Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych
November 8th, 2021
To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.
Nasz protokół zapewnia naukowcom potężne narzędzie do łączenia wielu mikroparametrów na poziomie pojedynczej komórki z ludzkiego IPS oraz ich neuro i przezroczystych pochodnych. Protokoły te pozwalają na zmianę parametrów mitochondrialnych, zarówno na poziomie całkowitym, jak i na określonym poziomie na objętość mitochondriów, za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta może być stosowana do kilku typów komórek, w tym komórek z innych chorób neurodegeneracyjnych.
Może więc pomóc w uzyskaniu wglądu w mechanizmy stojące za tymi typami chorób, a także potencjalnie pomóc w terapeutycznych badaniach przesiewowych. Na początek zasiaj komórki osobno w czterech dołkach na płytce sześciodołkowej i inkubuj komórki, aż do osiągnięcia 50 do 60% zbieżności. Pod koniec okresu hodowli przygotuj pięć indywidualnych roztworów barwiących zawierających różne kombinacje pożywki hodowlanej, FCCP, TMRE, MTG i pasty do smarowania skarpet mito.
Dodaj je do odpowiednich studzienek i inkubuj komórki zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie odessać pożywkę ze wszystkich studzienek i przemyć PBS. W celu oderwania komórek inkubuj komórki z jednym mililitrem odczynnika do dysocjacji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Zneutralizuj odczynnik dysocjacji komórek jednym mililitrem DMEM, uzupełnionym 10% FBS. Następnie zbierz zawartość studzienki do 15-mililitrowej probówki kronikowej. Osad komórek przez odcentrowanie i umyj osad komórkowy PBS raz lub dwa razy.
Odessać cały supernatant, pozostawiając około 100 mikrolitrów w probówce. Ponownie zawiesić granulki komórek w 300 mikrolitrach PBS. Po przeniesieniu zawiesiny komórek do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej, należy przechowywać probówkę w ciemności w temperaturze pokojowej.
Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego z ustawieniami filtra pasmowo-przepustowego opisanymi w rękopisie tekstowym. Odłącz około 1 miliona komórek za pomocą odczynnika do dysocjacji komórek i rozpuść komórki, jak pokazano wcześniej. Zneutralizuj zawiesinę komórek za pomocą DMEM plus 10% FBS i zbierz zawiesinę do 15-mililitrowej probówki.
Napraw komórki jednym mililitrem 1,6% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przesiąknij komórki jednym mililitrem lodowatego 90% metanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie zablokuj próbki w jednym mililitrze buforu blokującego i umyj komórki przez odwirowanie PBS, jak pokazano.
Aby wykryć różne kompleksy i podjednostki mitochondrialne, należy inkubować komórki przez 30 minut z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi opisanymi w manuskrypcie. Po jednokrotnym umyciu komórek PBS, inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut. Pod koniec inkubacji umyć i ponownie zawiesić komórki i PBS, jak pokazano.
Przenieś zawiesinę komórkową do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej, przechowywanej w ciemności na lodzie. Następnie przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym i wykryj sygnały, a następnie przefiltruj jedną za pomocą filtra pasmowego 5 30/30. Dla każdej subpopulacji komórek wybierz wykres histogramu i przeanalizuj medianę intensywności fluorescencji lub MFI różnych kanałów filtra.
Oblicz poziomy TMRE, specyficzne wartości dla podjednostki kompleksu MMP ROS i TFAM, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Do zbadania objętości mitochondriów MMP i poziomów ROS wykorzystano cytometrię przepływową i żywe komórki. W neuronach POLG DA zaobserwowano niższy swoisty MMP i wyższy swoisty ROS, natomiast nie zaobserwowano zmian w objętości mitochondriów, całkowitym MMP i ROS.
Astrocyty POLG miały zmniejszone MMP, ale nie zmieniły się objętości mitochondriów i ROS. Do zbadania poziomu podjednostki kompleksu MRC i TFAM wykorzystano cytometrię przepływową i komórki stałe. Neurony DA wykazywały zwiększony poziom kompleksu pierwszego i TFAM w porównaniu z kontrolą, ale bez zmian na poziomie kompleksu drugiego.
Astrocyty POLG wykazały redukcję kompleksu jeden, cztery i swoistego TFAM. Ponieważ gęstość komórek może również wpływać na MMP i związek między MTG a fluorescencją MMP, jest to specyficzne dla komórki. Dostosowanie tego protokołu do innych typów komórek prawdopodobnie będzie wymagało optymalizacji Po tej procedurze można wykonać mikroskopową azę, na przykład mikroskopię konfokalną, dostarczając dodatkowych szczegółów na temat struktur mitochondrialnych.
Tak więc, podczas gdy ta strategia wykrywa dysfunkcję mitochondriów w neuronach DA i astrocytach ze znanej choroby mitochondrialnej, techniki te można również zastosować do zbadania funkcji mitochondriów w dowolnym typie komórki i choroby.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia nową metodę opartą na cytometrii przepływowej do oceny parametrów funkcjonalnych mitochondriów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPS) i ich neuronowych pochodnych. Umożliwia wykrycie zmian w potencjale błony mitochondriów, poziomach reaktywnych form tlenu i składzie łańcucha oddechowego mitochondriów, co przyczynia się do zrozumienia dysfunkcji mitochondriów w chorobach neurodegeneracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Funkcja mitochondriów
Tło
- Dysfunkcja mitochondriów jest związana z chorobami neurodegeneracyjnymi.
- To badanie bada parametry mitochondriów na poziomie pojedynczej komórki.
- Metodologia ma na celu dostarczenie informacji na temat mechanizmów chorobowych.
- Ocena zdrowia mitochondriów może pomóc w przesiewowym badaniu terapeutycznym.
Cel badania
- Rozwój metody pomiaru parametrów mitochondriów w pojedynczych komórkach.
- Zrozumienie ról mitochondriów w neurodegeneracji i potencjalnych terapiach.
- Poprawa wykrywania dysfunkcji mitochondriów w różnych typach komórek.
Zastosowane metody
- Zastosowano platformę cytometrii przepływowej.
- Analizowano ludzkie komórki iPS i ich neuronowe pochodne.
- Kluczowe procedury obejmowały hodowlę komórek, podwójne barwienie specyficznymi fluoroforami i oznaczanie przeciwciał do analizy mitochondriów.
- Leczenie komórek obejmowało dysocjację, fiksację i permeabilizację, a następnie pomiar fluorescencji.
- Wspomniano o specyficznych dla typu komórki adaptacjach protokołu.
Główne wyniki
- Zaobserwowano istotne różnice w potencjale błony mitochondriów (MMP) i poziomach reaktywnych form tlenu (ROS) w neuronach i astrocytach POLG.
- Zaobserwowano zwiększony poziom kompleksów mitochondrialnych i TFAM w neuronach DA, co wskazuje na unikalne adaptacje mitochondrialne.
- Wyniki wskazują, że określone cechy komórek wpływają na pomiary funkcji mitochondriów.
- Możliwość szerszych zastosowań do różnych typów komórek w badaniu funkcji mitochondrialnych i powiązanych chorób.
Konkluzje
- To badanie pokazuje solidne podejście do oceny funkcji mitochondriów w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
- Wyniki umożliwiają dalsze badania ról mitochondriów w zdrowiu komórkowym i chorobach.
- Ta metodologia może prowadzić do lepszego zrozumienia i strategii terapeutycznych dla patologii związanych z dysfunkcją mitochondriów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This flow cytometry method enables multiparametric mitochondrial profiling in human iPSC-derived neural and glial cells, supporting target validation in neurodegenerative disease models. By quantifying mitochondrial volume, membrane potential, ROS, and respiratory chain components at single-cell resolution, it provides mechanistic de-risking for therapeutic screening. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking mitochondrial phenotypes to disease-relevant cellular states.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring mitochondrial dysfunction in iPSC-derived neurons and astrocytes.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiparametric readouts of mitochondrial health.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that normalize mitochondrial parameters in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated iPSC-derived neural and glial systems for compound screening with mitochondrial endpoints.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs for mitochondrial volume, MMP, and ROS.
- Scalability: Supports high-content flow cytometry screening across multiple cell lines and treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling mitochondrial defects in POLG-associated neurons and astrocytes.
- Operational Value: Enables translational biomarker assessment via TFAM/TOMM20 ratios reflecting mtDNA copy number per mitochondrial volume.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by detecting mitochondrial complex subunit alterations linked to pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for neurodegenerative indications involving mitochondrial dysfunction.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking mitochondrial volume, MMP, and ROS to specific cellular phenotypes in iPSC derivatives.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized staining protocols and flow cytometric readouts of mitochondrial function.
- Analytics: Provides quantitative measurements of mitochondrial respiratory chain subunits and TFAM for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via disease-relevant iPSC models and mitochondrial biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable multiparametric mitochondrial profiling platform applicable across neurodegenerative disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in mitochondrial contributions to neurodegeneration.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined staining panels and flow cytometric gating strategies.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of mitochondrial liabilities in compound libraries.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that rescue mitochondrial complex deficits or ROS elevation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, mitochondrial biology, and iPSC differentiation protocols.
- Dependent on access to flow cytometers with appropriate fluorescence detection channels and compensation controls.
- Necessitates standardization of staining concentrations, incubation times, and gating strategies across laboratories.
- Requires optimization when adapting to non-neural cell types or different mitochondrial disease models.
- Limited by the need for live-cell handling for MMP/ROS measurements and fixed-cell protocols for protein detection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Flow Cytometry Measurement of Mitochondrial Volume, MMP, and Mitochondrial ROS in Live Cells
2:26
Flow Cytometry Measurement of MRC Complex Subunits and TFAM in Fixed Cells
3:49
Flow Cytometry Analysis
4:14
Results: Flow Cytometry Investigation of iPSC-Derived Neural Cells
5:07
Conclusion
