
<li>Boveris, A., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+generation+of+hydrogen+peroxide.+General+properties+and+effect+of+hyperbaric+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen.</a> Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).</li>
<li>Skulachev, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-linked+systems+preventing+superoxide+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Membrane-linked systems preventing superoxide formation.</a> Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).</li>
<li>Majava, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characterization+of+human+peripheral+nervous+system+myelin+protein+P2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2.</a> PLoS One. 5, 10300(2010).</li>
<li>Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+of+myelin+of+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein composition of myelin of the peripheral nervous system.</a> Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).</li>
<li>Saks, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilized+cell+and+skinned+fiber+techniques+in+studies+of+mitochondrial+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle.+New+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li>
<li>Porter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+capacity+and+coupling+control+decline+with+age+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).</li>
<li>Martins, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+regulation+of+substrate+use+for+oxidative+phosphorylation+during+a+single+session+of+high+intensity+interval+or+aerobic+exercises+in+different+rat+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+B%22%5BJournal%5D)">Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles.</a> Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).</li>
<li>Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carvedilol+prevents+functional+deficits+in+peripheral+nerve+mitochondria+of+rats+with+oxaliplatin-evoked+painful+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).</li>
<li>Cooper, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production+in+peripheral+nerves+of+mice+fed+a+ketogenic+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet.</a> Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).</li>
<li>Jia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NLRP3+inflammasome+in+peripheral+nerve+contributes+to+paclitaxel-induced+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain.</a> Molecular Pain. 13, 1744806917719804(2017).</li>
<li>Muller, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denervation-induced+skeletal+muscle+atrophy+is+associated+with+increased+mitochondrial+ROS+production%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kilka chorób lub stanów towarzyszących neuropatiom ma dysfunkcję mitochondriów jako czynnik ryzyka. Ocena funkcji mitochondriów w nerwach obwodowych jest niezbędna do wyjaśnienia, w jaki sposób mitochondria działają w tych stanach neurodegeneracyjnych. Ocena funkcji mitochondriów jest pracochłonna ze względu na trudność metody izolacji i niedobór materiału. W związku z tym niezbędny jest rozwój technik przenikania tkanek, które nie wymagają izolacji mitochondriów.
Aby ocenić funkcję mitochondr...

Mitochondria są niezbędne do utrzymania żywotności komórek i pełnią liczne funkcje komórkowe, takie jak metabolizm energetyczny (szlaki metabolizmu glukozy, aminokwasów, lipidów i nukleotydów). Jako główne miejsce produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), mitochondria odgrywają kluczową rolę w kilku procesach sygnalizacji komórkowej, takich jak apoptoza, i uczestniczą w syntezie klastrów żelazowo-siarkowych (Fe-S), imporcie i dojrzewaniu białek mitochondrialnych oraz utrzymaniu ich genomu i rybosomów1,2,3. Sieć dynamiki błon mitochondrialnych jest kontrolowana przez procesy fuzji i rozszczepienia, a także posiada maszyny do kontroli jakości i mitofagii4,5,6.
Dysfunkcja mitochondriów jest związana z pojawieniem się kilku stanów patologicznych, takich jak rak, cukrzyca i otyłość7. Zaburzenia funkcji mitochondriów są wykrywane w zaburzeniach neurodegeneracyjnych, które wpływają na ośrodkowy układ nerwowy, jak w chorobie Alzheimera8,9, Choroba Parkinsona10,11, stwardnienie zanikowe boczne12,13 oraz choroba Huntingtona14,15. W obwodowym układzie nerwowym utrata funkcji mitochondriów w aksonach jest obserwowana w neuropatiach immunologicznych, takich jak zespół Guillaina-Barrégo16,17, a w połączeniu z wysoką produkcją mitochondriów ROS w aksonach, zdarzenia te prowadzą do aktywacji kinazy MAP w komórkach Schwanna18. Pokazuje to, że fizjologia mitochondriów może być niezbędna nie tylko dla komórki specyficznej dla miejsca, ale dla całej tkanki. W dystalnej polineuropatii czuciowej związanej z HIV (HIV-DSP) mitochondria odgrywają rolę w mechanizmie, dzięki któremu białko transaktywatora transkrypcji (HIV-TAT) umożliwia efektywną replikację wirusa HIV, a także kilka innych ról w patogenezie zakażenia HIV19,20.
Ocena fizjologii mitochondriów nerwu kulszowego stała się kluczowym celem do badania neuropatii7,21,22. W neuropatii cukrzycowej analizy proteomiczne i metabolomiczne sugerują, że większość zmian molekularnych w cukrzycy wpływa na mitochondrialną fosforylację oksydacyjną nerwu kulszowego i metabolizm lipidów7. Zmiany te wydają się być również wczesnymi objawami cukrzycy wywołanej otyłością21. W mysim modelu bolesnej neuropatii wywołanej chemioterapią, upośledzenie mitochondriów w nerwie kulszowym jest wykrywane jako zmniejszenie fosforylacji oksydacyjnej22 oraz zmniejszenie aktywności kompleksów mitochondrialnych, potencjału błonowego i zawartości ATP23. Jednakże, chociaż kilka grup powoływało się na dysfunkcję mitochondriów w neuropatiach, badania te ograniczają się do pomiarów aktywności w kompleksach mitochondrialnych bez zachowania błon mitochondrialnych, bez oceny integralności mitochondriów lub pomiarów zawartości ATP jako parametru produkcji mitochondrialnego ATP. Ogólnie rzecz biorąc, właściwa ocena zużycia tlenu w mitochondriach i produkcji ROS wymaga izolacji mitochondriów przez wirowanie różnicowe w gradiacji perkolu/sacharozy. Izolacja mitochondriów może być również czynnikiem ograniczającym tkankę nerwu kulszowego ze względu na dużą ilość potrzebnej tkanki oraz utratę i zakłócenie mitochondriów.
Niniejsze badanie ma na celu dostarczenie protokołu do pomiaru fizjologii mitochondriów jako zużycia tlenu w mitochondriach i produkcji ROS w nerwie kulszowym, zachowując błony mitochondrialne i bez potrzeby izolowania mitochondriów. Protokół ten został zaadaptowany na podstawie pomiarów zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach mięśniowych24 za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości (HRR). Zaletą tej procedury jest możliwość oceny mitochondriów w niewielkich ilościach tkanki, takich jak nerw kulszowy, oraz ocena parametrów mitochondrialnych in situ, zachowując w ten sposób środowisko mitochondrialne, strukturę i profil bioenergetyczny, w celu uzyskania fizjologicznie wiarygodnego wyniku. Mitochondrialne stany oddechowe określono za pomocą substratów i inhibitorów po przepuszczalności nerwu kulszowego, aby prawidłowo ocenić bioenergetykę mitochondriów i współczynnik cytochromu c dla integralności błony mitochondrialnej, stanowiąc przewodnik dla etapów oceny mitochondrialnego systemu transportu elektronów (ETS) i obliczania podstawowych parametrów. Badanie to może dostarczyć narzędzi do odpowiedzi na pytania dotyczące mechanizmów patofizjologicznych, w które zaangażowany jest metabolizm nerwu kulszowego, takich jak neuropatie obwodowe.

<table><tbody><tr><td>Hydrat soli disodowej adenozyno-5'trifosforanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa adenozyno-5&prime;-difosforanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Odczynnik</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>A12222</td><td>Amplex Red jest przygotowywany w DMSO zgodnie z kartą charakterystyki</td></tr><tr><td>produktu Antymycyna A (ze Streptomyces sp.)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>frakcja szoku cieplnego, bez proteazy, bez kwasów tłuszczowych, zasadniczo bez globulin, pH 7, &ge; 98%</td></tr><tr><td>Węglan wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6763</td><td></td></tr><tr><td>4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon karbonylu (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td> <td>(z serca konia; mała hemoproteina)</td></tr><tr><td>DataLab wersja 5.1.1.91</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td><td></td><td>Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger</td></tr><tr><td>Cyfrowa wytrząsarka orbitalna do mikropłytek 120V</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>88882005</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>EGTA sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Hamilton Sigma-Aldrich HAM80075</td><td></td><td>10 uL, 25 uL i 50 uL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Wodór roztwór nadtlenku 30% w/w</td><td>Merck</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>L-(&minus;)-Kwas jabłkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki mikropreparacyjne, zakrzywione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do mikropreparacji, proste</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017</td><td></td></tr><tr><td>O2K - Zestaw filtrów Amplex Red</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td><td>44321-01</td><td>Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometria: produkcja HRR i H2O2 w mitochondriach mózgu myszy. Mitochondrowa sieć fizjologiczna 17.17.</td></tr><tr><td>O2K - Fluorescencyjna dioda LED2 - składnik modułu Fluorescance-Sensor Zielony</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td><td>44210-01</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td> <td>(z Streptomyces diastatochromogenes; mieszanina oligomycyn A, B i C</td></tr><tr><td>OROBOROS Oxygraph-2k</td><td>OROBOROS INSTRUMENTS, Austria</td><td>http://www.oroboros.at</td><td></td></tr><tr><td>Palmitoylkarnityna (Palmitoyl-DL-karnityna-HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4509</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza z chrzanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego, polistyren</td><td>MERCK</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa fosfokreatyny hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1330</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek</td> <td>potasuSigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAE0073</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynian sodu dwuzasadowy sześciowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Dysfunkcja mitochondriów w nerwach obwodowych towarzyszy kilku chorobom związanym z neuropatią obwodową, które mogą być wywołane przez wiele przyczyn, w tym choroby autoimmunologiczne, cukrzycę, infekcje, dziedziczne zaburzenia i nowotwory. Ocena funkcji mitochondriów w nerwach obwodowych myszy może być trudna ze względu na małą wielkość próbki, ograniczoną liczbę mitochondriów obecnych w tkance oraz obecność osłonki mielinowej. Technika opisana w tej pracy minimalizuje te wyzwania poprzez zastosowanie unikalnego protokołu przepuszczalności dostosowanego do protokołu stosowanego do włókien mięśniowych, do oceny funkcji mitochondriów nerwu kulszowego zamiast izolowania mitochondriów od tkanki. Mierząc produkcję fluorymetrycznych form reaktywnych za pomocą Amplex Red/Peroxidazy i porównując różne substraty mitochondrialne i inhibitory w nerwach permeabilizowanych saponinami, możliwe było jednoczesne wykrycie mitochondrialnych stanów oddechowych, reaktywnych form tlenu (ROS) i aktywności kompleksów mitochondrialnych. W związku z tym przedstawiona tutaj metoda oferuje korzyści w porównaniu z oceną funkcji mitochondriów za pomocą innych technik.

Zużycie tlenu przez mitochondria w permeabilizowanym nerwie kulszowym przedstawiono na Ryc. 2. Czerwona krzywa reprezentuje strumień O2 na jednostkę masy w pmol/s.mg. Po zarejestrowaniu podstawowego zużycia tlenu z substratami endogennymi (oddychanie rutynowe), wstrzykuje się bursztynian (SUCC), aby zarejestrować oddychanie napędzane przez kompleks II (dehydrogenazę bursztynianową), co skutkuje zwiększeniem tempa zużycia tlenu. Następnie dodaje się nasycające stężenie ADP, aktywuj...

Wysokorozdzielcza respirometria sprzężona z czujnikami fluorescencyjnymi określa zużycie tlenu w mitochondriach i generowanie reaktywnych form tlenu (ROS). Niniejszy protokół opisuje technikę oceny częstości oddechów mitochondriów i produkcji ROS w przepuszczalnym nerwie kulszowym.

Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Protokół ten umożliwia ocenę funkcji mitochondriów wewnątrz nerwu poprzez parcelację izolowanych mitochondriów, co jest trudną procedurą w małej tkance, która zawiera ograniczoną liczbę mitochondriów. Technika ta daje możliwość jednoczesnej analizy funkcji mitochondriów, takich jak zużycie tlenu i produkcja ROS w zachowanych mitochondriach in situ. Z wieloma substratami, inhibitorami i protokołami projektowania rozsprzęgaczy.Kilka chorób ma wspólną funkcję mitochondriów, w szczególności neuropatie wywołane cukrzycą typu drugiego lub chemioterapią. W tych chorobach upośledzenie mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej jest jedynym objawem, który dyktuje rozwój choroby. Metoda ta zapewnia wgląd w neurobiologię, biochemię i farmakologię, z badaniem mechanizmów chorób mitochondrialnych, poszukiwaniem terapii, takich jak wzmacniacze mitochondriów lub łagodzenie bólu neuropatycznego.Na początek skalibruj czujniki tlenu, pipetując 2,1 mililitra buforu MR do każdej komory. Zamknij go korkami i wciągaj powietrze do komory, aż utworzy się pęcherzyk. Mieszaj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę w trybie kalibracji, aż strumień tlenu na masę ustabilizuje się.Za pomocą oprogramowania HRR wykonaj kalibrację powietrza polarograficznych czujników tlenu zgodnie z instrukcjami producenta. W celu przygotowania tkanki umieść nerw kulszowy na szalce Petriego z wystarczającą ilością buforu TP, aby go przykryć. Przytrzymaj jeden koniec nerwu kleszczami, a drugą parą kleszczy wyciągnij wiązki nerwowe poziomo.Najpierw przenieś wyświetlaną tkankę do małego naczynia zawierającego jeden mililitrowy bufor TP w celu przepuszczalności tkanek. Aby rozpocząć przepuszczalność, przenieś tkankę za pomocą kleszczy do innego naczynia zawierającego jeden mililitr buforu TP, zawierającego 50 mikrogramów na mililitr saponiny. Umieść płytkę w wytrząsarce do mikropłytek i delikatnie mieszaj przez 30 minut.Następnie przenieś tkankę za pomocą kleszczyków do świeżego naczynia zawierającego jeden mililitr buforu MR i delikatnie mieszaj przez 10 minut. Przenieś tkankę za pomocą kleszczy do skalibrowanej komory HRR. Napełnij komory HRR 2,1 mililitra buforu MR.Dodaj Amplex Red i peroksydazę do końcowego stężenia odpowiednio pięciu mikromoli i dwóch jednostek na mililitr. Następnie dodaj przepuszczalny nerw kulszowy. Zamocuj czujniki fluorescencyjne przyrządu.Następnie wyłącz światła w sekcji sterowania oprogramowania i kliknij połącz z oksygrafem"Przejdź do edycji protokołów"w oprogramowaniu i wprowadź masę tkanki. Przejdź do układu i wybierz konkretny strumień na jednostkę próbki"opcja. Następnie wybierz wykresy, aby jednocześnie uzyskać dostęp do odczytu zużycia tlenu i, jeśli to wymagane, do produkcji nadtlenku wodoru.Odczekaj około 10 minut. Wstrzyknąć dwa impulsy nadtlenku wodoru, każdy z nich do końcowego stężenia 260 mikromolów w celu kalibracji komory. Wstrzyknij 20 mikrolitrów bursztynianu, substratu mitochondrialnego kompleksu II, aby aktywować mitochondrialny system transportu elektronów.Dodaj 20 mikrolitrów ADP, aby aktywować syntezę ATP. Po kolei dodaj pięć mikrolitrów cytochromu c jako wskaźnik integralności błony. Miareczkować podwielokrotnościami 0,2 mikrograma na mililitr oligomycyny do momentu, gdy nie obserwuje się dalszego spadku zużycia tlenu.Miareczkować podwielokrotnościami 0,5 mikromola na litr FCCP, rozprzęgaczem mitochondriów, aż nie zaobserwuje się dalszego wzrostu zużycia tlenu. Aby zakończyć eksperyment, wstrzyknij dwa mikrolitry antymycyny A, wykonaj końcowe stężenie pięciu milimoli i poczekaj, aż przepływ się ustabilizuje. Przejdź do paska poleceń.Wyszukaj multisensoryczny"w oprogramowaniu. Kliknij kontrolę"następnie naciśnij Zapisz plik"i rozłączyć się. Otwórz zapisany plik i wybierz strumień tlenu na tacę masową, aby uzyskać eksperymentalne wyniki zużycia tlenu.Ręcznie wybierz okno między wstrzyknięciami, naciskając shift i lewy przycisk myszy. Przejdź do znaczników i wybierz statystyki, aby zwizualizować wyniki dla każdego wstrzyknięcia substratów, inhibitorów i protokołu rozprzęgania. W przypadku produkcji nadtlenku wodoru należy wykonać tę samą procedurę ze śladem nachylenia amperów.Spadek potencjału błonowego promowany przez aktywność sythazy ATP przyspieszał zużycie tlenu. Dodatek egzogennego cytochromu C sprzyjał jedynie minimalnej stymulacji oddychania, potwierdzając integralność błony zewnętrznej mitochondriów dla tego preparatu. Zarejestrowano bezwzględne przepływy tlenu i zaobserwowano tylko 6,3% wzrost oddychania, co świadczy o dobrej jakości preparatu tkankowego.Zużycie tlenu i produkcję ROS mierzono jednocześnie w obecności różnych substratów dostarczających paliwo do systemu transportu elektronów. Dodatek pirogronianu i jabłczanu do kompleksu mitochondrialnego I zwiększył oddychanie. Dalsze dodawanie bursztynianu do kompleksu II również zwiększa zużycie tlenu.W związku z tym można było testować inne podłoża. Wzrosła również produkcja ROS, co wskazuje na wyciek tlenu z systemu transportu elektronów. Dodanie difosforanu adenozyny w stężeniu nasycającym zwiększyło zużycie tlenu, napędzając tworzenie ATP i zmniejszając produkcję ROS.W przeciwieństwie do tego, miareczkowanie oligonucyklotyczne zmniejszyło zużycie tlenu i zwiększyło produkcję ROS. Sugerowało to, że permeablowany nerw kulszowy może replikować standardową relację w fizjologii mitochondriów. Dodatek FCCP i retinonu, dostosowany do oczekiwanych zmian strumienia tlenu, potwierdza, że fizjologia mitochondriów i profil bioenergetyczny zostały zachowane w permeablowanym nerwie kulszowym.Najważniejszym krokiem jest delikatne przygotowanie wycinka tkanki, upewnienie się, że wszystkie otwory komory są odpowiednio oczyszczone. Zmiany w funkcjonowaniu mitochondriów mogą być spowodowane dysfunkcją lub niższą liczbą mitochondriów. dlatego zaleca się potwierdzenie aktywności syntazy i zawartości mitochondrialnego DNA metodą PCR.

assessing-mitochondrial-function-sciatic-nerve-high-resolution

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Ocena fosforylacji oksydacyjnej za pomocą respirometrów o wysokiej rozdzielczości stała się integralną częścią analizy funkcjonalnej mitochondriów i metabolizmu energii komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokoły analizy metabolizmu energii komórkowej za pomocą respirometrów komorowych i mikropłytkowych o wysokiej rozdzielczości oraz omawiamy kluczowe zalety każdego urządzenia.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Konie mają wyjątkową zdolność do ćwiczeń aerobowych, co sprawia, że mięśnie szkieletowe koni są ważną tkanką zarówno do badania fizjologii ćwiczeń koni, jak i fizjologii mitochondriów ssaków. W artykule opisano techniki kompleksowej oceny funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni.

Fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości

Analiza funkcji mitochondriów plemników za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości pozwala na pomiar zużycia tlenu przez swobodnie poruszające się plemniki w systemie zamkniętym komorowym. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w plemnikach ludzkich, co dostarcza informacji na temat cech mitochondriów i integralności plemników.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w plemnikach ludzkich

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Metody badania bioenergetyki mitochondriów pod fizjologicznie istotnymi stężeniami substratów w komórkach odpornościowych są ograniczone. Zapewniamy szczegółowy protokół, który wykorzystuje fluorespirometrię o wysokiej rozdzielczości do oceny zmian w odpowiedzi potencjału błony mitochondrialnej na zapotrzebowanie na energię w ludzkich limfocytach T, monocytach i obwodowych komórkach jednojądrzastych.

Fluorespirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny dynamicznych zmian potencjału błony mitochondrialnej w ludzkich komórkach odpornościowych

Miejscowe wstrzyknięcia barwnika mitochondrialnego oznacza końcowe mitochondria komórek Schwanna in vivo do mikroskopii konfokalnej. Ta metoda wykorzystuje dowód koncepcji wykazany w tkance mięśniowej szkieletowej myszy ze zdrową lub chorą tkanką mięśniową, aby zapewnić wysoką rozdzielczość wizualizacji mitochondriów.

Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy

Poznaj metodę oceny funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości. Technika umożliwia jednoczesny pomiar zużycia tlenu i produkcji ROS w permeabilizowanej tkance nerwowej.

Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów