Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) do ekspansji ex vivo ludzkich CTL specyficznych dla antygenu w celu ich potencjalnego zastosowania w immunoterapii adoptywnej. Osiąga się to poprzez uprzednie sprzężenie HLA-A2-Ig oraz monoklonalnego przeciwciała anty-CD28 przeciwko ludzkim komórkom z magnetycznymi kuleczkami DynaBeads, w celu stworzenia aAPC. Drugim krokiem procedury jest przeprowadzenie kontroli jakości oraz ładowanie peptydów do aAPC. Trzecim krokiem procedury jest izolacja ludzkich limfocytów T CD8+ z krwi obwodowej. Ostatnim krokiem procedury jest inkubacja limfocytów T CD8+ z aAPC przez tydzień.

Następnie CTL są zbierane i charakteryzowane przed ich wykorzystaniem lub ponowną stymulacją przez kolejny tydzień, aby osiągnąć pożądany poziom ich specyficzności i ekspansji. W rezultacie można uzyskać wyniki testów lub barwień wykazujące, że CTL eksponowane na działanie A A PC wykazują zwiększoną specyficzność antygenową. Dzisiaj zaprezentuję system A A PC oparty na HI IG oraz sposób wykorzystania tego systemu do efektywnej ekspansji ludzkich CTL specyficznych dla CMV ex vivo w porównaniu z innymi istniejącymi metodami.

Nasza technologia A A PC oferuje kilka istotnych zalet. Jest ona dostępna od ręki, w nieograniczonej ilości i można powiedzieć, że A A PC może być stosowana dla wszystkich dawców HRAA dwa dodatnich. Dobrze, zacznijmy. Przenieś 1 mL kulek M four 50 epoxy z roztworu stokowego zawierającego około 400 milionów kulek do sterylnej szklanej fiolki z nakrętką.

Przemyj kuleczki raz, dodając 1 mL buforu boid, a następnie przykładając szklaną probówkę do magnesu Dynalon NBC 1, podczas gdy kuleczki przylegają do ścianki probówki. Usuń nadsącz za pomocą aspiracji. Resuspenduj kuleczki w mieszaninie buforu boid, HLA A2 IG dimer oraz przeciwciała monoklonalnego anty-ludzkiego CD 28.

Następnie, aby ułatwić konjugację białka z koralkami, inkubuj szklaną fiolkę na rotatorze w temperaturze 4°C przez 24 godziny. Następnie umieść probówkę w magnesie MPC 1 i usuń cały bufor boranowy. Po usunięciu buforu przemyj koralki dwukrotnie 1 ml buforu do przemywania koralek.

Następnie inkubuj kuleczki w 1 mL buforu do płukania kuleczek i rotuj fiolkę w temperaturze 4 °C przez kolejne 24 h, aby zablokować pozostałe miejsca wiązania białek na kuleczkach. Następnie usuń bufor z szklanej fiolki i zastąp go 1 mL świeżego buforu do płukania kuleczek. Przenieś 100 µL buforu do płukania FACS do probówek do FACS, a następnie dodaj 5 × 10⁵ kuleczek.

Barwienie kulek należy przeprowadzić, dodając 1 µL przeciwciał anti muse IgG 1 PE oraz 1 µL przeciwciał anti muse IgG 2 AF, a następnie inkubując przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Do każdej z barwionych próbek należy dodać 3 mL buforu piorącego FACS. Następnie należy odwirować kompleksy APC z prędkością 300 ×g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

Resuspenduj A A PC w świeżym buforze fax i niezwłocznie odczytaj wynik barwienia za pomocą cytometru przepływowego. Przemyj kuleciki dwukrotnie sterylnym PBS, tak jak poprzednio. Następnie nałóż na kuleciki 10 µL peptydu CMV.

Policz kuleczki za pomocą hemocytometru, a następnie opisz je datą i stężeniem kuleczek, podając liczbę kuleczek na mililitr. Inkubuj A A PC z peptydem przez co najmniej trzy dni w temperaturze 4°C. Odwiruj około 100 ml świeżej krwi obwodowej od dawcy dodatniego pod kątem HLA A2 w 10 probówkach vacutainer z heparyną sodową przy 300 G przez 10 minut.

W temperaturze pokojowej ostrożnie usuń górną warstwę osocza za pomocą aspiracji. Zastąp pobrane osocze sterylnym PBS i przenieś krew do sterylnej kolby hodowlanej T 75. Dobrze wymieszaj krew z PBS poprzez pipetowanie, gdy cała krew zostanie zebrana z 15 mililitrów fial pack plus do czterech 50 mililitrowych probówek stożkowych.

Powoli nanieś 30 do 35 ml komórek krwi na powierzchnię warstwy fial w każdej probówce. Utrzymując wyraźną granicę między fial a komórkami krwi, odwiruj gradient krwi i fial z prędkością 500 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, z wyłączonym hamulcem i przy jak najniższym przyspieszeniu, aby zachować wyraźną granicę między warstwami. Po wirowaniu odessij górną warstwę osocza, a następnie za pomocą pipety serologicznej ostrożnie odessij warstwę PBMC. Przenieś PBMC do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Po zebraniu wszystkich PBMC dodaj do komórek 30 ml PBS i poddaj je wirowaniu.

Następnie odrzuć supernatant i przemyj osad. Powtórz tę czynność raz jeszcze, używając 30 mililitrów PBS, aby usunąć pozostałe fi call, a następnie przeprowadź wzbogacenie populacji limfocytów T CD8+ przy użyciu zestawu do izolacji ludzkich limfocytów T CD8+ firmy Milton. Zgodnie z protokołem producenta, policz limfocyty T CD8+ i potwierdź czystość preparatu za pomocą analizy FACS.

Resuspender 1 milion CTL w ośmiu mililitrach pożywki T-cell growth factor two x oraz ośmiu mililitrach kompletnej pożywki RPMI, a następnie dodać 1 × 10⁶ mieszaniny A A PC. Następnie, używając pipety wielokanałowej, nanieść 160 µL komórek na każdą studienkę 96-dołkowej płytki hodowlanej o dnie w kształcie litery U. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez siedem dni.

W czwartym dniu podaj komórkom 80 µL na dołek pożywki wzrostowej dla limfocytów T (T-cell growth Factor two x culture medium). Zbierz komórki w siódmym dniu, a następnie przyłóż je do magnesu, aby usunąć stary A A PC, gdy wszystkie kuleczki przywrą do ścianki probówki.

Zebierz i przenieś komórki do drugiej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów, a następnie policz liczbę komórek. Określ specyficzność antygenową A A PC za pomocą barwienia tetramerem zgodnie z protokołem producenta. Ponownie poddaj zebrane komórki działaniu nowych A A PC w tych samych warunkach, aby zwiększyć liczbę komórek o określonej specyficzności antygenowej.

Poniżej przedstawiono reprezentatywny wynik barwienia tetramerem dla specyficznych dla CMV limfocytów CTL wygenerowanych przez A A PC po jednym tygodniu hodowli. Przedstawiony tutaj reprezentatywny wynik wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin dla specyficznych dla CMV limfocytów CTL wygenerowanych przez A-A-P-C-C-M-V wykazał specyficzność na poziomie 61% w barwieniu tetramerem. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie limfocytów T, takie jak sposób identyfikacji optymalnych warunków hodowli oraz wymagań dotyczących modulacji funkcjonalnej limfocytów T.

Opisana metoda dostarczyła wiedzy na temat leczenia chorób wirusowych. Można ją również zastosować w innych dziedzinach, takich jak onkologia.