Sztuczne komórki prezentujące antygen na bazie HLA-IG do efektywnej ekspansji ex vivo ludzkiego CTL

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie sztucznych komórek prezentujących antygen lub A PC do ekspansji ex vivo CTL specyficznej dla ludzkiego antygenu do potencjalnego zastosowania w immunoterapii adoptywnej. Osiąga się to poprzez najpierw sprzężenie przeciwciała monoklonalnego HLA A two IG i anty-ludzkiego CD 28 z magnetycznymi kulkami dyna w celu wytworzenia A A PC. Drugim krokiem procedury jest przeprowadzenie kontroli jakości i obciążenie peptydami komputera AA. Trzecim etapem procedury jest wyizolowanie ośmiu dodatnich limfocytów T CD z ludzkiej krwi obwodowej. Ostatnim etapem procedury jest inkubacja ośmiu dodatnich limfocytów T CD z PC A przez tydzień.

CTL są następnie zbierane i charakteryzowane przed użyciem lub ponowną stymulacją przez kolejny tydzień, aby osiągnąć pożądany poziom ich specyficzności i ekspansji. Ostatecznie można uzyskać wyniki barwienia lub barwienia, które pokazują, że CTL, które są ekspandowane w obecności A A PC, mają zwiększoną swoistość antygenową. Dzisiaj pokażę Wam system komputerowy oparty na HI IG i jak wykorzystać ten system do efektywnej ekspansji exvivo ludzkiego CTL specyficznego dla CMV w porównaniu z innymi istniejącymi metodami.

Nasza technologia komputerowa AA ma kilka ważnych zalet. Jest dostępny z półki, ma nieograniczoną ilość i powiedzmy, że komputer PC może być używany dla wszystkich dwóch dodatnich dawców HRAA. Dobra, zacznijmy Przenieś jeden mililitr M czterech 50 kulek epoksydowych z zapasu około 400 milionów koralików do sterylnego pilnika szklanego.

Umyj kulki raz, dodając jeden mililitr buforu boidowego, a następnie umieszczając szklaną fiolkę na magnesie NBC, podczas gdy kulki są przyklejone do boku fiolki. Usuń snat przez aspirację Resus. Zawiesić kulki w mieszaninie buforu boidowego HLA A, dwóch dimerów IG i przeciwciała monoklonalnego anty-ludzkiego CD 28.

Następnie, aby ułatwić koniugację białka z kulkami, obracaj szklaną fiolkę na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie umieść rurkę w jednym magnesie MPC i usuń cały bufor boranowy. Po usunięciu buforu umyj kulki dwukrotnie jednym mililitrem bufora do płukania kulek.

Teraz inkubuj kulki w jednym mililitrze buforu do płukania kulek i obracaj fiolkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kolejne 24 godziny, aby zablokować resztkowe miejsca wiązania białek na kulkach. Następnie wyjmij bufor ze szklanej fiolki i zastąp go jednym mililitrem świeżego buforu do płukania kulek. Przenieś 100 mikrolitrów buforu do płukania faksów do probówek faksowych, a następnie dodaj pięć razy po 10 do piątych koralików.

Wybarwić koraliki jednym mikrolitrem anty muse IgG, jednym PE i jednym mikrolitrem anty muse IgG dwa razy na raz po barwieniu przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przy trzech mililitrach buforu do płukania faksu do każdej z próbek barwiących. Następnie granuluj A PC, spędzając w temperaturze 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Reus zawiesić komputer AA w nowym buforze faksu i natychmiast odczytać wynik barwienia za pomocą cytometru przepływowego. Umyj koraliki dwukrotnie sterylnym PBS, tak jak poprzednio. Następnie załaduj koraliki 10 mikrolitrami peptydu CMV.

Policz koraliki za pomocą hemocytometru, a następnie oznacz je datą i stężeniem kulek. Jako koraliki na mililitr. Inkubować A A PC z peptydem przez co najmniej trzy dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odwirować około 100 mililitrów świeżej krwi obwodowej od dwu-dodatniego dawcy HLA A w 10 probówkach próżniowych heparyny sodowej w temperaturze 300 Gs przez 10 minut.

W temperaturze pokojowej ostrożnie usuń górną warstwę plazmy przez aspirację. Zastąp pobrane osocze sterylnym PBS i przenieś krew do sterylnej kolby hodowlanej T 75. Dobrze wymieszać krew i PBS przez pipetowanie, gdy cała krew zostanie zebrana w 15 mililitrach fial pack plus do czterech 50-mililitrowych stożkowych probówek.

Powoli nałóż od 30 do 35 mililitrów krwinek na wierzch fiala w każdej probówce. Utrzymując odrębną granicę faz między krwinkami fiala i krwi, odwirować gradient krwi i fialu w temperaturze 500 GS przez 20 minut w temperaturze pokojowej z odrywaniem i przyspieszeniem tak niskim, jak to możliwe, aby utrzymać wyraźną granicę między warstwami po odwirowaniu, odessać górną warstwę osocza, a następnie użyć pipety serologicznej do ostrożnego odessania warstwy PBMC. Przenieś PBMC do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, gdy wszystkie PBMC zostaną zebrane w ilości 30 mililitrów PBS do komórek i odwiruj je.

Następnie wyrzuć supernat i umyj osad. Jeszcze raz z 30 mililitrami PBS, aby usunąć resztkowe wywołanie fi, a następnie wzbogacić populację komórek T CD osiem dodatnich za pomocą zestawu do izolacji ośmiu dodatnich komórek T Milton Human CD. Zgodnie z protokołem producenta, należy policzyć na płycie CD osiem dodatnich limfocytów T i potwierdzić czystość za pomocą analizy faksowej.

Zawieś 1 milion CTL w ośmiu mililitrach czynnika wzrostu komórek T, dwóch pożywkach hodowlanych x plus osiem mililitrów kompletnej pożywki RPMI i dodaj jeden razy 10 z sześciu mieszanek A A. Następnie użyj pipety wielokanałowej, aby umieścić 160 mikrolitrów komórek w każdym dołku na 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej w kształcie litery U. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez siedem dni.

Nakarm komórki czwartego dnia 80 mikrolitrami na studzienkę wzrostu komórek T. Czynnik drugi x pożywka hodowlana. Zbierz komórki w siódmym dniu, a następnie umieść je na magnesie, aby usunąć stary komputer AA, gdy wszystkie koraliki przylegają do ścianki fiolki.

Zbierz i przenieś komórki do innej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i policz liczbę komórek. Określić swoistość antygenową A A PC przez barwienie tetramerem zgodnie z protokołem producenta. Odtwórz ponownie pobrane komórki za pomocą nowego komputera A A w tych samych warunkach, aby wygenerować zwiększoną liczbę komórek do swoistości antygenowej.

Oto reprezentatywny wynik barwienia tetramerem CTL specyficznego dla CMV wygenerowanego przez A A PC po tygodniu hodowli. Pokazano tutaj reprezentatywny wewnątrzkomórkowy wynik barwienia cytokiny CTL specyficznego dla CMV generowanego przez A-A-P-C-C-M-V specyficzność wynosiła 61% przez barwienie tetramerowe. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie limfocytów T, takie jak to, w jaki sposób możemy zidentyfikować optymalne warunki hodowli i wymagania dotyczące funkcjonalnej modulacji komórek T.

Metoda Lowly dostarczyła informacji na temat leczenia chorób wirusowych. Może być również stosowany w innych dziedzinach, takich jak rak.