Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Nasz protokół zapewnia naukowcom potężne narzędzie do łączenia wielu mikroparametrów na poziomie pojedynczej komórki z ludzkiego IPS oraz ich neuro i przezroczystych pochodnych. Protokoły te pozwalają na zmianę parametrów mitochondrialnych, zarówno na poziomie całkowitym, jak i na określonym poziomie na objętość mitochondriów, za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta może być stosowana do kilku typów komórek, w tym komórek z innych chorób neurodegeneracyjnych.

Może więc pomóc w uzyskaniu wglądu w mechanizmy stojące za tymi typami chorób, a także potencjalnie pomóc w terapeutycznych badaniach przesiewowych. Na początek zasiaj komórki osobno w czterech dołkach na płytce sześciodołkowej i inkubuj komórki, aż do osiągnięcia 50 do 60% zbieżności. Pod koniec okresu hodowli przygotuj pięć indywidualnych roztworów barwiących zawierających różne kombinacje pożywki hodowlanej, FCCP, TMRE, MTG i pasty do smarowania skarpet mito.

Dodaj je do odpowiednich studzienek i inkubuj komórki zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie odessać pożywkę ze wszystkich studzienek i przemyć PBS. W celu oderwania komórek inkubuj komórki z jednym mililitrem odczynnika do dysocjacji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Zneutralizuj odczynnik dysocjacji komórek jednym mililitrem DMEM, uzupełnionym 10% FBS. Następnie zbierz zawartość studzienki do 15-mililitrowej probówki kronikowej. Osad komórek przez odcentrowanie i umyj osad komórkowy PBS raz lub dwa razy.

Odessać cały supernatant, pozostawiając około 100 mikrolitrów w probówce. Ponownie zawiesić granulki komórek w 300 mikrolitrach PBS. Po przeniesieniu zawiesiny komórek do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej, należy przechowywać probówkę w ciemności w temperaturze pokojowej.

Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego z ustawieniami filtra pasmowo-przepustowego opisanymi w rękopisie tekstowym. Odłącz około 1 miliona komórek za pomocą odczynnika do dysocjacji komórek i rozpuść komórki, jak pokazano wcześniej. Zneutralizuj zawiesinę komórek za pomocą DMEM plus 10% FBS i zbierz zawiesinę do 15-mililitrowej probówki.

Napraw komórki jednym mililitrem 1,6% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przesiąknij komórki jednym mililitrem lodowatego 90% metanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie zablokuj próbki w jednym mililitrze buforu blokującego i umyj komórki przez odwirowanie PBS, jak pokazano.

Aby wykryć różne kompleksy i podjednostki mitochondrialne, należy inkubować komórki przez 30 minut z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi opisanymi w manuskrypcie. Po jednokrotnym umyciu komórek PBS, inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut. Pod koniec inkubacji umyć i ponownie zawiesić komórki i PBS, jak pokazano.

Przenieś zawiesinę komórkową do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej, przechowywanej w ciemności na lodzie. Następnie przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym i wykryj sygnały, a następnie przefiltruj jedną za pomocą filtra pasmowego 5 30/30. Dla każdej subpopulacji komórek wybierz wykres histogramu i przeanalizuj medianę intensywności fluorescencji lub MFI różnych kanałów filtra.

Oblicz poziomy TMRE, specyficzne wartości dla podjednostki kompleksu MMP ROS i TFAM, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Do zbadania objętości mitochondriów MMP i poziomów ROS wykorzystano cytometrię przepływową i żywe komórki. W neuronach POLG DA zaobserwowano niższy swoisty MMP i wyższy swoisty ROS, natomiast nie zaobserwowano zmian w objętości mitochondriów, całkowitym MMP i ROS.

Astrocyty POLG miały zmniejszone MMP, ale nie zmieniły się objętości mitochondriów i ROS. Do zbadania poziomu podjednostki kompleksu MRC i TFAM wykorzystano cytometrię przepływową i komórki stałe. Neurony DA wykazywały zwiększony poziom kompleksu pierwszego i TFAM w porównaniu z kontrolą, ale bez zmian na poziomie kompleksu drugiego.

Astrocyty POLG wykazały redukcję kompleksu jeden, cztery i swoistego TFAM. Ponieważ gęstość komórek może również wpływać na MMP i związek między MTG a fluorescencją MMP, jest to specyficzne dla komórki. Dostosowanie tego protokołu do innych typów komórek prawdopodobnie będzie wymagało optymalizacji Po tej procedurze można wykonać mikroskopową azę, na przykład mikroskopię konfokalną, dostarczając dodatkowych szczegółów na temat struktur mitochondrialnych.

Tak więc, podczas gdy ta strategia wykrywa dysfunkcję mitochondriów w neuronach DA i astrocytach ze znanej choroby mitochondrialnej, techniki te można również zastosować do zbadania funkcji mitochondriów w dowolnym typie komórki i choroby.