Name: Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do analizy wielu parametrów mitochondrialnych w ludzkich komórkach iPS oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych. Technika ta umożliwia badanie dysfunkcji mitochondrialnych w chorobach neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Uprzejmie dziękujemy Centrum Obrazowania Molekularnego oraz Ośrodkowi Cytometrii Przepływowej na Uniwersytecie w Bergen w Norwegii. Prace te zostały sfinansowane przez Norweską Radę ds. Badań Naukowych (numer grantu: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat oraz Chińską Radę Stypendialną (numer projektu: 201906220275).

<ol><li>Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+the+potential+countermeasure%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neuroscience+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure.</a> CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).</li>
<li>Chen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+riboside+and+metformin+ameliorate+mitophagy+defect+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocytes+with+POLG+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304(2021).</li>
<li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+phenotypes+in+iPSC-derived+neural+stem+cells+with+POLG+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146(2020).</li>
<li>Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics--fusion%2C+fission%2C+movement%2C+and+mitophagy--in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases.</a> Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).</li>
<li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li>
<li>Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%3A+A+key+modulator+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases.</a> Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583(2019).</li>
<li>Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interplay+between+cristae+biogenesis%2C+mitochondrial+dynamics+and+mitochondrial+DNA+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311(2019).</li>
<li>Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+human+disease+using+stem+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Investigating human disease using stem cell models.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).</li>
<li>Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell+models+of+disease+and+the+prognosis+of+academic+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine.</a> Nature Medicine. 26 (4), 449(2020).</li>
<li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine+amide+ameliorates+mitochondrial+dysfunction+and+reduces+oxidative+stress+in+hiPSC-derived+dopaminergic+neurons+with+POLG+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation.</a> Experimental Neurology. , 337(2021).</li>
<li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).</li>
<li>Juopperi, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+generated+from+patient+induced+pluripotent+stem+cells+recapitulate+features+of+Huntington%27s+disease+patient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells.</a> Molecular Brain. 5, 17(2012).</li>
<li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+derived+astrocytes+with+POLG+mutations+and+mitochondrial+dysfunction+including+abnormal+NAD%2B+metabolism+is+toxic+for+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+ESCs+and+induced+pluripotent+stem+cells%3A+induction%2C+maintenance%2C+and+differentiation+into+functional+schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).</li>
<li>Hong, Y. J., Do, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+lineage+differentiation+from+pluripotent+stem+cells+to+mimic+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400(2019).</li>
<li>Lundin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS-derived+astroglia+from+a+stable+neural+precursor+state+show+improved+functionality+compared+with+conventional+astrocytic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).</li>
<li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine+amide+ameliorates+mitochondrial+dysfunction+and+reduces+oxidative+stress+in+hiPSC-derived+dopaminergic+neurons+with+POLG+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation.</a> Experimental Neurology. 337, 113536(2021).</li>
<li>Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+MitoTracker+Green%E2%84%A2+and+CMXrosamine+to+measure+changes+in+mitochondrial+membrane+potentials+in+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues.</a> Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).</li>
<li>Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+mitochondrial+membranes+with+10-nonyl+acridine+orange%2C+MitoFluor+Green%2C+and+MitoTracker+Green+is+affected+by+mitochondrial+membrane+potential+altering+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs.</a> Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).</li>
<li>Buckman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoTracker+labeling+in+primary+neuronal+and+astrocytic+cultures%3A+influence+of+mitochondrial+membrane+potential+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants.</a> Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).</li>
<li>Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-density-dependent+changes+in+mitochondrial+membrane+potential+and+reactive+oxygen+species+production+in+human+skin+cells+post+sunlight+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Photodermatology%2C+Photoimmunology+%26+Photomedicine%22%5BJournal%5D)">Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure.</a> Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Poniżej znajdują się protokoły generowania neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC oraz oceny wielu aspektów funkcji mitochondriów za pomocą cytometrii przepływowej. Protokoły te umożliwiają efektywną konwersję ludzkich iPSC zarówno w neurony, jak i astrocyty glejowe oraz szczegółową charakterystykę funkcji mitochondriów, głównie w żywych komórkach. Protokoły zapewniają również strategię opartą na cytometrii przepływowej współbarwienia do pozyskiwania i analizowania wielu funkcji mitochondriów, w tym objętości, MMP i m...

Mitochondria są niezbędnymi organellami obecnymi w prawie wszystkich komórkach eukariotycznych. Mitochondria są odpowiedzialne za dostarczanie energii poprzez wytwarzanie trifosforanu adenozyny (ATP) poprzez fosforylację oksydacyjną i działają jako pośrednicy metaboliczni w biosyntezie i metabolizmie. Mitochondria są głęboko zaangażowane w wiele innych ważnych procesów komórkowych, takich jak wytwarzanie ROS, śmierć komórki i wewnątrzkomórkowa regulacja Ca2 +. Dysfunkcja mitochondriów jest związana z różnymi chorobami neurodegeneracyjnymi, w tym chorobą Parkinsona (PD), chorobą Alzheimera (AD), chorobą Huntingtona (HD), ataksją Friedreicha (FRDA) i stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS)1. Uważa się również, że zwiększona dysfunkcja mitochondriów i nieprawidłowości mtDNA przyczyniają się do starzenia się człowieka2,3.
W chorobach neurodegeneracyjnych występują różne rodzaje dysfunkcji mitochondriów, a zmiany w objętości mitochondriów, depolaryzacja MMP, produkcja ROS i zmiany w liczbie kopii mtDNA są powszechne4,5,6,7. Dlatego możliwość pomiaru tych i innych funkcji mitochondriów ma ogromne znaczenie przy badaniu mechanizmów chorobowych i testowaniu potencjalnych środków terapeutycznych. Ponadto, ze względu na brak modeli zwierzęcych, które wiernie odwzorowują ludzkie choroby neurodegeneracyjne, ustanowienie odpowiednich systemów modelowych in vitro, które rekapitulują ludzką chorobę w komórkach mózgowych, jest ważnym krokiem w kierunku lepszego zrozumienia tych chorób i opracowania nowych terapii2,3,8,9.
Ludzkie iPSC mogą być używane do generowania różnych komórek mózgowych, w tym komórek neuronalnych i nieneuronalnych (tj. komórek glejowych), a uszkodzenia mitochondriów związane z chorobą neurodegeneracyjną stwierdzono w obu typach komórek3,10,11,12,13. Dostępne są odpowiednie metody różnicowania iPSC na linie neuronalne i glejowe14,15,16. Komórki te stanowią unikalną platformę dla ludzi/pacjentów do modelowania chorób in vitro i badań przesiewowych leków. Co więcej, ponieważ pochodzą one od pacjentów, neurony i komórki glejowe pochodzące z iPSC dostarczają modeli choroby, które dokładniej odzwierciedlają to, co dzieje się u ludzi.
Do tej pory dostępnych jest kilka wygodnych i niezawodnych metod pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów w iPSC, szczególnie żywych neuronów i komórek glejowych. Zastosowanie cytometrii przepływowej dostarcza naukowcowi potężnego narzędzia do pomiaru parametrów biologicznych, w tym funkcji mitochondriów, w pojedynczych komórkach. Protokół ten zawiera szczegółowe informacje na temat generowania różnych typów komórek mózgowych, w tym nerwowych komórek macierzystych (NSC), neuronów i astrocytów glejowych z iPSC, a także nowatorskie podejścia oparte na cytometrii przepływowej do pomiaru wielu parametrów mitochondrialnych w różnych typach komórek, w tym iPSC oraz komórek nerwowych i glejowych pochodzących z iPSC. Protokół zapewnia również strategię współbarwienia przy użyciu cytometrii przepływowej do pomiaru objętości mitochondriów, MMP, mitochondrialnego poziomu ROS, kompleksów MRC i TFAM. Włączając pomiary objętości lub masy mitochondriów, protokoły te umożliwiają również pomiar zarówno poziomu całkowitego, jak i określonego poziomu na jednostkę mitochondrialną.

<table><tbody><tr><td>anty-Oct4</td><td>Abcam</td><td>ab19857, RRID:AB_445175</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 &mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor &reg; 488 koza anty-królik IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało wtórne.</td></tr><tr><td>anty-SSEA4</td><td>Abcam</td><td>ab16287, RRID:AB_778073</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 &mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor &reg; 594 kozioł anty-mysi IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005) jako przeciwciało drugorzędowe.</td></tr><tr><td>anty-Sox2</td><td>Abcam</td><td>ab97959, RRID:AB_2341193</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 &mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor &reg; 488 koza anty-królik IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało wtórne.</td></tr><tr><td>anty-Pax6</td><td>Abcam</td><td>ab5790, RRID:AB_305110</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 i mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor &reg; 488 koza anty-królik IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało wtórne.</td></tr><tr><td>anty-Nestin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927, RRID:AB_627994</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:50, 20 i mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor &reg; 594 kozioł anty-mysi IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005) jako przeciwciało drugorzędowe.</td></tr><tr><td>anty-GFAP</td><td>Abcam</td><td>ab4674, RRID:AB_304558</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 &mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; &nbsp; korzystanie z Alexa Fluor &reg; 594 kozie przeciwciało anty-kurze IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11042) jako przeciwciało drugorzędowe.</td></tr><tr><td>anty-S100&beta; &nbsp; sprzężony z Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab196442, RRID:AB_2722596</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:400, 2,5 &mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L;</td></tr><tr><td>anty-TH</td><td>Abcam</td><td>ab75875, RRID:AB_1310786</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 &mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor &reg; 488 koza anty-królik IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało wtórne.</td></tr><tr><td>anty-Tuj 1</td><td>Abcam</td><td>ab78078, RRID:AB_2256751</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:1000, 1 &mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor &reg; 594 kozioł anty-mysi IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005) jako przeciwciało drugorzędowe.</td></tr><tr><td>anty-synaptofizyna</td><td>Abcam</td><td>ab32127, RRID:AB_2286949</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 &mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor &reg; 488 koza anty-królik IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało wtórne.</td></tr><tr><td>anty-PSD-95</td><td>Abcam</td><td>ab2723, RRID:AB_303248</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:100, 10 &mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; &nbsp; korzystanie z Alexa Fluor &reg; 594 kozie przeciwciało anty-kurze IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11042) jako przeciwciało drugorzędowe.</td></tr><tr><td>anty-TFAM sprzężony z Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab198308</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:400, 2,5 i mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; stosować mysie monoklonalne IgG2b&nbsp; Alexa Fluor&reg; 488 jako kontrola izotypu.</td></tr><tr><td>anty-TOMM20 sprzężony z Alexa Fluor 488</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Cat# sc-17764 RRID:AB_628381</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:400, 2,5 i mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; stosować mysie monoklonalne IgG2a&nbsp; Alexa Fluor&reg; 488 jako kontrola izotypu.</td></tr><tr><td>anty-NDUFB10</td><td>Abcam</td><td>ab196019</td><td>Przeciwciało pierwotne; stosować jako 1:1000, 1 i mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; korzystanie z Alexa Fluor &reg; 488 koza anty-królik IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało drugorzędowe; stosować królicze monoklonalne IgG jako kontrolę izotypu.</td></tr><tr><td>przeciwciało pierwszorzędowe anty-SDHA</td><td>Abcam</td><td>ab137040</td><td>; stosować jako 1:1000, 1 &mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; &nbsp; korzystanie z Alexa Fluor &reg; 488 koza anty-królik IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) jako przeciwciało drugorzędowe; stosować królicze monoklonalne IgG jako kontrolę izotypu.</td></tr><tr><td>anty-COX IV</td><td>Abcam</td><td>ab14744, RRID:AB_301443</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe; stosować jako 1:1000, 1 &mu; L w 1000 &mu; Roztwór do barwienia L; posługiwać się&nbsp; Alexa Fluor &reg; 488 kozie przeciwciała anty-mysie IgG&nbsp; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11001) jako przeciwciało drugorzędowe; używać mysiej monoklonalnej IgG jako kontroli izotypu.</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>PeproTech</td><td>120-14E</td><td>Składnik pożywki do różnicowania astrocytów</td></tr><tr><td>ABM Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3187</td><td>Podłoże bazowe do hodowli astrocytów</td></tr><tr><td>AGM SingleQuots Supplement Pack</td><td>Lonza</td><td>CC-4123</td><td>Suplement do hodowli astrocytów</td></tr><tr><td>Antybiotykowo-Przeciwgrzybicze</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Składnik CDM</td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific 12634010</td><td></td><td>Podłoże podstawowe do rozcieńczonego</td></tr><tr><td>albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Geltrex Europa Bioproducts</td><td>EQBAH62-1000</td><td>Środek blokujący zapobiegający nieswoistemu wiązaniu przeciwciał w testach barwienia immunologicznego i składnik CDM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-02</td><td>DA neurony średni składnik</td></tr><tr><td>B-27 Suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>Składnik pożywki do różnicowania astrocytów</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy BD Accuri C6 Plus</td><td>BD Biosciences, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11905031</td><td>Składnik CDM</td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104019</td><td>Odczynnik do delikatnej dysocjacji ludzkich iPSC</td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa CCD Leica DFC3000 G</td><td>Leica Microsystems, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Naczynia hodowlane bez obróbki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430589</td><td>Kultura zawiesinowa</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td>Używany do różnych mycia kultur komórkowych</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplement GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565018</td><td>Różnicowanie astrocytów bazowe Medium</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Odczynnik do</td><td></td><td>15575020 Scientific do delikatnej dysocjacji ludzkich iPSC</td></tr><tr><td>Essential 8 Basal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516901</td><td>Podłoże bazowe do hodowli iPSC</td></tr><tr><td>Suplement Essential 8 (50X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517101</td><td>Suplement do hodowli iPSC</td></tr><tr><td>EGF Rekombinowane białko ludzkie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0314</td><td>Suplement do hodowli NSC</td></tr><tr><td>FGF-podstawowy (AA 10&ndash; 155) Rekombinowane białko ludzkie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>Suplement do hodowli NSC</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma-Aldrich</td><td>12103C</td><td>Średni składnik</td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>Pożywka do różnicowania astrocytów</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Abcam</td><td>ab120081</td><td>Eliminuje potencjał błony mitochondrialnej i barwienie</td></tr> <tr><td>TMRESystem aspiracji płynów BVC control</td><td>Vacuubrand, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd (PFA) 16%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Utrwalanie komórek</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td>Służy do mocowania i konserwacji ludzkich iPSC</td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Suplement do hodowli NSC</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>DA neurony średni składnik</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td>Służy do blokowania</td></tr><tr><td>buforu Mieszanka składników odżywczych F-12 szynki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31765027</td><td>Podłoże podstawowe dla CDM</td></tr><tr><td>Heregulina beta-1 ludzka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3055</td><td>Astrocyty różnicowanie</td></tr> składnika <tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Barwienie jąder do obrazu konfokalnego</td></tr><tr><td>Inkubatory CO2 Heracell 150i</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21980032</td><td>Podłoże podstawowe dla CDM</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Roche</td><td>1376497</td><td>składnik CDM</td></tr><tr><td>InSolution AMPK Inhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>171261</td><td>Składnik pożywki do indukcji neuronalnej</td></tr><tr><td>Insulinopodobny czynnik wzrostu-I ludzki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3769</td><td>Pożywka do różnicowania astrocytów</td></tr><tr><td>Składnik KnockOut DMEM/F-12 pożywka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12660012</td><td>Podłoże podstawowe do hodowli NSC</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Wspomaga przyczepianie i wzrost komórek nerwowych in vitro</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Leica TCS SP8 STED</td><td>Leica Microsystems, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>CDM składnik</td></tr><tr><td>MitoTracker Green FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7514</td><td>Używany do wskaźnika objętości mitochondriów</td></tr><tr><td>MitoSox Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M36008</td><td>Używany do mitochondrialnego wskaźnika ROS</td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td>Neural pożywka indukcyjna składnik</td></tr><tr><td>N-2 Suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td>Składnik pożywki do różnicowania astrocytów</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>Służy do blokowania bufora</td></tr><tr><td>Wytrząsarki orbitalne - SSM1</td><td>Stuart Equipment, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-ornityny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>Wspomaga przyczepianie i wzrost komórek nerwowych in vitro</td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7405</td><td>Wspomaga przyczepianie i wzrost komórek nerwowych in vitro</td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72204</td><td>Wspomaga różnicowanie neuronów DA</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade</td><td>Mountant Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Montaż szkiełka nakrywkowego do obrazu</td></tr> <tr><td>konfokalnegoPBS 1x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td>Używany do różnych rodzajów prania</td></tr><tr><td>Rekombinowane białko ludzkie / mysie FGF-8b R</td><td>& D Systems</td><td>423-F8-025/CF</td><td>Wspomaga różnicowanie neuronów DA</td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>TB1614-GMP</td><td>Indukcja neuronalna Składnik</td></tr><tr><td>StemPro Neural Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10508-01</td><td>Suplement do hodowli NSC</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td>Odczynnik do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>Składnik Roche</td><td>652202</td><td>CDM</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>VWR International</td><td>9002-93-1</td><td>Stosowany do przenikania komórek w testach barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>TMRE</td><td>Abcam</td><td>ab113852</td><td>Używany do barwienia potencjału błony mitochondrialnej</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Instrumenty grantowe</td><td>Grant Instruments, USA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Mitochondria są ważne w patofizjologii wielu chorób neurodegeneracyjnych. Zmiany objętości mitochondriów, potencjału błony mitochondrialnej (MMP), mitochondrialnej produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) i liczby kopii mitochondrialnego DNA (mtDNA) są często cechami tych procesów. Raport ten szczegółowo opisuje nowatorskie podejście oparte na cytometrii przepływowej do pomiaru wielu parametrów mitochondrialnych w różnych typach komórek, w tym ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) oraz komórek nerwowych i glejowych pochodzących z iPSC. Ta strategia oparta na przepływie wykorzystuje żywe komórki do pomiaru objętości mitochondriów, poziomów MMP i ROS, a także stałe komórki do oszacowania składników mitochondrialnego łańcucha oddechowego (MRC) i białek związanych z mtDNA, takich jak mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A (TFAM). 
Poprzez współbarwienie z fluorescencyjnymi reporterami, w tym MitoTracker Green (MTG), estru etylowym tetramethylrodamine (TMRE) i MitoSox Red, zmiany w objętości mitochondriów, MMP i mitochondrialnym ROS mogą być określone ilościowo i powiązane z zawartością mitochondriów. Podwójne barwienie przeciwciałami przeciwko podjednostkom kompleksu MRC i translokazie zewnętrznej błony mitochondrialnej 20 (TOMM20) pozwala na ocenę ekspresji podjednostki MRC. Ponieważ ilość TFAM jest proporcjonalna do liczby kopii mtDNA, pomiar TFAM na TOMM20 daje pośredni pomiar mtDNA na objętość mitochondriów. Cały protokół można przeprowadzić w ciągu 2-3 godzin. Co ważne, protokoły te pozwalają na pomiar parametrów mitochondrialnych, zarówno na poziomie całkowitym, jak i określonym na objętość mitochondriów, za pomocą cytometrii przepływowej.

Schematyczny opis metody różnicowania oraz strategii cytometrii przepływowej przedstawiono na Rysunku 3. Ludzkie iPSC są różnicowane w rozetki neuralne, a następnie przenoszone do hodowli zawiesinowej w celu różnicowania w sfery neuralne. Sfery neuralne są dalej różnicowane i dojrzewają do formy neuronów DA. Sfery neuralne są dysocjowane do pojedynczych komórek w celu generowania astrocytów glejowych, wysiewane w monowarstwach jako NSC, a następnie różnicowane w astrocyty. Protokół ten przed...

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

Nasz protokół zapewnia naukowcom potężne narzędzie do łączenia wielu mikroparametrów na poziomie pojedynczej komórki z ludzkiego IPS oraz ich neuro i przezroczystych pochodnych. Protokoły te pozwalają na zmianę parametrów mitochondrialnych, zarówno na poziomie całkowitym, jak i na określonym poziomie na objętość mitochondriów, za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta może być stosowana do kilku typów komórek, w tym komórek z innych chorób neurodegeneracyjnych.Może więc pomóc w uzyskaniu wglądu w mechanizmy stojące za tymi typami chorób, a także potencjalnie pomóc w terapeutycznych badaniach przesiewowych. Na początek zasiaj komórki osobno w czterech dołkach na płytce sześciodołkowej i inkubuj komórki, aż do osiągnięcia 50 do 60% zbieżności. Pod koniec okresu hodowli przygotuj pięć indywidualnych roztworów barwiących zawierających różne kombinacje pożywki hodowlanej, FCCP, TMRE, MTG i pasty do smarowania skarpet mito.Dodaj je do odpowiednich studzienek i inkubuj komórki zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie odessać pożywkę ze wszystkich studzienek i przemyć PBS. W celu oderwania komórek inkubuj komórki z jednym mililitrem odczynnika do dysocjacji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.Zneutralizuj odczynnik dysocjacji komórek jednym mililitrem DMEM, uzupełnionym 10% FBS. Następnie zbierz zawartość studzienki do 15-mililitrowej probówki kronikowej. Osad komórek przez odcentrowanie i umyj osad komórkowy PBS raz lub dwa razy.Odessać cały supernatant, pozostawiając około 100 mikrolitrów w probówce. Ponownie zawiesić granulki komórek w 300 mikrolitrach PBS. Po przeniesieniu zawiesiny komórek do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej, należy przechowywać probówkę w ciemności w temperaturze pokojowej.Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego z ustawieniami filtra pasmowo-przepustowego opisanymi w rękopisie tekstowym. Odłącz około 1 miliona komórek za pomocą odczynnika do dysocjacji komórek i rozpuść komórki, jak pokazano wcześniej. Zneutralizuj zawiesinę komórek za pomocą DMEM plus 10% FBS i zbierz zawiesinę do 15-mililitrowej probówki.Napraw komórki jednym mililitrem 1,6% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przesiąknij komórki jednym mililitrem lodowatego 90% metanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie zablokuj próbki w jednym mililitrze buforu blokującego i umyj komórki przez odwirowanie PBS, jak pokazano.Aby wykryć różne kompleksy i podjednostki mitochondrialne, należy inkubować komórki przez 30 minut z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi opisanymi w manuskrypcie. Po jednokrotnym umyciu komórek PBS, inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut. Pod koniec inkubacji umyć i ponownie zawiesić komórki i PBS, jak pokazano.Przenieś zawiesinę komórkową do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej, przechowywanej w ciemności na lodzie. Następnie przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym i wykryj sygnały, a następnie przefiltruj jedną za pomocą filtra pasmowego 5 30/30. Dla każdej subpopulacji komórek wybierz wykres histogramu i przeanalizuj medianę intensywności fluorescencji lub MFI różnych kanałów filtra.Oblicz poziomy TMRE, specyficzne wartości dla podjednostki kompleksu MMP ROS i TFAM, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Do zbadania objętości mitochondriów MMP i poziomów ROS wykorzystano cytometrię przepływową i żywe komórki. W neuronach POLG DA zaobserwowano niższy swoisty MMP i wyższy swoisty ROS, natomiast nie zaobserwowano zmian w objętości mitochondriów, całkowitym MMP i ROS.Astrocyty POLG miały zmniejszone MMP, ale nie zmieniły się objętości mitochondriów i ROS. Do zbadania poziomu podjednostki kompleksu MRC i TFAM wykorzystano cytometrię przepływową i komórki stałe. Neurony DA wykazywały zwiększony poziom kompleksu pierwszego i TFAM w porównaniu z kontrolą, ale bez zmian na poziomie kompleksu drugiego.Astrocyty POLG wykazały redukcję kompleksu jeden, cztery i swoistego TFAM. Ponieważ gęstość komórek może również wpływać na MMP i związek między MTG a fluorescencją MMP, jest to specyficzne dla komórki. Dostosowanie tego protokołu do innych typów komórek prawdopodobnie będzie wymagało optymalizacji Po tej procedurze można wykonać mikroskopową azę, na przykład mikroskopię konfokalną, dostarczając dodatkowych szczegółów na temat struktur mitochondrialnych.Tak więc, podczas gdy ta strategia wykrywa dysfunkcję mitochondriów w neuronach DA i astrocytach ze znanej choroby mitochondrialnej, techniki te można również zastosować do zbadania funkcji mitochondriów w dowolnym typie komórki i choroby.

flow-cytometric-analysis-multiple-mitochondrial-parameters-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film pokazuje znakowanie komórek neuronalnych przeciwciałami dla mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego, białka związanego z mitochondrialnym DNA i mitochondrialnego białka błony zewnętrznej, a następnie cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia ich poziomów.

Pomiar wielu parametrów mitochondrialnych w neuronach za pomocą cytometrii przepływowej

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są uważane za potężne narzędzie do badań przesiewowych leków i substancji chemicznych oraz do rozwoju nowych modeli in vitro do testowania toksyczności, w tym neurotoksyczności. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół różnicowania hiPSC w neurony i komórki glejowe.

Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności

Prezentujemy metodę cytometrii przepływowej do jednoczesnej identyfikacji różnych typów komórek pobranych z mózgu myszy lub rdzenia kręgowego. Metoda ta może być wykorzystana do wyizolowania lub scharakteryzowania czystych populacji komórek w chorobach neurodegeneracyjnych lub do ilościowego określenia zakresu celowania w komórki po podaniu in vivo wektorów wirusowych lub nanocząstek.

Jednoczesna charakterystyka cytometryczna przepływowa wielu typów komórek pobranych z mózgu / rdzenia kręgowego myszy za pomocą różnych metod homogenizacji

Tutaj opisujemy wiarygodną metodę pomiaru masy mitochondriów i potencjału błonowego w hodowanych ex vivo hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T.

Pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T metodą cytometrii przepływowej

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

Opisujemy szczegółowy protokół generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wykorzystania w modelowaniu chorób mitochondrialnych.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do analizy wielu parametrów mitochondrialnych w ludzkich komórkach iPS oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych. Technika ta umożliwia badanie dysfunkcji mitochondrialnych w chorobach neurodegeneracyjnych.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych (Wideo) | JoVE Journal

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Przeglądaj więcej filmów