Wykorzystanie obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury wewnętrznej błony mitochondrialnej w modelach komórek neuronalnych

Nasz program badawczy koncentruje się na strukturalnych i funkcjonalnych aspektach mitochondriów, szczególnie w odniesieniu do dysfunkcji związanych ze starzeniem się. W tym celu wykorzystujemy szeroki wachlarz technik biofizycznych, biochemicznych i strukturalnych, aby zbadać podstawowe mechanizmy starzenia się mitochondriów i opracować interwencje terapeutyczne w celu zachowania i przywrócenia zdrowia mitochondriów. Funkcja i struktura mitochondriów są ze sobą nierozerwalnie związane.

Standardowe techniki mikroskopii świetlnej są odpowiednie do pomiaru cech mitochondriów na dużą skalę, takich jak podstawowa morfologia i struktury sieciowe. Analiza ultrastruktury mitochondriów lub cech wymagających wyższej rozdzielczości niż zapewnia tradycyjna mikroskopia optyczna jest zwykle wykonywana przy użyciu mikroskopii elektronowej lub tomografii na utrwalonych próbkach. Mikroskopia superrozdzielcza to technika obrazowania oparta na fluorescencji, która mierzy cechy wykraczające poza granicę dyfrakcji.

W przypadku mitochondriów obejmuje to pomiary rozmieszczenia białek w nanoskali i architektury cristae. Opisany tutaj protokół obrazowania STED pozwala naukowcom zmierzyć szczegółową strukturę błony wewnętrznej w żywych komórkach. Obrazowanie chorób przenoszonych drogą płciową z żywych komórek pozwala nam obserwować i ilościowo analizować złożone cechy grzebieniaków w fizjologicznie istotnych warunkach bez konieczności fiksacji próbki.

Dostarczy to naukowcom nowych informacji na temat dynamicznych zmian zachodzących w cechach ultrastrukturalnych i ich czasowych reakcjach na stresory i związki farmakologiczne. Na początek szybko rozmrozić zamrożony zapas komórek SH-SY5Y w FBS uzupełnionym 10% DMSO i rozcieńczyć dziesięciokrotnie podgrzanym podłożem. Następnie odwirować komórki i usunąć supernatant.

Zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach wstępnie podgrzanego podłoża i komórek nasiennych w kolbie T25. Aby przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte PDL, należy nałożyć 600 mikrolitrów po 50 mikrogramów na mililitr roztworu PDL do każdego dołka sterylnych szkiełek nakrywkowych z komorą. Objętość PDL dodawana do każdej studzienki różni się w zależności od wielkości studni.

Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po inkubacji usunąć roztwór PDL i trzykrotnie przepłukać szkiełko nakrywkowe 1,8 mililitra wody destylowanej. Pozostaw powlekaną komorę do wyschnięcia na powietrzu przez dwie godziny.

Gdy komórki SH-SY5Y osiągną 80 do 90% współpłynności, oddziel je, dodając roztwór trypsyny. Zneutralizuj trypsynę, dodając podgrzane podłoże DMEM. Odwirować zawiesinę komórek i ponownie zawiesić osad w DMEM.

Policz komórki w automatycznym liczniku komórek. Następnie zasiaj komórki o gęstości 1,5 razy 10 do 4 komórek na centymetr kwadratowy na pokrytym PDL szkle nakrywkowym. W pierwszym i trzecim dniu zastąp pożywkę DMEM uzupełnionym odpowiednio 5 lub 2% FBS, 1% antybiotykowym środkiem przeciwgrzybiczym i 10 mikromolowym RZS lub 95% etanolem o tej samej objętości dodatku, aby służyć jako kontrola nośnika do różnicowania.

Przygotuj zapas PKMO we wstępnie podgrzanym DMEM wolnym od czerwieni fenolowej uzupełnionym 2 lub 10% FBS, w zależności od stanu różnicowania, 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego i 20 milimolowych HEPES. Szóstego dnia przepłucz komórki dwukrotnie pożywką obrazową i inkubuj komórki z roztworem PKMO w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. Po barwieniu przepłucz komórki trzykrotnie podgrzanym podłożem do obrazowania.

Do końcowego prania inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po inkubacji należy zastąpić końcowe płukanie świeżym, wstępnie podgrzanym podłożem obrazowym zawierającym 20 milimolowych HEPES. Otwórz oprogramowanie Lightbox w celu pobrania obrazu.

Aby wybrać zestaw lasera i filtrów, użyj parametrów dla barwnika pomarańczowego, wybierając barwnik użyty w barwieniu z listy barwników. Korzystając z przeglądu, kliknij NA ŻYWO, aby skupić się na komórkach. Gdy komórki są już ostre, dostosuj ustawienia akwizycji konfokalnej.

Następnie wybierz prostokątny przycisk ROI i utwórz obszar zainteresowania wokół interesujących mitochondriów, klikając i przeciągając, aby ukształtować region. Aby dostosować bramkowanie detektora pod kątem wymuszonego wyczerpywania się emisji lub akwizycji STED, obok menu OGÓLNE wybierz menu BRAMKOWANIE lub kliknij i przytrzymaj, aby dodać menu do widoku. W przypadku akwizycji STED ustaw laser wzbudzający na 15 do 20%, a laser zubożający STEP na 20 do 25% z 10 akumulacjami linii.

Użyj czasu zatrzymania piksela wynoszącego cztery mikrosekundy i rozmiaru piksela od 20 do 25 nanometrów. Wykonaj upływ czasu, wybierając menu rozwijane Czas, a następnie ustawiając liczbę iteracji na pięć i interwał czasu 25 lub 30 sekund. Stos Z można wykonać za pomocą opcji Głośność i dostosować żądany zakres głośności Z i rozmiar kroku.

Otwórz oprogramowanie do dekonwolucji obrazów STED, aby zdekonwoluować surowe obrazy STED za pomocą algorytmu oprogramowania. Po upewnieniu się, że parametry mikroskopowe są prawidłowe, wybierz przycisk Ekspresowy i ustaw typ dekonwolucji na Szybki, Standardowy, Agresywny lub Konserwatywny dla różnych stopni mocy dekonwolucji. Wykonaj dekonwolucję.

Zapisz obrazy w formacie ICS2 Na obrazie J kliknij Plik, a następnie Otwórz, aby otworzyć pliki ics2 z oprogramowania do dekonwolucji. Wybierz Wtyczki, następnie Segmentacja, a następnie Trainable Weka Segmentation, aby otworzyć zdekonwolucyjne obrazy STED we wtyczce Trainable Weka Segmentation. W ustawieniach segmentacji wybierz funkcje Rozmycie gaussowskie, Projekcje membranowe i filtr Sobel.

Oznacz jedną klasę jako Cristae, a drugą jako Tło. Następnie narysuj linię nad strukturą, którą chcesz przypisać do dowolnej klasy. Następnie wybierz przycisk Dodaj po prawej stronie dla Cristae lub Tło.

Następnie wybierz przycisk Train classifier po lewej stronie, aby wygenerować mapę na podstawie informacji dostarczonych do wtyczki. Kliknij przycisk Zapisz klasyfikator, aby zapisać ustawienia klasyfikatora do przyszłej segmentacji. Użyj mapy prawdopodobieństwa Cristae, aby określić próg obrazu na obrazie J, aby wygenerować maskę binarną, a następnie przejdź do pozycji Analizuj, a następnie Analizuj cząstki.

Na koniec narysuj linię wielopunktową, dostosuj grubość linii do szerokości kilku pikseli i splajn linii, aby pasowała do mitochondriów. W tym badaniu pokazano obrazowanie mitochondriów w niezróżnicowanych, zróżnicowanych kwasem retinowym komórkach SH-SY5Y z obrazowaniem poklatkowym. Zdekonwolucyjne obrazy STED mogą być wykorzystane do określenia okresowości cristae w danym obszarze oraz pomiarów wielkości i kształtu cristae.