Name: Sztuczne komórki prezentujące antygen na bazie HLA-IG do efektywnej ekspansji ex vivo ludzkiego CTL (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj metodę ekspansji ex vivo ludzkich CTL specyficznych dla antygenu przy użyciu sztucznych komórek prezentujących antygen opartych na HLA-Ig. Technika ta wspiera rozwój immunoterapii adoptywnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Aaronowi Selyi za pomocne dyskusje. Praca ta była finansowana z grantów NIH AI29575, CA108835 oraz AI077097 dla JS, z grantu pilotażowego z Johns Hopkins Malaria Research Institute oraz z grantu Departamentu Obrony PC 040972 dla M.O.

1. Przygotowanie aAPC opartych na HLA-A2-Ig
<ol>
	<li>Przygotowanie sterylnego buforu boranowego
 <ol>
 	<li>Rozpuścić kwas borowy w wodzie do uzyskania stężenia 0.1M. Dostosować pH do wartości 7.0.</li>
 <li>Przefiltrować przez sterylny filtr 0.22μm i przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
 
 </ol>
 
 </li>
 <li>Przygotowanie sterylnego buforu do płukania kulek (Bead Wash buffer)
 	<ol>
 	<li>Odmierzyć 956ml PBS bez magnezu i wapnia.</li>
 <li>Dodać 30ml ludzkiej surowicy grupy AB.</li>
 <li>Dodać EDTA do końcowego stężenia 2mM.</li>
 <li>Dodać 0.1g azotku sodu.</li>
 <li>Przefiltrować przez sterylny filtr 0.22 μm i przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
 </ol>
 
 </li>
 <li>Pobrać 1ml kulek Invitrogen M-450 Epoxy z zapasu, około 400 milionów kulek (liczbę kulek można określić za pomocą hemocytometru), i przenieść do sterylnej szklanej fiolki z nakrętką.</li>
 <li>Umieścić fiolkę przy magnesie Dynal MPC-1; gdy kulki przylgną do ścianki fiolki, usunąć nadsącz poprzez aspirację. Przepłukać kulki raz 1ml buforu boranowego.</li>
 <li>Resuspender kulki w mieszaninie 1ml buforu boranowego, 20 μg dimeru HLA-A2-Ig oraz 20 μg przeciwciała mAb anty-ludzkiego CD28 (Klon 9.3).</li>
 <li>Koniugacja białka z kulkami: umieścić szklaną fiolkę na rotatorze i inkubować w temperaturze 4°C przez 24 godziny.</li>
 <li>Umieścić probówkę w magnesie MPC-1 i usunąć cały bufor boranowy.</li>
 <li>Przepłukać kulki dwukrotnie 1ml buforu do płukania kulek (Bead Wash buffer).</li>
 <li>Inkubować kulki w 1ml buforu do płukania kulek (Bead Wash buffer), rotując w temperaturze 4°C przez 24 godziny. Ponieważ bufor do płukania kulek zawiera ludzką surowicę grupy AB, zablokuje on wszystkie pozostałe miejsca wiązania białek na kulkach.</li>
 <li>Usunąć nadsącz z szklanej fiolki i zastąpić go 1ml świeżego buforu do płukania kulek (Bead Wash buffer).</li>
</ol>
2. Kontrola jakości aAPC i ładowania peptydów oraz przechowywanie
<ol>
	<li>Do probówek FACS dodać ˜5×105 kulek w 100μl buforu płuczącego do FACS, a następnie barwić za pomocą 1μl przeciwciała anti-mouse IgG1-PE (rozpoznającego część Fc HLA-A2-Ig) oraz 1μl przeciwciała anti-mouse IgG2a-FITC (rozpoznającego część Fc mAb anty-CD28). Po 20-minutowym barwieniu w buforze płuczącym do FACS ponownie wypłukać i niezwłocznie odczytać wynik barwienia za pomocą cytometru przepływowego (Rysunek 4). </li>
 <li>Ładowanie peptydów na kulki: wypłukać kulki dwukrotnie w fiolce szklanej w 1ml sterylnego PBS. Resuspendować w 1ml sterylnego PBS, a następnie dodać 10μl peptydu CMV (1mg/ml)</li>
 <li>Policzyć kulki za pomocą hemocytometru i opisać fiolkę datą oraz stężeniem.</li>
 <li>aAPC są gotowe do użycia po co najmniej 3 dniach inkubacji z peptydem w temperaturze 4°C, aby zapewnić wystarczający czas wiązania peptydu z dimerem HLA-A2-Ig. Kulki można przechowywać w temperaturze 4°C, gdzie pozostają funkcjonalne przez co najmniej 6 miesięcy. </li>
</ol>
3. Izolacja ludzkich CTL
<ol>
	<li>Pobrać ok. 100ml świeżej krwi obwodowej od zdrowego dawcy dodatniego pod kątem HLA-A2 do 10 probówek BD Sodium Heparin Vacutainer. Należy użyć igły o rozmiarze 21G lub większej, aby zapobiec hemolizie.</li>
 <li>Wirować przy 300xg przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Ostrożnie usunąć górną warstwę osocza poprzez aspirację. Osocze może być wykorzystane jako suplement do pożywki hodowlanej.</li>
 <li>Zastąpić pobrane osocze sterylnym PBS i przenieść krew do sterylnej kolby hodowlanej T75 lub probówek stożkowych 50ml. Dobrze wymieszać krew z PBS, pipetując ciecz w górę i w dół.</li>
 <li>Po zebraniu całej krwi przygotować cztery dodatkowe probówki stożkowe 50ml i dodać 15ml Ficoll-Paque Plus.</li>
 <li>Powoli nałożyć 30-35ml komórek krwi na wierzch Ficollu w każdej probówce. Należy zachować wyraźną granicę między Ficollm a komórkami krwi.</li>
 <li>Wirować przy 500xg przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wyłączyć hamulec i ustawić przyspieszenie na jak najniższą wartość, aby zachować wyraźną granicę między warstwami.</li>
 <li>Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie aspirować warstwę PBMC i zebrać PBMC do nowej probówki stożkowej 50ml. Po zebraniu wszystkich PBMC dodać 30ml PBS i wirować przy 400xg przez 10 min. Odrzucić nadsącz i wyprać jeszcze raz 30ml PBS, aby usunąć resztki Ficollu.</li>
 <li>Przystąpić do izolacji limfocytów T CD8+ przy użyciu zestawu Miltenyi human CD8+ T cell isolation kit zgodnie z protokołem producenta. Zestaw ten zapewnia wysokie wzbogacenie w komórki CD8+ (zazwyczaj &gt;95%) poprzez usuwanie komórek CD8-.</li>
 <li>Policzyć limfocyty T CD8+. Oczekiwana czystość powinna wynosić powyżej 95%. Aby to potwierdzić, należy użyć 2x105 komórek i przeprowadzić analizę FACS CD4/3/8. Pozostałe CTL można wykorzystać natychmiast do stymulacji aAPC swoistej dla antygenu lub zamrozić do późniejszego użycia.</li>
</ol>
4. System hodowlany in vitro oparty na aAPC
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywki hodowlanej
 <ol>
 	<li>Dla 2X pożywki hodowlanej TF (czynnik wzrostu limfocytów T, przygotowany w laboratorium4): pełna pożywka RPMI z dodatkiem 5% autologicznej plazmy dawcy i 8% czynnika wzrostu limfocytów T. </li>
 <li>Autologiczną plazmę dawcy można zastąpić inaktywowaną termicznie ludzką surowicą grupy AB. </li>
 </ol>
 
 </li>
 <li>Resuspendować 1 milion CTL w 8 ml 2X pożywki hodowlanej TF oraz 8 ml pełnej pożywki RPMI, dodać 1×106 aAPC i dokładnie wymieszać. </li>
 <li>Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść komórki na 96-dołkowe płytki hodowlane z dnem w kształcie litery U (160 μl na dołek). </li>
 <li>Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 7 dni. W 4. dniu zasilić komórki, dodając 80 μl/dołek pożywki TF 2X. </li>
 <li>Komórki są gotowe do zbioru w 7. dniu. Po zbiorze przyłożyć komórki do magnesu i usunąć stare aAPC. </li>
 <li>Specyficzność antygenową można określić poprzez barwienie tetramerami zgodnie z protokołem producenta. Barwienie fenotypowe oraz barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych wykonuje się zgodnie z naszym poprzednim badaniem3. </li>
 <li>Zebrane komórki można ponownie wysiać z aAPC w tych samych warunkach. Oczekuje się zwiększenia liczby komórek oraz specyficzności antygenowej po wielokrotnej stymulacji. </li>
 
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Przykład aAPC po koniugacji HLA A2-Ig i anty-CD28 przedstawiono na rysunku 4. Pomyślna koniugacja białek jest widoczna poprzez wyraźne przesunięcie odpowiadającego im barwienia przeciwciałami. Podczas gdy częstotliwość występowania CTL swoistych dla CMV we krwi obwodowej wynosi zazwyczaj 0,5-1%, po jednym tygodniu stymulacji za pośrednictwem aAPC specyficzność ta może osiągnąć 55-93% (rysunki 2 i 3). Ekspansja CTL swoistych dla antygenu może być bardzo zróżnicowana u różnych dawców, jednak wyniki są powtarzalne u tego samego dawcy. Poprzez ekstrapolację można stwierdzić, że ekspansja komórek swoistych dla CMV może być tysiąckrotnie większa w porównaniu z poziomami prekursorów bezpośrednio ex vivo (dane nie przedstawiono). Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych (rysunek 3) wykazuje, że te wyekspandowane CTL są polifunkcyjne, a nie wyczerpane, po przedłużonej hodowli komórkowej i znaczącej proliferacji.
<img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig1.jpg" alt="Schemat procesu przeszczepu szpiku kostnego z limfocytami CTL i cytotoksycznymi limfocytami T specyficznymi dla CMV." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Reprezentatywny schemat blokowy ekspansji ex vivo ludzkich CTL oparty na aAPC do immunoterapii adopcyjnej w allogenicznym HSCT
<img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig2.jpg" alt="Wykres cytometrii przepływowej; CD8 FITC względem tetrameru PE; analiza populacji komórek; wartości procentowe w kwadrantach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywny wynik barwienia tetramerem dla CTL swoistych dla CMV wygenerowanych przez aAPC po jednym tygodniu hodowli
<img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig3.jpg" alt="Wykres kropkowy cytometrii przepływowej; ekspresja TNF względem IFN; analiza populacji komórek; dane ilościowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywny wynik barwienia wewnątrzkomórkowego cytokin dla CTL specyficznych dla CMV generowanych przez aAPC (specyficzność CMV wyniosła 61%) 
<img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig4.jpg" alt="Histogram cytometrii przepływowej, porównanie intensywności fluorescencji Mouse IgG2a FITC i Mouse IgG1 PE." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Reprezentatywny wynik barwienia kulek M-450 Epoxy po koniugacji z białkiem, zabarwionych przeciwciałami anti-mouse IgG1-PE i anti-mouse IgG2-FITC

<ol><li>Walter, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).</li>
<li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer%3A+a+clinical+path+to+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat Med. 9, 619-619 (2003).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+antigen-presenting+cells%3A+artificial+solution+for+real+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases.</a> Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Opisany tutaj system aAPC jest wydajnym systemem do ekspansji ex vivo ludzkich CTL przeciwko różnorodnym antygenom. Należy zwrócić szczególną uwagę na jakość koniugacji białek oraz równomierny rozkład aAPC i CTL w hodowli na płytce 96-dołkowej. Stosując to podejście, udało nam się prowadzić ekspansję CTL przez ponad 8 tygodni, podczas których zwiększyliśmy liczbę antygenowo swoistych CTL nawet milionkrotnie4. Opracowano różne systemy sztucznych APC wykorzystujące linie komórkowe lub inne platformy bezkomórkowe5; jednak zgodnie z opublikowanymi danymi każdy system posiada unikalny profil w zakresie ekspansji i swoistości, co wspiera różne zastosowania. Co istotne, ponieważ jakość CTL jest równie ważna jak ich ilość, oczekuje się, że polifunkcyjność CMV-swoistych CTL generowanych przez nasz system zapewni wyższą skuteczność przeciwwirusową.

<table><tbody><tr><td>Probówka Vacutainer (zawierająca heparynę)</td><td>BD Biosciences</td><td>367874</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji ludzkich limfocytów T CD8+</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-156</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-450 Epoxy</td><td>Invitrogen</td><td>140.11</td><td></td></tr><tr><td>Magnes Dynal MPC-1</td><td>Invitrogen</td><td>120-01D</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>Dimer HLA-A2-Ig X</td><td>BD Biosciences</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>Tetramer iTAgMHC (HLA-A2-CMV)-PE</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>T20099</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta płytka mikrotitracyjna Falcon 96-dołkowa</td><td>BD Biosciences</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało szczurze anty-mysie IgG2a-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553390</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało kozie anty-mysie IgG1-PE</td><td>Invitrogen</td><td>P21129</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka surowica grupy AB</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S40110</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD8a-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0772</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD8a-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340684</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie anty-ludzkie IFN&amp;#947;-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>340449</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie anty-ludzkie TNF&amp;#945;-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>340512</td><td></td></tr></tbody></table>

sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na hla-ig dla efektywnej ekspansji ludzkich ctl ex vivo

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

Limfocyty T cytotoksyczne (CTL) o optymalnej funkcji efektorowej odgrywają kluczową rolę w zapewnianiu ochrony przed różnymi infekcjami wewnątrzkomórkowymi oraz nowotworami. Jednak u niektórych osób może występować supresyjne mikrośrodowisko immunologiczne i, w przeciwieństwie do aktywacji CTL, ich autologiczne komórki prezentujące antygen mogą dążyć do tolerancji lub anergii swoistych dla antygenu CTL. W rezultacie, choć wciąż znajduje się w fazie eksperymentalnej, adoptywna immunoterapia oparta na CTL stała się obiecującą metodą leczenia różnych schorzeń, takich jak nowotwory i infekcje wirusowe. W pierwszych eksperymentach do leczenia zakażeń CMV (cytomegalowirusem) u pacjentów po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego z niedoborem odporności zastosowano CTL swoiste dla CMV, namnożone ex vivo. Choć u takich pacjentów często występuje zagrażająca życiu wiremia CMV, żaden z pacjentów otrzymujących namnożone CTL nie rozwinął choroby związanej z CMV, co sugeruje, że odporność przeciw CMV została ustanowiona przez adoptywnie przetransferowane CTL1. Obiecujące wyniki zaobserwowano również w przypadku czerniaka, co można rozszerzyć na inne rodzaje nowotworów2.
Choć istnieje wiele sposobów stymulacji i ekspansji ludzkich CTL ex vivo, obecne podejścia są ograniczone przez koszty i bariery techniczne. Na przykład aktualny złoty standard opiera się na wykorzystaniu autologicznych DC. Wymaga to od każdego pacjenta oddania znacznej liczby leukocytów, a ponadto jest bardzo kosztowne i pracochłonne. Co więcej, szczegółowa charakterystyka in vitro CTL ekspandowanych za pomocą DC wykazała, że wykazują one jedynie suboptimalną funkcję efektorową 3.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy wysoce wydajny system oparty na aAPC do ekspansji ex vivo ludzkich CTL specyficznych dla CMV w celu immunoterapii adopcyjnej (Rysunek 1). aAPC otrzymano poprzez sprzężenie magnetycznych kulek o rozmiarze komórki z ludzkim dimerem HLA-A2-Ig oraz przeciwciałem anty-CD28mAb4. Po przygotowaniu aAPC można je obciążyć różnymi peptydami zainteresowania, a pozostają one funkcjonalne przez wiele miesięcy. W niniejszym raporcie aAPC obciążono dominującym peptydem CMV, pp65 (NLVPMVATV). Po hodowaniu oczyszczonych ludzkich CTL CD8+ od zdrowego dawcy z aAPC przez jeden tydzień, specyficzność CTL dla CMV może gwałtownie wzrosnąć do poziomu 98% (Rysunek 2), a ich liczba może zostać zwiększona ponad 10 000 razy. Jeśli wymagana jest większa liczba CTL specyficznych dla CMV, dalszą ekspansję można łatwo osiągnąć poprzez powtarzalną stymulację aAPC. Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna wykazuje, że rozszerzone komórki posiadają fenotyp efektorowo-pamięciowy i wytwarzają znaczne ilości zarówno TNFα, jak i IFNγ (Rysunek 3).

Opisano nową metodę indukcji i ekspansji antygenowo swoistych limfocytów T, niezależną od komórek dendrytycznych (DC). Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) oparte na HLA A2-Ig są ładowane peptydami ograniczonymi przez HLA-A2 w celu efektywnej ekspansji CTL o różnej swoistości antygenowej. Technologia ta wykazuje duży potencjał w zastosowaniu w immunoterapii adoptywnej opartej na CTL.

Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo

Limfocyty T cytotoksyczne (CTL) o optymalnej funkcji efektorowej odgrywają kluczową rolę w zapewnianiu ochrony przed różnymi infekcjami wewnątrzkomórkowymi oraz nowotworami. Jednakże osoby...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) do ekspansji ex vivo ludzkich CTL specyficznych dla antygenu w celu ich potencjalnego zastosowania w immunoterapii adoptywnej. Osiąga się to poprzez uprzednie sprzężenie HLA-A2-Ig oraz monoklonalnego przeciwciała anty-CD28 przeciwko ludzkim komórkom z magnetycznymi kuleczkami DynaBeads, w celu stworzenia aAPC. Drugim krokiem procedury jest przeprowadzenie kontroli jakości oraz ładowanie peptydów do aAPC. Trzecim krokiem procedury jest izolacja ludzkich limfocytów T CD8+ z krwi obwodowej. Ostatnim krokiem procedury jest inkubacja limfocytów T CD8+ z aAPC przez tydzień.Następnie CTL są zbierane i charakteryzowane przed ich wykorzystaniem lub ponowną stymulacją przez kolejny tydzień, aby osiągnąć pożądany poziom ich specyficzności i ekspansji. W rezultacie można uzyskać wyniki testów lub barwień wykazujące, że CTL eksponowane na działanie A A PC wykazują zwiększoną specyficzność antygenową. Dzisiaj zaprezentuję system A A PC oparty na HI IG oraz sposób wykorzystania tego systemu do efektywnej ekspansji ludzkich CTL specyficznych dla CMV ex vivo w porównaniu z innymi istniejącymi metodami.Nasza technologia A A PC oferuje kilka istotnych zalet. Jest ona dostępna od ręki, w nieograniczonej ilości i można powiedzieć, że A A PC może być stosowana dla wszystkich dawców HRAA dwa dodatnich. Dobrze, zacznijmy. Przenieś 1 mL kulek M four 50 epoxy z roztworu stokowego zawierającego około 400 milionów kulek do sterylnej szklanej fiolki z nakrętką.Przemyj kuleczki raz, dodając 1 mL buforu boid, a następnie przykładając szklaną probówkę do magnesu Dynalon NBC 1, podczas gdy kuleczki przylegają do ścianki probówki. Usuń nadsącz za pomocą aspiracji. Resuspenduj kuleczki w mieszaninie buforu boid, HLA A2 IG dimer oraz przeciwciała monoklonalnego anty-ludzkiego CD 28.Następnie, aby ułatwić konjugację białka z koralkami, inkubuj szklaną fiolkę na rotatorze w temperaturze 4°C przez 24 godziny. Następnie umieść probówkę w magnesie MPC 1 i usuń cały bufor boranowy. Po usunięciu buforu przemyj koralki dwukrotnie 1 ml buforu do przemywania koralek.Następnie inkubuj kuleczki w 1 mL buforu do płukania kuleczek i rotuj fiolkę w temperaturze 4 °C przez kolejne 24 h, aby zablokować pozostałe miejsca wiązania białek na kuleczkach. Następnie usuń bufor z szklanej fiolki i zastąp go 1 mL świeżego buforu do płukania kuleczek. Przenieś 100 µL buforu do płukania FACS do probówek do FACS, a następnie dodaj 5 × 10⁵ kuleczek.Barwienie kulek należy przeprowadzić, dodając 1 µL przeciwciał anti muse IgG 1 PE oraz 1 µL przeciwciał anti muse IgG 2 AF, a następnie inkubując przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Do każdej z barwionych próbek należy dodać 3 mL buforu piorącego FACS. Następnie należy odwirować kompleksy APC z prędkością 300 ×g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.Resuspenduj A A PC w świeżym buforze fax i niezwłocznie odczytaj wynik barwienia za pomocą cytometru przepływowego. Przemyj kuleciki dwukrotnie sterylnym PBS, tak jak poprzednio. Następnie nałóż na kuleciki 10 µL peptydu CMV.Policz kuleczki za pomocą hemocytometru, a następnie opisz je datą i stężeniem kuleczek, podając liczbę kuleczek na mililitr. Inkubuj A A PC z peptydem przez co najmniej trzy dni w temperaturze 4°C. Odwiruj około 100 ml świeżej krwi obwodowej od dawcy dodatniego pod kątem HLA A2 w 10 probówkach vacutainer z heparyną sodową przy 300 G przez 10 minut.W temperaturze pokojowej ostrożnie usuń górną warstwę osocza za pomocą aspiracji. Zastąp pobrane osocze sterylnym PBS i przenieś krew do sterylnej kolby hodowlanej T 75. Dobrze wymieszaj krew z PBS poprzez pipetowanie, gdy cała krew zostanie zebrana z 15 mililitrów fial pack plus do czterech 50 mililitrowych probówek stożkowych.Powoli nanieś 30 do 35 ml komórek krwi na powierzchnię warstwy fial w każdej probówce. Utrzymując wyraźną granicę między fial a komórkami krwi, odwiruj gradient krwi i fial z prędkością 500 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, z wyłączonym hamulcem i przy jak najniższym przyspieszeniu, aby zachować wyraźną granicę między warstwami. Po wirowaniu odessij górną warstwę osocza, a następnie za pomocą pipety serologicznej ostrożnie odessij warstwę PBMC. Przenieś PBMC do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Po zebraniu wszystkich PBMC dodaj do komórek 30 ml PBS i poddaj je wirowaniu.Następnie odrzuć supernatant i przemyj osad. Powtórz tę czynność raz jeszcze, używając 30 mililitrów PBS, aby usunąć pozostałe fi call, a następnie przeprowadź wzbogacenie populacji limfocytów T CD8+ przy użyciu zestawu do izolacji ludzkich limfocytów T CD8+ firmy Milton. Zgodnie z protokołem producenta, policz limfocyty T CD8+ i potwierdź czystość preparatu za pomocą analizy FACS.Resuspender 1 milion CTL w ośmiu mililitrach pożywki T-cell growth factor two x oraz ośmiu mililitrach kompletnej pożywki RPMI, a następnie dodać 1 × 10⁶ mieszaniny A A PC. Następnie, używając pipety wielokanałowej, nanieść 160 µL komórek na każdą studienkę 96-dołkowej płytki hodowlanej o dnie w kształcie litery U. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez siedem dni.W czwartym dniu podaj komórkom 80 µL na dołek pożywki wzrostowej dla limfocytów T (T-cell growth Factor two x culture medium). Zbierz komórki w siódmym dniu, a następnie przyłóż je do magnesu, aby usunąć stary A A PC, gdy wszystkie kuleczki przywrą do ścianki probówki.Zebierz i przenieś komórki do drugiej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów, a następnie policz liczbę komórek. Określ specyficzność antygenową A A PC za pomocą barwienia tetramerem zgodnie z protokołem producenta. Ponownie poddaj zebrane komórki działaniu nowych A A PC w tych samych warunkach, aby zwiększyć liczbę komórek o określonej specyficzności antygenowej.Poniżej przedstawiono reprezentatywny wynik barwienia tetramerem dla specyficznych dla CMV limfocytów CTL wygenerowanych przez A A PC po jednym tygodniu hodowli. Przedstawiony tutaj reprezentatywny wynik wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin dla specyficznych dla CMV limfocytów CTL wygenerowanych przez A-A-P-C-C-M-V wykazał specyficzność na poziomie 61% w barwieniu tetramerem. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie limfocytów T, takie jak sposób identyfikacji optymalnych warunków hodowli oraz wymagań dotyczących modulacji funkcjonalnej limfocytów T.Opisana metoda dostarczyła wiedzy na temat leczenia chorób wirusowych. Można ją również zastosować w innych dziedzinach, takich jak onkologia.

hla-ig-based-artificial-antigen-presenting-cells-for-efficient-ex

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Komórki prezentujące antygen na bazie HLA-Ig do efektywnej ex vivo ekspansji ludzkich limfocytów T cytotoksycznych

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

W niniejszej pracy opisujemy pierwszą zgodną z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) metodę produkcji wirusowo-specyficznych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) z krwi pępowinowej, która jest źródłem głównie naiwnych limfocytów T.

Ekspansja cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej nakierowanych na cytomegalowirus, wirusa Epstein-Barr i adenowirusa

W niniejszej pracy opisujemy metodę aktywacji i ekspansji ludzkich komórek NKT z populacji zmieszanych limfocytów T przy użyciu sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC). Wykorzystanie aAPC opartych na CD1d zapewnia zestandaryzowaną metodę generowania wysokiej liczby funkcjonalnych komórek NKT.

Aktywacja i ekspansja komórek Natural Killer T (NKT) za pośrednictwem sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC)

Przedstawiono wytyczne dotyczące generowania zabójczych komórek prezentujących sztuczny antygen, KaAPC, skutecznego narzędzia do in vitro wyczerpywania ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu oraz alternatywnego rozwiązania dla immunoterapii komórkowej w leczeniu chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu bez narażania pozostałego układu odpornościowego.

Zabójcze sztuczne komórki prezentujące antygen (KaAPC) do skutecznego zubożania in vitro ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu

Ten artykuł opisuje metodę generowania i rozmnażania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na zdefiniowany alloantygen. Protokół ten można dostosować do klonowania ludzkich limfocytów T specyficznych dla różnych ligandów peptyd-MHC.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Tutaj opisujemy nowatorską metodę generowania specyficznych dla antygenu receptorów limfocytów T (TCR) poprzez parowanie TCRα lub TCRβ istniejącego TCR, posiadającego swoistość antygenową będącą przedmiotem zainteresowania, z komplementarnym półłańcuchem repertuaru obwodowych receptorów limfocytów T. Generowane de novo TCR zachowują swoistość antygenową z różnym powinowactwem.

Generowanie receptorów ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu de novo poprzez transdukcję retrowirusową centralnego hemiłańcucha

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego i powtarzalnego generowania biologicznie inspirowanych, biodegradowalnych komórek prezentujących antygen sztuczny (aAPC) o regulowanym rozmiarze, kształcie i prezentacji białka powierzchniowego do ekspansji limfocytów T ex vivo lub in vivo.

Wytwarzanie anizotropowych polimerowych sztucznych komórek prezentujących antygen do aktywacji limfocytów T CD8 +

Limfocyty T specyficzne dla antygenu są trudne do scharakteryzowania lub wykorzystania w terapiach ze względu na ich ekstremalnie niską częstotliwość. W tym miejscu przedstawiamy protokół rozwoju cząsteczki magnetycznej, która może wiązać się z limfocytami T specyficznymi dla antygenu, aby wzbogacić te komórki, a następnie rozszerzyć je kilkaset razy zarówno w celu charakteryzacji, jak i terapii.

Wzbogacanie i rozszerzanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych

Ten protokół opisuje użycie jednołańcuchowych kompleksów MHC klasy I do badania interakcji molekularnych w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8+: generowanie zmodyfikowanych komórek prezentujących antygen wyrażających konstrukty jednołańcuchowe, hodowla klonu ludzkich komórek T CD8+ i eksperymenty z aktywacją limfocytów T.

Zastosowanie technologii jednołańcuchowej MHC do badania koagonizmu w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8 +

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Prezentowany jest protokół ekspansji produktu leczniczego limfocytów T Gamma-Delta (γδ). Limfocyty są izolowane przez elutriację i wzbogacane γδ kwasem zoledronowym i interleukiną-2. Limfocyty T alfa-beta są wyczerpywane za pomocą klinicznego urządzenia do separacji magnetycznej. Komórki γδ są hodowane wspólnie z pochodzącymi z K562, sztucznymi komórkami prezentującymi antygen i ekspandowane.

Ekspansja i wzbogacanie limfocytów T gamma-Delta (γδ) z aferezowanego produktu ludzkiego

Poznaj metodę ekspansji ex vivo ludzkich CTL specyficznych dla antygenu przy użyciu sztucznych komórek prezentujących antygen opartych na HLA-Ig. Technika ta wspiera rozwój immunoterapii adoptywnej.

Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo

Przeglądaj więcej filmów