Kosztowo efektywna metoda śledzenia źródeł mikrobów z wykorzystaniem specyficznych wirusów ludzkich i zwierzęcych

Kosztowo efektywna metoda śledzenia źródeł mikrobiologicznych z wykorzystaniem specyficznych wirusów ludzkich i zwierzęcych. Badanie opisuje kosztowo efektywną metodę identyfikacji źródła zanieczyszczenia kałowo-moczowego lub zanieczyszczenia azotanami w wodzie, wykorzystującą ilościowy PCR do specyficznego oznaczania wirusów DNA ludzi, świń i bydła, w tym adenowirusów i poliomawirusów, zaproponowanych jako narzędzia do śledzenia źródeł mikrobiologicznych. Opracowaliśmy protokół koncentracji wirusów z 10 litrowych próbek wody poprzez flokulację organiczną, ekstrakcję kwasów nukleinowych wirusów z osadu przy użyciu odtłuszczonego mleka oraz oznaczanie wirusów DNA ludzi, bydła lub świń za pomocą ilościowego PCR.

Powszechnie wiadomo, że zanieczyszczenie witaminy drobnoustrojami stanowi istotne ryzyko dla zdrowia, dlatego konieczne jest określenie źródeł tego zanieczyszczenia. Zaproponowaliśmy wykorzystanie powszechnie występujących wirusów DNA jako narzędzi do śledzenia źródeł mikrobiologicznych. Wybranymi wirusami są adenowirusy i polyomawirusy.

Wirusy te są wydalane w sposób ciągły przez cały rok i we wszystkich obszarach geograficznych, co zostało wykazane w poprzednich badaniach. Opracowaliśmy wydajne i niskokosztowe metody zagęszczania wirusów w wodzie oraz pracujemy nad opracowaniem testów qPCR do ilościowego oznaczania adenowirusów świń i polyomawirusów bydlęcych.

Dodatkowo, w celu wykrycia zanieczyszczenia wody materiałem pochodzenia ludzkiego, stosujemy markery w postaci ludzkich adenowirusów oraz poliomawirusów NGC, których obecność badamy za pomocą qPCR. Pobieranie próbek wody. W niniejszym badaniu z każdej próbki wody pobiera się cztery powtórzenia po 10 litrów do plastikowych pojemników z płaskim dnem oraz jedną dodatkową próbkę jako kontrolę procesu. Ta ostatnia próbka zostanie zaszczepiona znaną ilością cząsteczek wirusowych służących jako kontrola.

W laboratorium przygotowuje się kontrolę negatywną, wykorzystując wodę z kranu spełniającą wymogi jakościowe w dodatkowym plastikowym pojemniku o pojemności 10 litrów. Jeśli próbka zawiera dużą ilość zawiesiny, piasku i innych zanieczyszczeń, należy odczekać 15 minut do ich osadzenia, a następnie przelać wodę do nowego pojemnika. Koncentracja wirusów poprzez flokulację organiczną.

Wykrywanie wirusów w próbkach wody o niskim lub umiarkowanym stopniu zanieczyszczenia wymaga skoncentrowania wirusów z co najmniej kilku litrów wody do znacznie mniejszej objętości. Procedura koncentracji obejmuje zakwaszenie 10 litrowych próbek wody, flokulację przy użyciu odtłuszczonego mleka, sedymentację kłaczków grawitacyjną oraz zebranie osadu w 10 mililitrach buforu fosforanowego. Aby rozpocząć ten proces, przygotowuje się roztwór odtłuszczonego mleka w sztucznej wodzie morskiej, rozpuszczając 10 gramów proszku mleka odtłuszczonego w jednym litrze sztucznej wody morskiej i ostrożnie dostosowując pH do 3,5 za pomocą kwasu solnego; kłaczki powinny być widoczne.

Przygotować roztwór bezpośrednio przed użyciem lub przechowywać w temperaturze 4°C przez 24 godziny. Próbki wody należy wymieszać, a następnie zmierzyć ich przewodność. Jeśli wartość ta będzie niższa niż 1,5 mS, należy dodać sole morskie.

Dostosuj pH próbki wody do wartości 3,5 poprzez dodanie kwasu solnego. Zapisz pH próbek przed i po kondycjonowaniu, a także objętość zużytego kwasu solnego. Należy również zapisać wartość przewodności.

Po skorygowaniu pH dodajemy 100 mililitrów odtłuszczonego mleka w proszku (stężenie 1%) do 10 litrowej próbki wody i mieszamy próbki przez 8 do 10 godzin, aby wirusy mogły zaabsorbować się do kłaczków. W przypadku próbki wzbogaconej, służącej jako kontrola procesu, do próbki dodaje się standardową objętość wirusa kontrolnego, na przykład jeden mililitr. Należy zaprzestać mieszania i pozwolić kłaczkom osadzić się grawitacyjnie przez 8 do 10 godzin.

Po 16 godzinach, zazwyczaj następnego dnia, będziemy mogli zebrać osad. W tym celu należy usunąć nadsącz za pomocą pompy perystaltycznej. Zebrać osad wraz z kłaczkami, około 500 mililitrów, do butelki do wirowania.

Wyrównać objętość w naczyniach poprzez dodanie odtłuszczonego mleka w proszku pH 3.5, a następnie odwirować naczynia w wirówcetce wysokoprędkościowej przy 8 000 Gs przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Natychmiast po zatrzymaniu wirówki ostrożnie wyjąć naczynia. Bardzo delikatnie odlać i usunąć nadsącz.

Rozpuścić pellet w każdej probówce dośrodkowej do uzyskania końcowej objętości 10 ml fosforanu, przeprowadzając ekstrakcję i kwantyfikację kwasów nukleinowych wirusów. Koncentrat wirusowy służy do ekstrakcji wirusowych kwasów nukleinowych, a specyficzne, interesujące nas adenowirusy i wirusy polyoma zostaną poddane kwantyfikacji za pomocą A-Q-P-C-R. Przeprowadzić ekstrakcję kwasów nukleinowych przy użyciu zestawu key amp viral RNA mini kit.

Lizę wirusów obecnych w 140 µL koncentratów wirusowych przeprowadza się ręcznie, a całkowite kwasy nukleinowe ekstrahuje się do 80 µL. Zestaw ten umożliwia wykorzystanie platformy zautomatyzowanej, takiej jak Key cube.

Kolejnym krokiem jest ilościowe oznaczenie genomu wirusa. Liczbę kopii w próbkach można wyznaczyć za pomocą ilościowego PCR z zastosowaniem sond TaqMan; ludzkie adenowirusy, wirusy JC Polyoma oraz bydlęce wirusy polyoma mogą być analizowane na tej samej płytce 96-dołkowej. Ponieważ wszystkie te analizy wykorzystują te same cykle amplifikacji, adenowirusy świń należy badać oddzielnie, na niezależnej płytce, w celu ilościowego oznaczenia docelowego wirusa.

Przygotuj mieszaninę do ilościowej PCR w czystym, oddzielnym obszarze. Po przygotowaniu mieszaniny, nanieś 15 µL do każdej studzienki, w tym do kontroli. W oddzielnym obszarze dodaj po 10 µL ekstraktów kwasów nukleowych z próbek; każdą próbkę należy przeprowadzić bezpośrednio oraz w dziesięciokrotnym rozcieńczeniu w wodzie oczyszczonej w dwóch powtórzeniach. Całkowita objętość jednej reakcji po dodaniu celu wyniesie 25 µL (15 µL mieszaniny oraz 10 µL próbki lub standardu). Przykryj studzienki zawierające próbki fragmentem pokrywy adhezyjnej.

Zachowaj pozostałą część pokrywki do następnego kroku. Rozcieńczanie standardów DNA. 10 µL roztworów standardowych DNA w stężeniach od 10⁰ do 10⁶ kopii genomu, dodając po 10 µL w trzech powtórzeniach, używając mikropipety przeznaczonej wyłącznie do standardów DNA.

Studzienki zawierające standardy z wcześniej wyciętą przylepną pokrywką. Rysunek ten przedstawia rozmieszczenie próbek zawiesiny standardów oraz kontroli w płytce 96-dołkowej.

Przeprowadź reakcję QPCR w odpowiednim systemie, wybierając właściwe parametry po aktywacji amplitude gold przez 10 minut. W temperaturze 95 °C wykonuje się 40 cykli amplifikacji po zakończeniu reakcji. Przechowuj dane i wyniki zgodnie z opisem w instrukcji obsługi użytego urządzenia.

Ilość DNA zostanie określona jako mediana danych uzyskanych po skorygowaniu współczynnika rozcieńczenia, jeśli będzie to konieczne. Wykres amplifikacji oraz krzywa standardowa uzyskane podczas ilościowego oznaczania adenowirusów świń wykazały współczynnik korelacji wynoszący 0,999. Dopuszczalne wartości nachylenia w ramach procedury mieszczą się w zakresie od -3,1 do -3,6.

Przebadano opisane wirusy ludzkie i zwierzęce w próbkach wód gruntowych z obszaru charakteryzującego się wysokim poziomem azotanów, aby określić źródła zanieczyszczeń. W czterech analizowanych powtórzeniach uzyskano wyniki dodatnie dla adenowirusów świńskich, ze średnią wartością 7,74 na 10⁻² kopii genomu na litr, co może wiązać się z obecnością gnojowicy świńskiej w obszarze wokół miejsca poboru prób i dowodzi obecności fekalnego zanieczyszczenia wód gruntowych pochodzenia świńskiego. W żadnej z badanych próbek nie stwierdzono zanieczyszczenia ludzkiego.

Dane wirologiczne zostały potwierdzone za pomocą zagnieżdżonej reakcji PCR oraz analizy sekwencjonowania.Wnioski. W niniejszym badaniu przedstawiliśmy wyniki analizy próbek wód podziemnych, wykazując zanieczyszczenie pochodzenia świńskiego przy braku zanieczyszczeń ludzkich lub bydlęcych. Procedura została również zastosowana do analizy wód kąpieliskowych, wody morskiej oraz rzecznej.

Przedstawiamy tutaj procedurę stosowania tych narzędzi do identyfikacji źródła zanieczyszczenia w wodach gruntowych, prezentując wysokie poziomy azotanów jako przykład możliwości zastosowania opracowanych metod do wykrywania źródła zanieczyszczenia w środowisku.