Name: Wykorzystanie obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury wewnętrznej błony mitochondrialnej w modelach komórek neuronalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj metodę obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury mitochondrialnej w neuronach szczura i komórkach SH-SY5Y. Technika ta umożliwia badanie dynamiki mitochondriów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pierwotne neurony hipokampa szczura zostały dostarczone przez Dr. George'a Lykotrafitisa i Shiju Gu z Wydziału Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie Connecticut (Storrs, CT, USA). Instrument Abberior STED znajdujący się w Zaawansowanym Zakładzie Mikroskopii Świetlnej w Centrum Otwartych Zasobów i Sprzętu Badawczego został zakupiony dzięki grantowi NIH S10OD023618 przyznanemu Christopherowi O'Connellowi. Badania te zostały sfinansowane z grantu NIH R01AG065879 przyznanego Nathanowi N. Alderowi.

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten przedstawia wykorzystanie ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y i pierwotnych neuronów hipokampa szczura z nowym barwnikiem PKMO ukierunkowanym na IMM do obrazowania żywych komórek STED. Ze względu na nowość PKMO, obecnie niewiele jest publikacji wykorzystujących ten barwnik do obrazowania na żywo chorób przenoszonych drogą płciową. Wykorzystanie tych typów komórek do obrazowania chorób przenoszonych drogą płciową stanowi wyzwanie, szczególnie dlatego, że komórki neuronalne mają węższe mitochondria. Jednym z ograniczeń tego protokołu jest zastosowany barwnik PKMO, ponieważ może on być toksyczny dla komórek. Różne komórki i linie komórkowe różnie reagują na barwnik, dlatego może być konieczne dostosowanie stężenia barwnika i czasu inkubacji w celu optymalizacji wyników pod kątem silnego sygnału bez uszkadzania komórek. Sugerowanym rozwiązaniem jest obniżenie stężenia i wydłużenie czasu barwienia63; Może to jednak skutkować gorszym wybarwieniem bez zwiększania żywotności komórek.
Podobnie jak PKMO, komercyjny barwnik Live Orange mito (Tabela Materiałów) również wykazuje pewną toksyczność komórkową. Barwnik ten był używany do różnych hodowanych komórek, ale nie był w stanie wykazać porównywalnego barwienia w komórkach SH-SY5Y zróżnicowanych RA, z powodzeniem o tych samych parametrach, co ich niezróżnicowane odpowiedniki (nasze niepublikowane obserwacje). Jednak podatne protokoły barwienia mogą być zoptymalizowane dla tej sondy i wybranych typów komórek. W przypadku tego barwnika zastosowano czasy bramkowania detektora od 1-1,05 do 7-7,05 ns, przy czym wszystkie inne parametry w tabeli 1 pozostały bez zmian. Ogólnie rzecz biorąc, barwienie komórek 200-250 nM Live Orange mito przez 45 minut dało porównywalne wyniki, jak wykazały wyniki PKMO. Barwienie o wyższym stężeniu przez krótszy czas lub barwienie o niższym stężeniu przez ten sam czas lub nieco dłużej może przynieść różne wyniki i może być korzystne dla innych typów komórek lub warunków wzrostu.
Obrazowanie pierwotnych neuronów hipokampa szczura różni się od komórek unieśmiertelnionych ze względu na charakter projekcji aksonów i dendrytów, a także rozmieszczenie mitochondriów w czasie obrazowania. Jedną z trudności w tej części protokołu jest to, że gęstość wysiewu określa, czy pierwotne kultury będą w stanie przylegać i zdrowo rosnąć, a przy wyższych gęstościach projekcje mają tendencję do przerastania do DIV 10. Dlatego mitochondria zobrazowane z tych pierwotnych neuronów prawdopodobnie będą pochodzić z ciała komórki, a nie z projekcji; Jednak pomyślny wzrost z niższej początkowej gęstości komórek daje lepsze wyniki obrazowania w późniejszym okresie wzrostu. Kluczem jest zapewnienie niskiego tła i nieostrego światła, aby uzyskać najlepszy kontrast dla STED. Aby rozwiać obawy dotyczące populacji komórek, hodowla pierwotnych komórek hipokampa w pożywkach wzrostu neuronów uzupełnionych witaminą B27 zapobiega wzrostowi komórek glejowych, a źródło podaje, że <5% komórek to astrocyty, a brak suplementu NbActiv1 w pożywce wzrostowej zmniejsza liczbę astrocytów w hodowlach do <2%87. Zarówno w przypadku hodowanych komórek SH-SY5Y, jak i pierwotnych neuronów hipokampa szczura, powłoka PDL używana do wzrostu przyczynia się do zamglenia tła na obrazach. Przy ustawieniach podanych w Tabeli 1 osiągnięto wystarczający stosunek sygnału do szumu, a dekonwolucja usuwa większość obserwowanego tła.
Oprócz omówionego tutaj obrazowania, możliwe jest również dodanie zabiegów lub stresu do komórek przed lub w trakcie obrazowania. Na przykład dodanie nadtlenku wodoru tert-butylu (tBHP) indukuje stres oksydacyjny i możliwe jest monitorowanie zmian w mitochondriach w czasie po dodaniu. Dodatek β amyloidu (Aβ) ze znacznikiem fluorescencyjnym pozwala na monitorowanie dystrybucji tego peptydu w stosunku do mitochondriów, a także struktury mitochondriów w czasie. Zdrowie mitochondriów jest silnie związane z chorobą Alzheimera i powszechnie uważa się, że odgrywa rolę w toksyczności Aβ 43,71,72. Warto zauważyć, że status różnicowania komórek SH-SY5Y wpływa na lokalizację prekursora białka Aβ (AβPP)85, a eksperymenty z użyciem AβPP powinny być starannie skonstruowane.
Jako przykład tego, jak można dostosować ten protokół, pokazano, że fluorescencyjny wariant Aβ(1-42)-HiLyte 647 można dodać do komórek barwionych PKMO 15 minut przed obrazowaniem (rysunek uzupełniający 1). Parametry obrazowania są podobne (tabela uzupełniająca 2), przy czym główna różnica polega na tym, że przy obrazowaniu węższych mitochondriów potrzebny jest mniejszy otwór. Obrazowanie Aβ-HiLyte647 za pomocą STED wymaga mniejszego ogólnego wzbudzenia (6%-8%) i wyczerpania STED (10%-12%) mocy lasera oraz mniejszej akumulacji (sześć). Wydłużono również bramkowanie detektora z 0,1 do 10 ns. Chociaż rozdzielczość STED Aβ nie jest konieczna, ogólny stosunek sygnału do szumu i wielkość cząstek Aβ w surowym STED były lepsze niż w przypadku obrazów konfokalnych, a późniejsza dekonwolucja może być również przeprowadzona. Zbieranie obrazów STED i dekonwolucja surowych projekcji z-stosu STED Aβ wydaje się szczególnie przydatne podczas łączenia z surowymi lub zdekonwolującymi obrazami STED plamy PKMO (rysunek uzupełniający 1B,C). Oba kanały zostały zebrane w jednym kroku klatki. Pomiary lokalizacji zależnej od czasu, podobne do tych wymienionych na rysunku 2 i pokazanych na rysunku 5, w stosownych przypadkach, oraz różnic w architekturze cristae można uzyskać po obróbce naprężeniowej lub innych dodatkach.
Inne możliwe metody podwójnego znakowania mitochondriów w żywych komórkach STED, które nie zostały tutaj zgłoszone, ale zostały zgłoszone przez innych, obejmują użycie białek znakowanych SNAP93, białek znakowanych Halo oraz stosowanie innych przepuszczalnych dla komórek barwników o celach ogólnych, takich jak mtDNA63. Warto zauważyć, że strategia znakowania SNAP i Halo wpływa na uzyskaną intensywność sygnału fluorescencji i długowieczność podczas obrazowania94. Ponadto, chociaż protokół ten przedstawia kilka przykładów analiz, które można zastosować do segmentacji mitochondriów, istnieje wiele innych analiz, które pakiety oprogramowania mogą wykonać na tych obrazach.

Mitochondria to organelle eukariotyczne pochodzenia endosymbiotycznego, które są odpowiedzialne za regulację kilku kluczowych procesów komórkowych, w tym pośredniego metabolizmu i produkcji ATP, homeostazy jonów, biosyntezy lipidów i programowanej śmierci komórki (apoptozy). Te organelle są topologicznie złożone, zawierają system podwójnej błony, który tworzy wiele podkompartmentów1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Zewnętrzna błona mitochondrialna (OMM) łączy się z cytozolem i ustanawia bezpośrednie kontakty między organellami2,3. Wewnętrzna błona mitochondrialna (IMM) jest membraną oszczędzającą energię, która utrzymuje gradienty jonów przechowywane głównie jako elektryczny potencjał błonowy (ΔΨm) w celu napędzania syntezy ATP i innych procesów wymagających energii4,5. IMM jest dalej podzielony na wewnętrzną błonę graniczną (IBM), która jest ściśle przylegająca do OMM, oraz wystające struktury zwane cristae, które są połączone błoną cristae (CM). Błona ta wyznacza najbardziej wewnętrzny przedział macierzy od przestrzeni wewnątrzkrystalicznej (ICS) i przestrzeni międzybłonowej (IMS).
Mitochondria mają dynamiczną morfologię opartą na ciągłych i zrównoważonych procesach rozszczepienia i fuzji, które są zarządzane przez mechanoenzymy nadrodziny dynamin6. Fuzja pozwala na zwiększenie łączności i tworzenie sieci siatkowatych, podczas gdy rozszczepienie prowadzi do fragmentacji mitochondriów i umożliwia usunięcie uszkodzonych mitochondriów przez mitofagię7. Morfologia mitochondriów różni się w zależności od typu tkanki8 i etapu rozwoju9 i jest regulowana, aby umożliwić komórkom dostosowanie się do czynników, w tym potrzeb energetycznych10,11 i stressors12. Standardowe cechy morfometryczne mitochondriów, takie jak zakres tworzenia sieci (połączone ze sobą vs. fragmentaryczne), obwód, obszar, objętość, długość (współczynnik proporcji), okrągłość i stopień rozgałęzienia, można zmierzyć i określić ilościowo za pomocą standardowej mikroskopii optycznej, ponieważ rozmiary tych cech są większe niż granica dyfrakcji światła (~200 nm)<klasa sup = "xref">13.
Architektura Cristae definiuje wewnętrzną strukturę mitochondriów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Różnorodność morfologii cristae można ogólnie podzielić na płaską (blaszkowatą lub dyskoidalną) lub rurkowo-pęcherzykową14. Wszystkie cristae łączą się w IBM za pomocą rurowych lub szczelinowych struktur zwanych połączeniami cristae (CJ), które mogą służyć do podziału IMS na ICS i IBM na CM15. Morfologia Cristae jest regulowana przez kluczowe kompleksy białkowe IMM, w tym (1) mitochondrialne miejsce kontaktu i system organizacji grzebiaków (MICOS), który znajduje się w CJ i stabilizuje kontakty IMM-OMM16, (2) GTPaza atrofii nerwu wzrokowego 1 (OPA1), która reguluje przebudowę cristae17,18,19, oraz (3) F1F O Syntaza ATP, która tworzy stabilizujące zespoły oligomeryczne na końcach cristae (CT)20,21. Ponadto IMM jest wzbogacony w niedwuwarstwowe fosfolipidy fosfatydyloetanoloaminę i kardiolipinę, które stabilizują wysoce zakrzywiony IMM22. Cristae są również dynamiczne, wykazując zmiany morfologiczne w różnych warunkach, takich jak różne stany metaboliczne23,24, z różnymi podłożami oddechowymi25, w warunkach głodu i stresu oksydacyjnego26,27, z apoptozą28,29, oraz z starzeniem się30. Ostatnio wykazano, że cristae mogą przechodzić poważne wydarzenia związane z przebudową w skali sekund, co podkreśla ich dynamiczną naturę31. Można określić ilościowo kilka cech cristae, w tym wymiary struktur w poszczególnych cristae (np. szerokość CJ, długość i szerokość cristae) oraz parametry, które wiążą poszczególne cristae z innymi strukturami (np. odstępy wewnątrz cristae i kąt padania cristae względem OMM)32. Te kwantyfikowalne parametry cristae wykazują bezpośrednią korelację z funkcją. Na przykład zakres produkcji ATP w mitochondriach jest dodatnio związany z obfitością cristae, określaną ilościowo jako gęstość cristae lub liczba cristae znormalizowana do innej cechy (np. cristae na obszar OMM)33,34,35. Ponieważ morfologia IMM jest definiowana przez cechy w nanoskali, obejmuje ultrastrukturę mitochondriów, która wymaga technik obrazowania zapewniających rozdzielczość większą niż granica dyfrakcji światła. Jak opisano poniżej, takie techniki obejmują mikroskopię elektronową i mikroskopię superrozdzielczą (nanoskopię).
Komórki nerwowe i glejowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) są szczególnie zależne od funkcji mitochondriów. Średnio mózg stanowi tylko 2% całkowitej masy ciała, ale wykorzystuje 25% całkowitego stężenia glukozy w organizmie i odpowiada za 20% zużycia tlenu przez organizm, co czyni go podatnym na zaburzenia metabolizmu energetycznego36. Postępujące choroby neurodegeneracyjne (ND), w tym choroba Alzheimera (AD), stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Huntingtona (HD), stwardnienie rozsiane (SM) i choroba Parkinsona (PD), są jednymi z najszerzej badanych patologii do tej pory, a wysiłki badawcze obejmują zrozumienie molekularnych podstaw tych chorób po poszukiwanie potencjalnej profilaktyki i interwencji terapeutycznych. ND są związane ze zwiększonym stresem oksydacyjnym pochodzącym częściowo z reaktywnych form tlenu (ROS) generowanych przez mitochondrialny łańcuch transportu elektronów (ETC)37, a także ze zmienionym mitochondrialnym przetwarzaniem wapnia38 i mitochondrialnym metabolizmem lipidów39. Tym fizjologicznym zmianom towarzyszą zauważone defekty w morfologii mitochondriów, które są związane z AD40,41,42,43,44, ALS45,46, HD47,48,49, MS50, oraz PD51,52,53. Te wady strukturalne i funkcjonalne mogą być sprzężone złożonymi relacjami przyczynowo-skutkowymi. Na przykład, biorąc pod uwagę, że morfologia cristae stabilizuje enzymy OXPHOS54, mitochondrialne ROS są nie tylko generowane przez ETC, ale także działają w celu uszkodzenia infrastruktury, w której znajduje się ETC, promując cykl ROS, który zwiększa podatność na uszkodzenia oksydacyjne. Ponadto wykazano, że dezorganizacja cristae uruchamia procesy, takie jak uwalnianie mitochondrialnego DNA (mtDNA) i szlaki zapalne związane z zaburzeniami autoimmunologicznymi, metabolicznymi i związanymi z wiekiem55. Dlatego analiza struktury mitochondriów jest kluczem do pełnego zrozumienia ND i ich molekularnych podstaw.
Popularne metody przeglądania cristae, w tym transmisyjna mikroskopia elektronowa, tomografia elektronowa i krioelektronowa tomografia (cryo-ET), oraz tomografia rentgenowska, w szczególności kriomiękka tomografia rentgenowska, ujawniły ważne odkrycia i działają z różnymi typami próbek56,57,58,59,60. Pomimo ostatnich postępów w kierunku lepszej obserwacji ultrastruktury organelli, metody te nadal wiążą się z zastrzeżeniem polegającym na wymaganiu utrwalenia próbki, a zatem nie mogą bezpośrednio uchwycić dynamiki grzebieniaków w czasie rzeczywistym. Mikroskopia fluorescencyjna o wysokiej rozdzielczości, szczególnie w postaci mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SIM), stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (STORM), mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywem (PALM), mikroskopii ekspansyjnej (ExM) i mikroskopii wymuszonego zubożenia emisji (STED), stały się popularnymi sposobami oglądania struktur wymagających rozdzielczości poniżej granicy dyfrakcji, która ogranicza klasyczne metody mikroskopii optycznej. Gdy ExM jest używany w połączeniu z inną techniką super-rozdzielczości, wyniki są imponujące, ale próbka musi być utrwalona i wybarwiona w gel61. Dla porównania, SIM, PALM/STORM i STED zostały z powodzeniem wykorzystane w przypadku żywych próbek, a nowe i obiecujące barwniki, które zazwyczaj barwią IMM, zapewniają nowatorskie i łatwe podejście do obrazowania na żywo dynamiki mitochondriów grzebienia62,63,64,65,66. Ostatnie postępy w dziedzinie żywych barwników do obrazowania chorób przenoszonych drogą płciową poprawiły jasność i fotostabilność barwnika, a barwniki te są ukierunkowane na IMM z wyższym stopniem swoistości niż ich poprzednicy. Osiągnięcia te pozwalają na gromadzenie długoterminowych eksperymentów poklatkowych i z-stack z obrazowaniem w superrozdzielczości, otwierając drzwi do lepszej analizy ultrastruktury i dynamiki mitochondriów na żywo w komórkach.
Tutaj, dostępne są protokoły obrazowania żywych komórek niezróżnicowanych i zróżnicowanych komórek SH-SY5Y barwionych barwnikiem PKmito Orange (PKMO) przy użyciu STED63. Linia komórkowa SH-SY5Y jest trzykrotnie subklonowaną pochodną macierzystej linii komórkowej SK-N-SH, wygenerowaną z biopsji szpiku kostnego nerwiaka zarodkowego z przerzutami67,68,69,70. Ta linia komórkowa jest powszechnie stosowanym modelem in vitro w badaniach ND, szczególnie w chorobach takich jak AD, HD i PD, w których dysfunkcja mitochondriów jest silnie zaangażowana10,43,71,72,73. Zdolność do różnicowania komórek SH-SY5Y w komórki o fenotypie neuronalnym poprzez manipulowanie pożywkami hodowlanymi okazała się odpowiednim modelem do badań neurobiologicznych bez polegania na pierwotnych komórkach neuronalnych10,74. W tym protokole kwas retinowy (RA) dodano do pożywki do hodowli komórkowej w celu wywołania różnicowania komórek SH-SY5Y. RZS jest pochodną witaminy A i wykazano, że reguluje cykl komórkowy i promuje ekspresję czynników transkrypcyjnych, które regulują różnicowanie neuronów75. Dostępny jest również protokół hodowli i obrazowania żywych komórek neuronów wyizolowanych z hipokampa szczura. Wykazano, że hipokamp jest dotknięty zwyrodnieniem mitochondriów i wraz z korą odgrywa ważną rolę w starzeniu się i ND76,77,78,79,80.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,4% Błękit trypanowy</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Trypsyna-EDTA, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>100 X antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>100 X/1,40 UPlanSApo olejek immersyjny</td><td>Olympus</td><td></td><td>Wyposażony w mikroskop Olympus IX83 do STED konfiguracja opisana w sekcji 4</td></tr><tr><td>Kwas all-trans-retinowy</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Amyloid-&beta; (1-42, HiLyte Fluor647, 0,1 mg)</td><td>AnaSpec</td><td>AS-64161</td><td>Dostępne inne koniugaty fluorescencyjne</td></tr><tr><td>Suplement B27 (50 X), bez surowicy</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek (Countess II FL)</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5804-R</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka licznikowe</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Rurki stożkowe (15 mL)</td><td>Thermo Kuwety Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>(ogniwa kwarcowe)</td><td>Starna Cells, Inc.</td><td>9-Q-10</td><td>Używany ze spektrometrem opisanym w sekcji 1.3</td></tr><tr><td>DMEM (wysoki poziom glukozy z pirogronianem sodu)</td> <td>Gibco</td><td>11995073</td><td>Stosowany do materiałów komórkowych SH-SY5Y zgodnie z opisem w sekcji 1</td></tr><tr><td>DMEM (wysoka glukoza bez pirogronianu sodu)</td> <td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Stosowany do pierwotnych materiałów komórkowych zgodnie z opisem w sekcji 2</td></tr><tr><td>DMEM (bez czerwieni fenolowej)</td> <td>Gibco</td><td>31053028</td><td>Używany do obrazowania zgodnie z opisem w Sekcja 3</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNAaza I z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>Stosowana do pierwotnych materiałów komórkowych, jak opisano w sekcjach 2.2.1 i 2.2.2</td></tr><tr><td>DPBS (bez wapnia, bez magnezu)</td> <td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>E18 Hipokamp Szczura Tkanka</td><td>transnetyx</td><td>SDEHP</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (200 dowodów)</td><td>Bioodczynniki</td> <td>Fisher</td><td></td>BP28184</tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS), nieinaktywowana termicznie</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>Dla komórek hodowanych, w sekcji 1</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (inaktywowana termicznie)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Dla pierwotnej hodowli komórkowej, sekcja 2</td></tr><tr><td>Jednostka sterylizacji filtra (0,1 &mikro; m, 500 mL)</td> <td>Wtyczka Thermo Fisher Scientific</td><td>5660010</td><td></td></tr><tr><td>FIJI (Is Just ImageJ) i Trainable Weka Segmentation (TWS)</td> <td>--</td><td>-- Bezpłatne</td> <td>oprogramowanie do analizy obrazów typu open source, które zawiera wtyczki, w tym Trainable Weka Segmentation opisane w sekcji 5; Wtyczka TWS od odnośnika 90 tekstu głównego</td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX (100 X)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Suplement glutaminy stosowany do pierwotnych materiałów komórkowych opisanych w sekcji 2.1.2</td></tr><tr><td>Komory liczące Hausser Scientific bright-Line i Hy-Lite</td><td>Hausser Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (bez wapnia, bez magnezu)</td><td>Gibco</td><td>14170120</td><td>Stosowany do pierwotnych materiałów komórkowych opisanych w sekcjach 2.2.1 i 2.2.2</td></tr> Oprogramowanie do dekonwolucji <tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Professional (V. 20.10)</td><td>Scientific Volume Imaging (SVI)</td> <td>-</td> <td>Oprogramowanie do dekonwolucji używane w tym protokole i opisane w sekcji 5</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony IX83 z ciągłym autofokusem</td><td>Olympus</td> <td>-</td> <td>W tym artykule wykorzystano system STED Infinity Line zbudowany wokół mikroskopu odwróconego Olympus IX83, opisanego w sekcji 4</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Lightbox (V. 16.3.16118)</td><td>Abberior</td><td>—</td><td>Oprogramowanie dostawcy używane do akwizycji obrazu STED, opisane w sekcji 4</td></tr><tr><td>Live Orange Mito dye</td><td>Abberior</td><td>LVORANGE-0146-30NMOL</td><td>Barwnik ukierunkowany na IMM do obrazowania żywych komórek opisany w Dyskusja</td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Stosowany do pierwotnych materiałów komórkowych, o których mowa w sekcji 2.1.2</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II 2-komorowa szklana pokrywowa</td><td>Nunc</td><td>155379</td><td>Można kupić różne komory, ale upewnij się, że szkło nakrywkowe to #1.5</td></tr><tr><td>Pipety Pasteura (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22183632</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKmito Pomarańczowy barwnik</td><td>Spirochrome</td><td>SC053</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>A3890401</tr><tr><td>SH-SY5Y Linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>CRL2266</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td> <td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Stosowany do pierwotnych materiałów komórkowych opisanych w sekcji 2</td></tr><tr><td>Spektrometr (GENESYS 180 UV-Vis)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840309000</td><td></td></tr><tr><td>STED Expert Line Mikroskop</td><td>Abberior</td><td>--</td><td>Konfigurację STED można dostosować, ale w momencie zakupu instrument był uważany za Abberior' s Linia ekspercka; Krótki opis konfiguracji jest dostępny w sekcji 4 protokołu</td></tr><tr><td>Kolba T25 (z powłoką TC, nasadka filtra)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>156367</td><td>Dostępne inne naczynia hodowlane i rozmiary</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie obrazowania sted na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury wewnętrznej błony mitochondrialnej w modelach komórek neuronalnych

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Mitochondria odgrywają wiele istotnych ról w komórce, w tym produkcję energii, regulację homeostazyCa2+, biosyntezę lipidów i produkcję reaktywnych form tlenu (ROS). Te procesy za pośrednictwem mitochondriów odgrywają wyspecjalizowane role w neuronach, koordynując metabolizm tlenowy w celu zaspokojenia wysokiego zapotrzebowania energetycznego tych komórek, modulując sygnalizację Ca2 +, dostarczając lipidy do wzrostu i regeneracji aksonów oraz dostrajając produkcję ROS do rozwoju i funkcji neuronów. Dysfunkcja mitochondriów jest zatem głównym czynnikiem powodującym choroby neurodegeneracyjne. Struktura i funkcja mitochondriów są ze sobą nierozerwalnie związane. Złożona morfologicznie błona wewnętrzna z fałdami strukturalnymi zwanymi cristae kryje w sobie wiele systemów molekularnych, które wykonują procesy sygnaturowe mitochondrium. Cechy architektoniczne membrany wewnętrznej są ultrastrukturalne i dlatego zbyt małe, aby można je było uwidocznić za pomocą tradycyjnej mikroskopii rozdzielczej o ograniczonej dyfrakcji. Tak więc większość spostrzeżeń na temat ultrastruktury mitochondriów pochodzi z mikroskopii elektronowej na utrwalonych próbkach. Jednak nowe technologie w mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości zapewniają obecnie rozdzielczość do dziesiątek nanometrów, umożliwiając wizualizację cech ultrastrukturalnych w żywych komórkach. Obrazowanie w superrozdzielczości oferuje zatem bezprecedensową możliwość bezpośredniego obrazowania drobnych szczegółów struktury mitochondriów, rozkładu białek w nanoskali i dynamiki cristae, dostarczając fundamentalnych nowych informacji, które łączą mitochondria ze zdrowiem i chorobami człowieka. Protokół ten przedstawia zastosowanie mikroskopii superrozdzielczej ze sterowanym zubożeniem emisji (STED) do wizualizacji ultrastruktury mitochondriów żywych ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego i pierwotnych neuronów szczurów. Procedura ta jest podzielona na pięć sekcji: (1) wzrost i różnicowanie linii komórkowej SH-SY5Y, (2) izolacja, posiew i wzrost pierwotnych neuronów hipokampa szczura, (3) procedury barwienia komórek do obrazowania żywych komórek STED, (4) procedury eksperymentów z żywymi komórkami STED przy użyciu mikroskopu STED jako odniesienie oraz (5) wytyczne dotyczące segmentacji i przetwarzania obrazu na przykładach do pomiaru i ilościowego określenia cech morfologicznych błony wewnętrznej.

Niniejszy protokół opisuje warunki wzrostu komórek hodowlanych i pierwotnych, ze szczególnym uwzględnieniem obrazowania żywych komórek metodą STED oraz późniejszych analiz grzebieni mitochondrialnych. Projekcje mitochondriów z niezdiferencjowanych komórek SH-SY5Y (Rycina 3A) i komórek SH-SY5Y zróżnicowanych za pomocą RA (Rycina 3B), wykonane w programie ImageJ, mogą być gromadzone jako stosy z-stack za pomocą tradycyjnego mikroskopu konfokalnego oraz STED, a surowe obrazy STED mogą być następnie poddane dekonwolucji. Możliwe jest również obrazowanie w trybie timelapse, a następnie dekonwolucja uzyskanych danych (Rycina 3C,D). Przy zastosowaniu nieco innych parametrów obrazowania dla pierwotnych neuronów hipokampa szczura (Tabela 1), obrazy konfokalne i surowe obrazy STED mogą być pozyskiwane jako stosy z-stack, a surowe obrazy STED mogą być poddane dekonwolucji (Rycina 4A). Możliwe jest również obrazowanie timelapse mitochondriów z neuronów pierwotnych (Rycina 4B). Generalnie, obrazy timelapse powinny być w stanie ukazać dynamiczne zdarzenia mitochondrialne.
Gdy surowe projekcje stosu z obrazowania STED oraz zdekonwolucyjne projekcje stosu z obrazowania STED z próbek wykorzystywanych do segmentacji wydają się spójne, przeprowadza się pomiary ilościowe. Wtyczka TWS wykorzystuje zdekonwolucyjny obraz STED do segmentacji w celu stworzenia maski prawdopodobieństwa, która służy następnie do utworzenia maski binarnej grzebieni (cristae) w celu uzyskania parametrów wielkości i kształtu (Rysunek 5A). Obszary z tej maski są zapisywane w menedżerze ROI i mogą zostać – w razie potrzeby – naniesione na surowy obraz STED, aby zmierzyć różnice w intensywności względnej. Zdekonwolucyjne projekcje STED mogą być również wykorzystane do określenia okresowości i gęstości grzebieni w danym obszarze (Rysunek 5B).
<img alt="Schemat mitochondrium z oznaczeniami grzebieni, macierzy i błon; badanie oddychania komórkowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Morfologia mitochondrium. Mitochondria posiadają dwubłonowy układ, który wyznacza różne podprzedziały (A). Grzebienie są fałdami błony wewnętrznej o określonych cechach (B). Skróty: OMM, zewnętrzna błona mitochondrialna; ICS, przestrzeń wewnątrzgrzebieniowa; IMS, przestrzeń międzybłonowa; CM, błona grzebieni; IBM, wewnętrzna błona graniczna; IMM, wewnętrzna błona mitochondrialna; CT, wierzchołek grzebienia; CJ, złącze grzebienia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat obrazowania komórek z wykorzystaniem mikroskopii STED; przedstawia etapy analizy mitochondriów i przetwarzania obrazów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat przepływu pracy. Komórki SH-SY5Y lub pierwotne neurony hipokampa szczura są hodowane na szkiełkach podstawkowych pokrytych PDL. Komórki SH-SY5Y są hodowane równolegle, aby pozostać niezróżnicowane lub są poddawane różnicowaniu za pomocą RA przez okres sześciu dni. Pierwotne neurony hipokampa szczura były hodowane na szkiełkach podstawkowych pokrytych PDL przez siedem dni po wyizolowaniu z przekrojów hipokampa. Po przygotowaniu do obrazowania, komórki zostały zabarwione PKMO i obrazowane za pomocą STED. Surowe obrazy STED są następnie poddawane dekonwolucji, a obrazy zdekonwolucjonowane są przetwarzane w programie FIJI w celu uzyskania pomiarów wielkości i kształtu, takich jak gęstość grzebieni, powierzchnia, obwód, kołowość i współczynnik proporcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia STED, konfokalna vs STED, komórki nieróżnicowane vs różnicowane, obrazowanie time-lapse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Obrazowanie mitochondriów w komórkach SH-SY5Y. Przedstawiono reprezentatywne projekcje stosów obrazów z (z-stack) dla mikroskopii konfokalnej (lewo), surowego STED (środek) oraz STED po dekonwolucji Huygens (prawo) dla mitochondriów z nieróżnicowanych (A) i różnicowanych kwasem retinowym (RA) (B) komórek SH-SY5Y z barwieniem PKMO. Pokazano obrazowanie time-lapse z odstępami 30 s i 5 iteracjami dla różnicowanych RA komórek SH-SY5Y (C) z powiększeniem wybranych obszarów (białe ramki) (D) przy użyciu skalowanych obrazów tych obszarów bez interpolacji. Paski skali: A,B, 250 nm; C,D, 1 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie mikroskopii STED: konfokalna, surowa STED, dekonwolucja; dynamika strukturalna w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obrazowanie mitochondriów w pierwotnych neuronach hipokampa szczura. Przedstawiono reprezentatywne projekcje stosów obrazów z (z-stack) w mikroskopii konfokalnej (lewo), surowe obrazy STED (środek) oraz obrazy STED po dekonwolucji w programie Huygens (prawo) obrazujące mitochondria z pierwotnych neuronów hipokampa szczura (A). Przedstawiono timelapse mitochondriów w tych neuronach z odstępami 25 s i 5 iteracjami (B). Paski skali: A, 250 nm; B, 1 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz procesu dekonwolucji; obejmuje analizę mikroskopową, mapę prawdopodobieństwa, maskę, ROI, wartości szarości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Przetwarzanie dekonwolwowanych obrazów STED w programie ImageJ. Przedstawiono reprezentatywny przykład użycia wtyczki Trainable Weka Segmentation do pomiaru wielkości i kształtu grzebieni (A). Od lewej do prawej pokazano następujące obrazy: dekonwolwowany obraz STED, mapę prawdopodobieństwa opartą na segmentacji z wtyczki TWS, maskę uzyskaną poprzez progowanie w FIJI z wykorzystaniem mapy prawdopodobieństwa jako danych wejściowych, maskę z obrysowanymi obszarami ROI oraz ROI nałożone na oryginalny dekonwolwowany obraz STED. Wynikowe pomiary pola, obwodu, kolistości i współczynnika kształtu odpowiadające tym obiektom znajdują się w Tabeli uzupełniającej 1. Przedstawiono wykres liniowy z wykorzystaniem dekonwolwowanego obrazu STED do pomiaru odległości szczyt-szczyt jako wskaźnika gęstości grzebieni (B). Paski skali: 0.5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rozmiar piksela (nm)</td>
			<td>Czas przebywania (µs)</td>
			<td>Linia acc.</td>
			<td>pobudzenie 561 nm podczas akwizycji STED (%)</td>
			<td>moc wygaszania STED 775 nm (%)</td>
			<td>Wielkość kroku (nm)</td>
			<td>Apertura punktowa (AU)</td>
			<td>Interwał timelapse (s)</td>
			<td>Iteracje timelapse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nieróżnicowane komórki SH-SY5Y</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y zróżnicowane za pomocą RA</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurony pierwotne</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">UWAGA: Rozmiar piksela może się różnić w zależności od wymagań obrazowania oraz zamiaru przeprowadzenia dekonwolucji obrazów. Do dekonwolucji wymagane jest prawidłowe próbkowanie. Rozmiary pikseli dla surowych obrazów STED bez dekonwolucji mogą wynosić do 30 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Podsumowanie parametrów akwizycji STED. Przedstawiono ustawienia stosowane podczas obrazowania 2D STED dla każdego typu komórek: niedróżnicowanych SH-SY5Y, różnicowanych RA SH-SY5Y oraz pierwotnych neuronów hipokampa szczura. Dla wszystkich pomiarów time-lapse wykonano 5 iteracji w zmiennych odstępach czasu, zależnie od wielkości ROI.
Rycina uzupełniająca 1: Obrazowanie komórek SH-SY5Y po dodaniu amyloidu-β (Aβ). Przedstawiono reprezentatywne obrazy konfokalne (lewo), surowe obrazy STED (środek) oraz zdekonwolucyjne obrazy STED (prawo) komórek SH-SY5Y zróżnicowanych za pomocą RA z barwieniem PKMO (góra) i Aβ-HiLyte647 (dół) (A). Pokazano połączone projekcje stosów z-stack surowego obrazu STED PKMO (zielony) z surowym obrazem STED Aβ (magenta) (B) lub zdekonwolucyjnego obrazu STED PKMO (zielony) ze zdekonwolucyjnym obrazem STED Aβ (magenta) (C). Paski skali: 0.5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Pomiary rozmiaru i kształtu segmentowanych grzebieni. Przedstawiono pomiary rozmiaru i kształtu obszaru (µm2), obwodu (µm), kołowości oraz współczynnika proporcji (aspect ratio), odpowiadające obiektom zaznaczonym na Ryc. 5A w segmentowanych mitochondriach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Podsumowanie parametrów akwizycji dla próbek amyloid-β. Przedstawiono ustawienia wykorzystane do obrazowania 2D STED PKMO i Aβ-HiLyte647 w nieróżnicowanych oraz różnicowanych w kierunku RA komórkach SH-SY5Y. Obrazowanie konfokalne Aβ-HiLyte647 może być stosowane samodzielnie, ponieważ nie ma tam specyficznej struktury do rozdzielenia; obrazy STED Aβ-HiLyte647 pokazano tutaj dla mniejszych rozmiarów cząsteczek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Protokół traktowania amyloidem-β. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół przedstawia proces propagacji, różnicowania i barwienia hodowanych komórek SH-SY5Y oraz pierwotnych neuronów hipokampa szczura do wizualizacji i analizy ultrastruktury mitochondriów za pomocą mikroskopii stymulowanego zubożenia emisji (STED).

Wykorzystanie obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury wewnętrznej błony mitochondrialnej w modelach komórek neuronalnych

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

Nasz program badawczy koncentruje się na strukturalnych i funkcjonalnych aspektach mitochondriów, szczególnie w odniesieniu do dysfunkcji związanych ze starzeniem się. W tym celu wykorzystujemy szeroki wachlarz technik biofizycznych, biochemicznych i strukturalnych, aby zbadać podstawowe mechanizmy starzenia się mitochondriów i opracować interwencje terapeutyczne w celu zachowania i przywrócenia zdrowia mitochondriów. Funkcja i struktura mitochondriów są ze sobą nierozerwalnie związane.Standardowe techniki mikroskopii świetlnej są odpowiednie do pomiaru cech mitochondriów na dużą skalę, takich jak podstawowa morfologia i struktury sieciowe. Analiza ultrastruktury mitochondriów lub cech wymagających wyższej rozdzielczości niż zapewnia tradycyjna mikroskopia optyczna jest zwykle wykonywana przy użyciu mikroskopii elektronowej lub tomografii na utrwalonych próbkach. Mikroskopia superrozdzielcza to technika obrazowania oparta na fluorescencji, która mierzy cechy wykraczające poza granicę dyfrakcji.W przypadku mitochondriów obejmuje to pomiary rozmieszczenia białek w nanoskali i architektury cristae. Opisany tutaj protokół obrazowania STED pozwala naukowcom zmierzyć szczegółową strukturę błony wewnętrznej w żywych komórkach. Obrazowanie chorób przenoszonych drogą płciową z żywych komórek pozwala nam obserwować i ilościowo analizować złożone cechy grzebieniaków w fizjologicznie istotnych warunkach bez konieczności fiksacji próbki.Dostarczy to naukowcom nowych informacji na temat dynamicznych zmian zachodzących w cechach ultrastrukturalnych i ich czasowych reakcjach na stresory i związki farmakologiczne. Na początek szybko rozmrozić zamrożony zapas komórek SH-SY5Y w FBS uzupełnionym 10% DMSO i rozcieńczyć dziesięciokrotnie podgrzanym podłożem. Następnie odwirować komórki i usunąć supernatant.Zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach wstępnie podgrzanego podłoża i komórek nasiennych w kolbie T25. Aby przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte PDL, należy nałożyć 600 mikrolitrów po 50 mikrogramów na mililitr roztworu PDL do każdego dołka sterylnych szkiełek nakrywkowych z komorą. Objętość PDL dodawana do każdej studzienki różni się w zależności od wielkości studni.Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po inkubacji usunąć roztwór PDL i trzykrotnie przepłukać szkiełko nakrywkowe 1,8 mililitra wody destylowanej. Pozostaw powlekaną komorę do wyschnięcia na powietrzu przez dwie godziny.Gdy komórki SH-SY5Y osiągną 80 do 90% współpłynności, oddziel je, dodając roztwór trypsyny. Zneutralizuj trypsynę, dodając podgrzane podłoże DMEM. Odwirować zawiesinę komórek i ponownie zawiesić osad w DMEM.Policz komórki w automatycznym liczniku komórek. Następnie zasiaj komórki o gęstości 1,5 razy 10 do 4 komórek na centymetr kwadratowy na pokrytym PDL szkle nakrywkowym. W pierwszym i trzecim dniu zastąp pożywkę DMEM uzupełnionym odpowiednio 5 lub 2% FBS, 1% antybiotykowym środkiem przeciwgrzybiczym i 10 mikromolowym RZS lub 95% etanolem o tej samej objętości dodatku, aby służyć jako kontrola nośnika do różnicowania.Przygotuj zapas PKMO we wstępnie podgrzanym DMEM wolnym od czerwieni fenolowej uzupełnionym 2 lub 10% FBS, w zależności od stanu różnicowania, 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego i 20 milimolowych HEPES. Szóstego dnia przepłucz komórki dwukrotnie pożywką obrazową i inkubuj komórki z roztworem PKMO w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. Po barwieniu przepłucz komórki trzykrotnie podgrzanym podłożem do obrazowania.Do końcowego prania inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po inkubacji należy zastąpić końcowe płukanie świeżym, wstępnie podgrzanym podłożem obrazowym zawierającym 20 milimolowych HEPES. Otwórz oprogramowanie Lightbox w celu pobrania obrazu.Aby wybrać zestaw lasera i filtrów, użyj parametrów dla barwnika pomarańczowego, wybierając barwnik użyty w barwieniu z listy barwników. Korzystając z przeglądu, kliknij NA ŻYWO, aby skupić się na komórkach. Gdy komórki są już ostre, dostosuj ustawienia akwizycji konfokalnej.Następnie wybierz prostokątny przycisk ROI i utwórz obszar zainteresowania wokół interesujących mitochondriów, klikając i przeciągając, aby ukształtować region. Aby dostosować bramkowanie detektora pod kątem wymuszonego wyczerpywania się emisji lub akwizycji STED, obok menu OGÓLNE wybierz menu BRAMKOWANIE lub kliknij i przytrzymaj, aby dodać menu do widoku. W przypadku akwizycji STED ustaw laser wzbudzający na 15 do 20%, a laser zubożający STEP na 20 do 25% z 10 akumulacjami linii.Użyj czasu zatrzymania piksela wynoszącego cztery mikrosekundy i rozmiaru piksela od 20 do 25 nanometrów. Wykonaj upływ czasu, wybierając menu rozwijane Czas, a następnie ustawiając liczbę iteracji na pięć i interwał czasu 25 lub 30 sekund. Stos Z można wykonać za pomocą opcji Głośność i dostosować żądany zakres głośności Z i rozmiar kroku.Otwórz oprogramowanie do dekonwolucji obrazów STED, aby zdekonwoluować surowe obrazy STED za pomocą algorytmu oprogramowania. Po upewnieniu się, że parametry mikroskopowe są prawidłowe, wybierz przycisk Ekspresowy i ustaw typ dekonwolucji na Szybki, Standardowy, Agresywny lub Konserwatywny dla różnych stopni mocy dekonwolucji. Wykonaj dekonwolucję.Zapisz obrazy w formacie ICS2 Na obrazie J kliknij Plik, a następnie Otwórz, aby otworzyć pliki ics2 z oprogramowania do dekonwolucji. Wybierz Wtyczki, następnie Segmentacja, a następnie Trainable Weka Segmentation, aby otworzyć zdekonwolucyjne obrazy STED we wtyczce Trainable Weka Segmentation. W ustawieniach segmentacji wybierz funkcje Rozmycie gaussowskie, Projekcje membranowe i filtr Sobel.Oznacz jedną klasę jako Cristae, a drugą jako Tło. Następnie narysuj linię nad strukturą, którą chcesz przypisać do dowolnej klasy. Następnie wybierz przycisk Dodaj po prawej stronie dla Cristae lub Tło.Następnie wybierz przycisk Train classifier po lewej stronie, aby wygenerować mapę na podstawie informacji dostarczonych do wtyczki. Kliknij przycisk Zapisz klasyfikator, aby zapisać ustawienia klasyfikatora do przyszłej segmentacji. Użyj mapy prawdopodobieństwa Cristae, aby określić próg obrazu na obrazie J, aby wygenerować maskę binarną, a następnie przejdź do pozycji Analizuj, a następnie Analizuj cząstki.Na koniec narysuj linię wielopunktową, dostosuj grubość linii do szerokości kilku pikseli i splajn linii, aby pasowała do mitochondriów. W tym badaniu pokazano obrazowanie mitochondriów w niezróżnicowanych, zróżnicowanych kwasem retinowym komórkach SH-SY5Y z obrazowaniem poklatkowym. Zdekonwolucyjne obrazy STED mogą być wykorzystane do określenia okresowości cristae w danym obszarze oraz pomiarów wielkości i kształtu cristae.

using-live-cell-sted-imaging-to-visualize-mitochondrial-inner

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W niniejszym materiale opisujemy protokół obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w hodowlach neuronów z wykorzystaniem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy.

Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Opisujemy protokół umożliwiający obrazowanie mitochondriów w żywych neuronach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez dłuższy czas. Obrazowanie w wydłużonych przedziałach czasowych osiągnięto dzięki ekspresji białka fluorescencyjnego skierowanego do mitochondriów za pomocą lentiwirusa oraz zastosowaniu niedrogiego inkubatora nakładanego na stolik mikroskopu, który został zaprojektowany i zbudowany w naszym laboratorium.

Neuromodulacja i transport mitochondriów: obrazowanie żywych neuronów hipokampa w długich odstępach czasu

Źródło: Kennedy, L. H., et. al. Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje obrazowanie mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu myszy. Plaster umieszcza się w komorze kąpielowej z ciągłą cyrkulacją płynu i kontrolowaną temperaturą. Po ustawieniu różnych parametrów mikroskopu konfokalnego wykonywane są obrazy...

Obrazowanie konfokalne ruchu mitochondriów w oligodendrocytach w organotypowych kulturach wycinków mózgu

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Ten proctocol ma na celu dostarczenie metody obrazowania in vitro i in vivo mitochondrialnego Ca2+ w astrocytach i neuronach.

Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2+ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI)

Ten artykuł opisuje metodę mitochondrialnego obrazowania poklatkowego kultur astrocytów wyposażonych w biosensor MitoTimer i wynikową wieloparametryczną analizę dynamiki mitochondriów, mobilności, morfologii, biogenezy, stanu redoks i obrotu.

Obrazowanie na żywo układu mitochondrialnego w hodowanych astrocytach

Ten artykuł opisuje protokół do określania różnic w podstawowym stanie redoks i redoks odpowiedzi na ostre perturbacje w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej za pomocą konfokalnej mikroskopii na żywo. Protokół może być stosowany do innych typów komórek i mikroskopów przy minimalnych modyfikacjach.

Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Ten protokół opisuje, jak zrekonstruować grzebienie mitochondrialne, aby uzyskać obrazowanie 3D z wysoką dokładnością, wysoką rozdzielczością i wysoką przepustowością.

Trójwymiarowa technika wizualizacji ultrastrukturalnych zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki

Barwniki FM okazały się nieocenioną pomocą w zrozumieniu dynamiki synaptycznej. Barwniki FM są zazwyczaj śledzone pod mikroskopem fluorescencyjnym w różnych warunkach stymulacji. Jednakże fotokonwersja barwników FM w połączeniu z mikroskopią elektronową umożliwia wizualizację odrębnych pul pęcherzyków synaptycznych, a także innych komponentów ultrastruktury, w pączkach synaptycznych.

Badanie pul pul pęcherzyków synaptycznych z wykorzystaniem fotokonwersji barwników styrylowych

Opracowaliśmy program komputerowy do analizy morfologii neuronów. W połączeniu z dwoma istniejącymi narzędziami analitycznymi o otwartym kodzie źródłowym, nasz program przeprowadza analizę Sholla oraz określa liczbę neurytów, punktów rozgałęzień i zakończeń neurytów. Analizy są wykonywane w taki sposób, aby można było obserwować lokalne zmiany w morfologii neurytów.

Zautomatyzowana analiza Sholla zdigitalizowanej morfologii neuronów w wielu skalach

Poznaj metodę obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury mitochondrialnej w neuronach szczura i komórkach SH-SY5Y. Technika ta umożliwia badanie dynamiki mitochondriów w czasie rzeczywistym.

Wykorzystanie obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury wewnętrznej błony mitochondrialnej w modelach komórek neuronalnych (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury wewnętrznej błony mitochondrialnej w modelach komórek neuronalnych

Przeglądaj więcej filmów