Name: Ekonomiczna metoda śledzenia źródeł mikrobiologicznych przy użyciu określonych wirusów ludzkich i zwierzęcych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Poznaj ekonomiczną metodę śledzenia źródeł mikrobiologicznych w wodzie przy użyciu wirusów adenowirusów i poliomawirusów. Technika ta wykorzystuje ilościowe PCR do identyfikacji zanieczyszczeń kałowych pochodzenia ludzkiego i zwierzęcego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo finansowana przez rząd Hiszpanii „Ministerio de Educación y Ciencia” (projekt AGL2008-05275-C01/ALI), w ramach projektów finansowanych z funduszy 7. ramy badawczej Unii Europejskiej VIROBATHE (umowa nr 513648), VIROCLIME (umowa nr 243923) oraz przez Katalońską Agencję Wodną Agència Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de Control i Millora dels Ecosistemes Aquàtics. W czasie realizacji badania Marta Rusiñol była stypendystką rządu Katalonii „AGAUR” (FI-DGR).

1. Zagęszczanie cząstek wirusowych obecnych w próbkach wody
<ol>
	<li>Pobieranie i przygotowanie próbek wody
		<ol>
		<li>Pobrać minimum 2 powtórzenia po 10 L na próbkę do plastikowych pojemników z płaskim dnem oraz jedną dodatkową próbkę jako kontrolę procesu. Ta ostatnia próbka zostanie wzbogacona znaną ilością cząstek wirusowych i posłuży jako kontrola. 
		Uwaga: Zaleca się stosowanie osobnych, dedykowanych materiałów (butelek, probówek itp.) do próbek wzbogaconych.</li>
		<li>Sprawdzić kalibrację konduktometru i w razie potrzeby przeprowadzić rekalibrację. Przygotować kontrolę negatywną, używając wody z kranu uprzednio dostosowanej do odpowiedniej przewodności (patrz poniżej punkt 1.6) w dodatkowym plastikowym pojemniku o pojemności 10 L.</li>
		<li>W przypadku próbek wzbogaconych: dodać do próbki standardową objętość wirusa kontrolnego (około 105 kopii genomu na 10 L wody). Wymieszać poprzez mieszanie, unikając rozpryskiwania i tworzenia aerozoli. Kontrole dodatnie mogą stanowić rzadki szczep adenowirusa, taki jak HAdV-35, lub bakteriofag, np. MS2.</li>
		<li>Jeśli próbka zawiera dużą ilość materiału zawieszonego (piasek lub inne materiały), pozostawić ją do osadzenia na 15 minut. Przenieść wodę do nowego pojemnika.</li>
		<li>Dostosować pH próbki wody do 3,5 (± 0,1) poprzez dodanie 1 N HCl. Krok ten jest istotny dla koncentracji wirusów, dlatego należy upewnić się, że pH zostało prawidłowo ustawione. Wodę mieszać dokładnie, energicznie mieszając podczas dodawania HCl. (Uwaga: jeśli pH jest niższe niż 3,5, dodać 1 M NaOH).</li>
		<li>Dostosować przewodność. Jeśli próbka ma przewodność 1500 μS/cm lub wyższą, ten krok nie jest wymagany. Jeśli przewodność jest niższa niż 1500 μS/cm, utworzenie materiału flokulowanego (kłaczków) nie jest gwarantowane, dlatego należy dostosować przewodność do 1500 μS/cm poprzez dodanie sztucznych soli morskich (Sigma). Mieszać energicznie podczas dodawania soli morskich.</li>
		<li>Zarejestrować pH próbek przed i po przygotowaniu, a także objętość zużytego HCl. Przewodność powinna zostać zarejestrowana po dostosowaniu pH. Elektrody pH-metru i konduktometru zawsze dezynfekować świeżym roztworem HCl, dechlorować roztworem 10% tiosiarczanu sodu, a na koniec przepłukać wodą destylowaną.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wstępnie flokulowanego 1% mleka odtłuszczonego (PSM)
		<ol>
			<li>Sprawdzić kalibrację pH-metru i konduktometru i w razie potrzeby przeprowadzić rekalibrację.</li>
			<li>Przygotować roztwór wstępnie flokulowanego mleka odtłuszczonego (1% PSM, m/v), rozpuszczając 10 g proszku mleka odtłuszczonego (Difco) w 1 L sztucznej wody morskiej (rozpuścić 33,3 g sztucznych soli morskich w 1 L dechlorowanej wody z kranu i autoklawować) i ostrożnie dostosować pH do 3,5 za pomocą 1N HCl. Kłaczki powinny być widoczne. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem lub przechowywać w temperaturze 4°C przez 24 h. Do dechlorowania użyć 1 ml 10% roztworu tiosiarczanu na 100 ml wody.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Flokulacja cząstek wirusowych obecnych w próbkach wody
		<ol>
		<li>Dodać 100 ml 1% PSM do 10-litrowej próbki wody.</li>
		<li>Mieszać próbki przez 8-10 h, aby umożliwić adsorpcję wirusów do kłaczków. Użyć programatora czasu, aby wyłączyć mieszanie po 8-10 h.</li>
		<li>Zatrzymać mieszanie i pozostawić kłaczki do osadzenia grawitacyjnego przez 8-10 h.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie i ponowne rozpuszczanie kłaczków. Centryfugacja
		<ol>
		<li>Usunąć nadosad za pomocą pompy perystaltycznej i plastikowej pipety połączonej z plastikową rurką. W przypadku próbek wzbogaconych nadosad należy zebrać do butelki i zdezynfekować zgodnie z procedurami wewnętrznymi. W każdym przypadku NALEŻY UWAŻAĆ, aby nie zebrać osadu.</li>
		<li>Zebrać osad z kłaczkami (około 500 ml) do butelki wirówkowej.</li>
		<li>Zrównoważyć masę probówek poprzez dodanie PSM o pH 3,5.</li>
		<li>Wirować probówki w wirówce wysokoprędkościowej przy 8,000 x g przez 30 min w temperaturze 4°C. Natychmiast po zatrzymaniu wirówki ostrożnie wyjąć probówki.</li>
		<li>Bardzo ostrożnie odlać i usunąć nadosad. Stosować odpowiednie środki ostrożności dla materiałów zakaźnych.</li>
		<li>Dodać 7 ml buforu fosforanowego, aby rozpuścić osad w każdej butelce wirówkowej.</li>
		<li>Po rozpuszczeniu kłaczków odmierzyć i dodać bufor fosforanowy do osiągnięcia całkowitej objętości 10 ml.</li>
		<li>Uhomogenizować koncentrat wirusowy za pomocą vortexa i rozdzielić 10 ml do czystych mikroprobówek, które należy zamrozić w temperaturze -80°C do czasu dalszych analiz.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja kwasów nukleinowych
<ol>
	<li>Przeprowadź ekstrakcję kwasów nukleinowych za pomocą zestawu QIAamp Viral RNA Mini Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Zestaw ten umożliwia wykorzystanie platformy zautomatyzowanej (takiej jak Qiacube, Qiagen).</li>
</ol>
3. Ilościowy PCR adenowirusów ludzkich (HAdV), poliomawirusów JC (JCPyV), adenowirusów świń (PAdV) i poliomawirusów bydła (BPyV)
<ol>
	<li>Ilościowe oznaczenie kopii genomu w próbkach
		<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę do qPCR w czystej, wydzielonej strefie, używając TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems). Reakcja odbywa się w optycznej płytce reakcyjnej z 96 dołkami, przykrytej optycznymi pokrywami samoprzylepnymi. Stężenia Master Mix, starterów i sond opisano w Tabeli 1.</li>
		<li>Po przygotowaniu mieszaniny, odmierzyć 15μl do każdego dołka, w tym do kontrolek (patrz 3.2). Całkowita objętość jednej reakcji po dodaniu celu wyniesie 25μl (15μl mieszaniny + 10μl próbki lub standardu).</li>
		<li>W wydzielonej strefie dodać ekstrakty kwasów nukleinowych z próbek (10μl). Każdą próbkę należy przeprowadzić w duplikacie: w formie bezpośredniej oraz jako rozcieńczenie dziesięciokrotne w wodzie oczyszczonej. Dołki zawierające próbki przykryć częścią pokrywy samoprzylepnej, a pozostałą część pokrywy zachować do następnego kroku.</li>
		<li>Dodać rozcieńczenia zawiesin standardu DNA (10μl) od 100 do 106 GC/10μl w tryplikacie, używając mikropipety przeznaczonej wyłącznie do standardowego DNA. Zaleca się dodawanie standardów w strefie wyposażonej w promieniowanie UV w celu niszczenia plazmidowego DNA oraz czyszczenie mikropipety po każdym użyciu. Dołki zawierające standardy przykryć wcześniej odciętą częścią pokrywy samoprzylepnej. 
		Uwaga: Aby przygotować zawiesiny standardowe do ilościowego oznaczenia kopii genomu, docelowy region DNA należy sklonować do plazmidu i zlinearyzować. Pod poniższym adresem znajduje się szczegółowa procedura tworzenia krzywych wzorcowych z matrycami plazmidowego DNA do zastosowania w qPCR: 
		<a href="http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf">http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf</a></li>
		<li>Przeprowadzić qPCR w odpowiednim systemie, wybierając właściwe parametry (uwzględniając zastosowanie pokrywy samoprzylepnej, całkowitą objętość w każdym dołku itp.). Po aktywacji AmpliTaq Gold przez 10 min w 95°C, przeprowadza się 40 cykli amplifikacji w następujący sposób: 15 s w 95°C i 1 min w 60°C dla HAdV, JCPyV i BPyV oraz 15 s w 95°C, 20s w 55°C i 20s w 60°C dla PAdV.</li>
		<li>Po zakończeniu reakcji zapisać dane i wyniki zgodnie z instrukcją obsługi użytego urządzenia. Ilość DNA zostanie określona jako mediana danych uzyskanych po skorygowaniu o czynnik rozcieńczenia, jeśli jest to wymagane.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Kontrolki
		<ol>
		<li>Stosować kontrolki pozytywne i negatywne. Analiza musi obejmować więcej niż jedną kontrolkę bez matrycy (NTC), aby udowodnić, że mieszanina nie generuje fluorescencji. Zaleca się przeprowadzenie pozytywnej kontrolki procesu w celu oceny potencjalnego hamowania enzymatycznego przez inhibitory obecne w badanych próbkach.</li>
		<li>Zarejestrować wyniki analiz qPCR dla dwóch różnych rozcieńczeń standardu DNA oraz z kontrolki procesu. Wykorzystać wyniki do przygotowania wykresów kontrolnych dla programów kontroli jakości (QC) związanych z czułością i wydajnością analiz.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Potwierdzenie wyników
		<ol>
		<li>Wyniki pozytywne można dodatkowo potwierdzić za pomocą nested-PCR i sekwencjonowania nukleotydowego amplikonów, co pozwala na uzyskanie dodatkowych danych o sekwencjach nukleotydowych wykrytych szczepów1,5,6,7,9,12.</li>
		</ol>
	</li>
</ol> 
Zgodnie z opisaną procedurą, wirusy ludzkie i zwierzęce zostały wykryte i ilościowo określone w wodach kąpieliskowych, wodzie morskiej oraz rzecznej2,3. Jako reprezentatywny przykład, w celu określenia źródeł zanieczyszczeń, oceniono próbki wód gruntowych z obszarów wykazujących wysokie stężenia azotanów. Dziesięciolitrowe próbki wody pobrano z 4 różnych studni na obszarach wiejskich w regionie północno-wschodniej Hiszpanii. Z każdej studni pobrano pięć powtórzeń, przy czym jedno powtórzenie zaszczepiono ludzkim adenowirusem 2 jako kontrolę procesu. Próbki przetworzono zgodnie z protokołem przedstawionym na Rysunku 1. Cztery powtórzenia przeanalizowane w jednym z czterech badanych miejsc wykazały wyniki dodatnie dla PAdV (średnia wartość 7,74x102 GC/L), co może być związane z obecnością gnojowicy wieprzowej na obszarach otaczających miejsce poboru próbek i potwierdzałoby fekalne zanieczyszczenie wieprzowe jako źródło azotanów w wodach gruntowych (Tabela 2).
4. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2820/2820fig1.jpg" alt="Schemat blokowy procesu analizy próbki wody; koncentracja wirusów, ekstrakcja kwasów nukleinowych, qPCR." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Procedura wykrywania i oznaczania ilościowego wirusów w wodzie.
<img src="/files/ftp_upload/2820/2820table1.jpg" alt="Tabela roztworów roboczych starterów z podaniem objętości i stężenia, wykorzystanych w analizie eksperymentu PCR." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Stężenia starterów i sond dla testów qPCR.
<img src="/files/ftp_upload/2820/2820table3.jpg" alt="Ilościowe oznaczanie wirusów za pomocą qPCR; tabela porównuje dane dotyczące wirusów ludzkich i zwierzęcych z parametrami fizykochemicznymi." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 3"> 
Tabela 2. Detekcja i ilościowe oznaczanie adenowirusów i poliomawirusów zwierzęcych i ludzkich w próbkach wód gruntowych. 
n liczba analizowanych powtórzeń 
% procent dodatnich powtórzeń 
(-) nie wykryto

<ol><li>Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+excreted+JC+virus+strains+and+their+potential+oral+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission.</a> J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).</li>
<li>Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li>
<li>Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel%2C+Mytilus+edulis%3A+the+first+Scandinavian+report%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).</li>
<li>Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+PCR+assay+for+the+quantitation+of+bovine+polyomavirus+as+a+microbial+source-tracking+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool.</a> J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).</li>
<li>Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+qPCR+assay+for+the+quantification+of+porcine+adenoviruses+as+an+MST+tool+for+swine+fecal+contamination+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment.</a> J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).</li>
<li>Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+and+animal+adenoviruses+and+polyomaviruses+for+determination+of+sources+of+fecal+contamination+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).</li>
<li>Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterococcus+species+distribution+among+human+and+animal+hosts+using+multiplex+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR.</a> J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).</li>
<li>de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bovine+and+porcine+adenoviruses+for+tracing+the+source+of+fecal+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).</li>
<li>Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+assays+for+the+detection+of+virus-specific+DNA+in+simples+with+mixed+populations+of+polyomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses.</a> J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).</li>
<li>Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+operational+utility+of+a+Bacteroidales+quantitative+PCR-based+MST+approach+in+determining+the+source+of+faecal+indicator+organisms+at+a+UK+bathing+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water.</a> Water Res. 43, 4888-4899 (2010).</li>
<li>Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+molecular+characterization+of+bovine+polyomavirus+in+bovine+sera+in+New+Zealand%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Z.+Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand.</a> N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).</li>
</ol>

W 2009 roku złożono dwa wnioski patentowe w celu ochrony własności intelektualnej protokołów kwantyfikacji PAdV i BPyV.

Opisana procedura spełnia warunki odpowiedniej metody dla rutynowych laboratoriów ochrony środowiska i zdrowia publicznego: jest powtarzalna, niezawodna, prosta i kostoeffektywna. Protokół jest prosty, jednak należy go ściśle przestrzegać. Niska przewodność w próbkach bez dodania wymaganej koncentracji soli sztucznej wody morskiej drastycznie obniżyłaby odzysk wirusów, podobnie jak miałoby to miejsce w przypadku znacznego skrócenia czasu mieszania podczas flokulacji (na przykład poniżej 5 godzin).
<p class="jove_cont...

<table><tbody><tr><td>Wirówka wysokoprędkościowa (8,000xg)</td><td>Berckman Coulter</td><td>Avanti J-20XP</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr, termometr i konduktometr</td><td>Afora</td><td>LPPC3003</td><td></td></tr><tr><td>Probówki plastikowe o długości 100-200 cm</td><td>Deltalab</td><td>350059</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne mierzone pipety jednorazowe</td><td>Labclinics</td><td>PN10E1</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki plastikowe o pojemności 1,5 i 10-15 mL (Eppendorf, Falcon i inne)</td><td>Afora</td><td>KA298/00</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia wirówkowe (500 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SE5753512</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadła magnetyczne i magnesy (jeden na próbkę)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10510</td><td></td></tr><tr><td>Szklane lub plastikowe pojemniki z płaskim dnem umożliwiające stosowanie mieszadeł magnetycznych</td><td>Deltalab</td><td>191642</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna do usuwania supernatantu (lub pompa próżniowa z wyporem wody)</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>323E/D</td><td></td></tr><tr><td>Timer do wyłączania mieszania po 8-10 godzinach</td><td>Deltalab</td><td>900400</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (1N i 0,1N)</td><td>Panreac</td><td>141020.1611</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (1N)</td><td>Panreac</td><td>131687.1211</td><td></td></tr><tr><td>Sole do sztucznej wody morskiej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9883</td><td></td></tr><tr><td>Mleko odtłuszczone (SM)</td><td>Difco Laboratories</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy pH 7,5</td><td></td><td></td><td>1:2 v/v sterylnego Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 0,2M i NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 0,2M przy pH 7,5</td></tr><tr><td>Tiosiarczan</td><td>Panreac</td><td>121879.1209</td><td>Przygotować 10% roztwór w wodzie</td></tr><tr><td>Zestaw QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td></td></tr><tr><td>Optyczna płytka reakcyjna 96-dołkowa (500 sztuk)</td><td>Applied Biosystems</td><td>43426659</td><td></td></tr><tr><td>Optyczne pokrywy samoprzylepne (100 sztuk)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x</td><td>Applied Biosystems</td><td>4396838</td><td></td></tr></tbody></table>

kosztowo efektywna metoda śledzenia źródeł mikrobów z wykorzystaniem specyficznych wirusów ludzkich i zwierzęcych

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Zanieczyszczenie środowiska drobnoustrojami stanowi istotne ryzyko dla zdrowia. Klasyczne bakteryjne wskaźniki fekalne wykazują znaczące ograniczenia, wirusy są bardziej odporne na wiele procesów inaktywacji, a standardowe wskaźniki fekalne nie dostarczają informacji o źródle zanieczyszczenia. Opracowanie kosztowo efektywnych metod koncentracji wirusów z wody oraz testów molekularnych ułatwia zastosowanie wirusów jako wskaźników zanieczyszczenia fekalnego oraz jako narzędzi do śledzenia mikrobiologicznego źródła zanieczyszczeń (MST). Adenowirusy i polyomawirusy to wirusy DNA zakażające konkretne gatunki kręgowców, w tym ludzi, i są one stale wydalane z kałem i/lub moczem we wszystkich badanych obszarach geograficznych. W poprzednich badaniach zasugerowaliśmy ilościowe oznaczenie ludzkich adenowirusów (HAdV) i polyomawirusów JC (JCPyV) za pomocą ilościowej PCR (qPCR) jako wskaźnika ludzkiego zanieczyszczenia fekalnego. Opracowaliśmy niedawno testy qPCR do specyficznego ilościowego oznaczania adenowirusów świńskich (PAdV) i polyomawirusów bydlęcych (BPyV) jako zwierzęcych markerów zanieczyszczenia fekalnego, o czułości wynoszącej 1-10 kopii genomu na probówkę. W niniejszym badaniu przedstawiamy procedurę identyfikacji źródła zanieczyszczenia w próbkach wody przy użyciu tych narzędzi. Jako przykład reprezentatywnych wyników przedstawiono analizę wirusów w wodach gruntowych wykazujących wysokie poziomy azotanów.
Wykrywanie wirusów w wodach o niskim lub umiarkowanym stopniu zanieczyszczenia wymaga skoncentrowania wirusów z co najmniej kilku litrów wody do znacznie mniejszej objętości, co zazwyczaj obejmuje dwa następujące po sobie etapy koncentracji. Ta dość uciążliwa procedura oraz obserwowana zmienność w odzysku wirusów znacząco utrudniają jednoczesne przetwarzanie dużej liczby próbek wody.
Aby wyeliminować wąskie gardło spowodowane procedurami dwuetapowymi, zastosowaliśmy jednowariantowy protokół opracowany w poprzednich badaniach, który można stosować do różnych matryc wodnych. Procedura obejmuje: zakwaszenie dziesięciolitrowych próbek wody, flokulację za pomocą odtłuszczonego mleka, sedymentację grawitacyjną materiałów sflokulowanych, zebranie osadu i wirowanie oraz resuspensję osadu w 10 ml buforu fosforanowego. Koncentrat wirusowy jest wykorzystywany do ekstrakcji wirusowych kwasów nukleinowych, a specyficzne adenowirusy i poliomawirusy są ilościowo oznaczane metodą qPCR. Dzięki tej niskokosztowej metodzie koncentracji można jednocześnie analizować dużą liczbę próbek.
Procedura ta była stosowana do analizy wód kąpieliskowych, wody morskiej i rzecznej, a w niniejszym badaniu przedstawiamy wyniki analizy próbek wód podziemnych. Ta wysokoprzepustowa metoda ilościowa jest niezawodna, prosta i kosztowo efektywna.

Badanie opisuje kosztowo efektywną metodę identyfikacji źródła zanieczyszczenia kałowego/moczowego lub zanieczyszczenia azotanami w wodzie z wykorzystaniem qPCR do specyficznej kwantyfikacji ludzkich/świńskich/bydlęcych wirusów DNA, adenowirusów i poliomawirusów, proponowanych jako narzędzia MST.

Kosztowo efektywna metoda śledzenia źródeł mikrobów z wykorzystaniem specyficznych wirusów ludzkich i zwierzęcych

Zanieczyszczenie środowiska mikroorganizmami stanowi istotne ryzyko dla zdrowia. Wykazano, że klasyczne bakteryjne wskaźniki fekalne charakteryzują się znaczącym...

Kosztowo efektywna metoda śledzenia źródeł mikrobiologicznych z wykorzystaniem specyficznych wirusów ludzkich i zwierzęcych. Badanie opisuje kosztowo efektywną metodę identyfikacji źródła zanieczyszczenia kałowo-moczowego lub zanieczyszczenia azotanami w wodzie, wykorzystującą ilościowy PCR do specyficznego oznaczania wirusów DNA ludzi, świń i bydła, w tym adenowirusów i poliomawirusów, zaproponowanych jako narzędzia do śledzenia źródeł mikrobiologicznych. Opracowaliśmy protokół koncentracji wirusów z 10 litrowych próbek wody poprzez flokulację organiczną, ekstrakcję kwasów nukleinowych wirusów z osadu przy użyciu odtłuszczonego mleka oraz oznaczanie wirusów DNA ludzi, bydła lub świń za pomocą ilościowego PCR.Powszechnie wiadomo, że zanieczyszczenie witaminy drobnoustrojami stanowi istotne ryzyko dla zdrowia, dlatego konieczne jest określenie źródeł tego zanieczyszczenia. Zaproponowaliśmy wykorzystanie powszechnie występujących wirusów DNA jako narzędzi do śledzenia źródeł mikrobiologicznych. Wybranymi wirusami są adenowirusy i polyomawirusy.Wirusy te są wydalane w sposób ciągły przez cały rok i we wszystkich obszarach geograficznych, co zostało wykazane w poprzednich badaniach. Opracowaliśmy wydajne i niskokosztowe metody zagęszczania wirusów w wodzie oraz pracujemy nad opracowaniem testów qPCR do ilościowego oznaczania adenowirusów świń i polyomawirusów bydlęcych.Dodatkowo, w celu wykrycia zanieczyszczenia wody materiałem pochodzenia ludzkiego, stosujemy markery w postaci ludzkich adenowirusów oraz poliomawirusów NGC, których obecność badamy za pomocą qPCR. Pobieranie próbek wody. W niniejszym badaniu z każdej próbki wody pobiera się cztery powtórzenia po 10 litrów do plastikowych pojemników z płaskim dnem oraz jedną dodatkową próbkę jako kontrolę procesu. Ta ostatnia próbka zostanie zaszczepiona znaną ilością cząsteczek wirusowych służących jako kontrola.W laboratorium przygotowuje się kontrolę negatywną, wykorzystując wodę z kranu spełniającą wymogi jakościowe w dodatkowym plastikowym pojemniku o pojemności 10 litrów. Jeśli próbka zawiera dużą ilość zawiesiny, piasku i innych zanieczyszczeń, należy odczekać 15 minut do ich osadzenia, a następnie przelać wodę do nowego pojemnika. Koncentracja wirusów poprzez flokulację organiczną.Wykrywanie wirusów w próbkach wody o niskim lub umiarkowanym stopniu zanieczyszczenia wymaga skoncentrowania wirusów z co najmniej kilku litrów wody do znacznie mniejszej objętości. Procedura koncentracji obejmuje zakwaszenie 10 litrowych próbek wody, flokulację przy użyciu odtłuszczonego mleka, sedymentację kłaczków grawitacyjną oraz zebranie osadu w 10 mililitrach buforu fosforanowego. Aby rozpocząć ten proces, przygotowuje się roztwór odtłuszczonego mleka w sztucznej wodzie morskiej, rozpuszczając 10 gramów proszku mleka odtłuszczonego w jednym litrze sztucznej wody morskiej i ostrożnie dostosowując pH do 3,5 za pomocą kwasu solnego; kłaczki powinny być widoczne.Przygotować roztwór bezpośrednio przed użyciem lub przechowywać w temperaturze 4°C przez 24 godziny. Próbki wody należy wymieszać, a następnie zmierzyć ich przewodność. Jeśli wartość ta będzie niższa niż 1,5 mS, należy dodać sole morskie.Dostosuj pH próbki wody do wartości 3,5 poprzez dodanie kwasu solnego. Zapisz pH próbek przed i po kondycjonowaniu, a także objętość zużytego kwasu solnego. Należy również zapisać wartość przewodności.Po skorygowaniu pH dodajemy 100 mililitrów odtłuszczonego mleka w proszku (stężenie 1%) do 10 litrowej próbki wody i mieszamy próbki przez 8 do 10 godzin, aby wirusy mogły zaabsorbować się do kłaczków. W przypadku próbki wzbogaconej, służącej jako kontrola procesu, do próbki dodaje się standardową objętość wirusa kontrolnego, na przykład jeden mililitr. Należy zaprzestać mieszania i pozwolić kłaczkom osadzić się grawitacyjnie przez 8 do 10 godzin.Po 16 godzinach, zazwyczaj następnego dnia, będziemy mogli zebrać osad. W tym celu należy usunąć nadsącz za pomocą pompy perystaltycznej. Zebrać osad wraz z kłaczkami, około 500 mililitrów, do butelki do wirowania.Wyrównać objętość w naczyniach poprzez dodanie odtłuszczonego mleka w proszku pH 3.5, a następnie odwirować naczynia w wirówcetce wysokoprędkościowej przy 8 000 Gs przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Natychmiast po zatrzymaniu wirówki ostrożnie wyjąć naczynia. Bardzo delikatnie odlać i usunąć nadsącz.Rozpuścić pellet w każdej probówce dośrodkowej do uzyskania końcowej objętości 10 ml fosforanu, przeprowadzając ekstrakcję i kwantyfikację kwasów nukleinowych wirusów. Koncentrat wirusowy służy do ekstrakcji wirusowych kwasów nukleinowych, a specyficzne, interesujące nas adenowirusy i wirusy polyoma zostaną poddane kwantyfikacji za pomocą A-Q-P-C-R. Przeprowadzić ekstrakcję kwasów nukleinowych przy użyciu zestawu key amp viral RNA mini kit.Lizę wirusów obecnych w 140 µL koncentratów wirusowych przeprowadza się ręcznie, a całkowite kwasy nukleinowe ekstrahuje się do 80 µL. Zestaw ten umożliwia wykorzystanie platformy zautomatyzowanej, takiej jak Key cube.Kolejnym krokiem jest ilościowe oznaczenie genomu wirusa. Liczbę kopii w próbkach można wyznaczyć za pomocą ilościowego PCR z zastosowaniem sond TaqMan; ludzkie adenowirusy, wirusy JC Polyoma oraz bydlęce wirusy polyoma mogą być analizowane na tej samej płytce 96-dołkowej. Ponieważ wszystkie te analizy wykorzystują te same cykle amplifikacji, adenowirusy świń należy badać oddzielnie, na niezależnej płytce, w celu ilościowego oznaczenia docelowego wirusa.Przygotuj mieszaninę do ilościowej PCR w czystym, oddzielnym obszarze. Po przygotowaniu mieszaniny, nanieś 15 µL do każdej studzienki, w tym do kontroli. W oddzielnym obszarze dodaj po 10 µL ekstraktów kwasów nukleowych z próbek; każdą próbkę należy przeprowadzić bezpośrednio oraz w dziesięciokrotnym rozcieńczeniu w wodzie oczyszczonej w dwóch powtórzeniach. Całkowita objętość jednej reakcji po dodaniu celu wyniesie 25 µL (15 µL mieszaniny oraz 10 µL próbki lub standardu). Przykryj studzienki zawierające próbki fragmentem pokrywy adhezyjnej.Zachowaj pozostałą część pokrywki do następnego kroku. Rozcieńczanie standardów DNA. 10 µL roztworów standardowych DNA w stężeniach od 10⁰ do 10⁶ kopii genomu, dodając po 10 µL w trzech powtórzeniach, używając mikropipety przeznaczonej wyłącznie do standardów DNA.Studzienki zawierające standardy z wcześniej wyciętą przylepną pokrywką. Rysunek ten przedstawia rozmieszczenie próbek zawiesiny standardów oraz kontroli w płytce 96-dołkowej.Przeprowadź reakcję QPCR w odpowiednim systemie, wybierając właściwe parametry po aktywacji amplitude gold przez 10 minut. W temperaturze 95 °C wykonuje się 40 cykli amplifikacji po zakończeniu reakcji. Przechowuj dane i wyniki zgodnie z opisem w instrukcji obsługi użytego urządzenia.Ilość DNA zostanie określona jako mediana danych uzyskanych po skorygowaniu współczynnika rozcieńczenia, jeśli będzie to konieczne. Wykres amplifikacji oraz krzywa standardowa uzyskane podczas ilościowego oznaczania adenowirusów świń wykazały współczynnik korelacji wynoszący 0,999. Dopuszczalne wartości nachylenia w ramach procedury mieszczą się w zakresie od -3,1 do -3,6.Przebadano opisane wirusy ludzkie i zwierzęce w próbkach wód gruntowych z obszaru charakteryzującego się wysokim poziomem azotanów, aby określić źródła zanieczyszczeń. W czterech analizowanych powtórzeniach uzyskano wyniki dodatnie dla adenowirusów świńskich, ze średnią wartością 7,74 na 10⁻² kopii genomu na litr, co może wiązać się z obecnością gnojowicy świńskiej w obszarze wokół miejsca poboru prób i dowodzi obecności fekalnego zanieczyszczenia wód gruntowych pochodzenia świńskiego. W żadnej z badanych próbek nie stwierdzono zanieczyszczenia ludzkiego.Dane wirologiczne zostały potwierdzone za pomocą zagnieżdżonej reakcji PCR oraz analizy sekwencjonowania.Wnioski. W niniejszym badaniu przedstawiliśmy wyniki analizy próbek wód podziemnych, wykazując zanieczyszczenie pochodzenia świńskiego przy braku zanieczyszczeń ludzkich lub bydlęcych. Procedura została również zastosowana do analizy wód kąpieliskowych, wody morskiej oraz rzecznej.Przedstawiamy tutaj procedurę stosowania tych narzędzi do identyfikacji źródła zanieczyszczenia w wodach gruntowych, prezentując wysokie poziomy azotanów jako przykład możliwości zastosowania opracowanych metod do wykrywania źródła zanieczyszczenia w środowisku.

cost-effective-method-for-microbial-source-tracking-using-specific

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Tanie i skuteczne metody śledzenia źródeł mikroorganizmów z wykorzystaniem specyficznych ludzkich i zwierzęcych wirusów

Virochip to panwirulowa macierz mikroukładów zaprojektowana do jednoczesnego wykrywania wszystkich znanych wirusów, a także nowych wirusów, w oparciu o konserwatywną homologię sekwencji. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przeprowadzić badanie z użyciem Virochip w celu analizy próbek klinicznych pod kątem obecności wirusów znanych i nieznanych.

Wykorzystanie panwirusej macierzy mikroarray (Virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych w kierunku patogenów wirusowych

Niniejsze badanie opisuje diagnostykę grypy ptaków u dzikiego ptactwa z wykorzystaniem przenośnego systemu rRT-PCR. Metoda ta wykorzystuje liofilizowane odczynniki do badania dzikich ptaków w warunkach poza laboratoryjnymi, typowych dla scenariusza ogniska choroby. Zastosowanie narzędzi molekularnych zapewnia dokładne i czułe alternatywy dla szybkiej diagnostyki.

Szybka diagnostyka wirusa grypy ptaków u dzikich ptaków: wykorzystanie przenośnego urządzenia rRT-PCR i liofilizowanych odczynników w warunkach terenowych

Zwalidowano i rozszerzono metodę konserwacji, detekcji i sekwencjonowania RNA wirusów grypy ptasiej, wykorzystując naturalne próbki odchodów ptaków. Technika ta eliminuje konieczność zachowania łańcucha chłodniczego oraz obchodzenia się z zakaźnymi wirusami i może być zastosowana w wysokoprzepustowym układzie 96-dołkowym.

Nadzór nad grypą ptaków z wykorzystaniem kart FTA: rozwiązanie problemów związanych z metodami terenowymi, bezpieczeństwem biologicznym i transportem

Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Wysokoprzepustowe testowanie patogenów opartych na DNA i RNA za pomocą nanoskalowego PCR jest opisane za pomocą syndromicznego panelu PCR na psach i koniach.

Wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale PCR

Pokazano metodę opartą na żywicy anionowymiennej, dostosowaną do pobierania próbek wirusów z bioaerozolu na bazie płynnych uderzeń. W połączeniu z detekcją molekularną, metoda ta pozwala na łatwe i czułe wykrywanie wirusów w bioaerozolach.

Wykrywanie wirusów w bioaerozolach za pomocą żywicy anionowymiennej

Tutaj prezentujemy VirWaTest, który jest prostą, niedrogą i przenośną metodą koncentracji i wykrywania wirusów z próbek wody w miejscu użycia.

VirWaTest, metoda punktowa do wykrywania wirusów w próbkach wody

Liczne nowe sekwencje wirusopodobne zostały znalezione u komarów dzięki szerokiemu zastosowaniu technologii sekwencjonowania. Zapewniamy skuteczną procedurę izolacji i amplifikacji wirusów przy użyciu linii komórkowych kręgowców i komarów, która może posłużyć jako podstawa do przyszłych badań nad wirusami związanymi z komarami, w tym wirusami przenoszonymi przez komary i specyficznymi dla komarów.

Izolacja wirusa związanego z komarami od komarów zebranych na polu

Prezentujemy protokół, który łączy amplifikację polimerazy rekombinazy z systemem CRISPR/Cas12a do wykrywania śladów wirusów DNA i tworzy przenośną mikroskopię smartfonów z klasyfikacją wspomaganą sztuczną inteligencją do wykrywania wirusów DNA w miejscu opieki nad pacjentem.

System detekcji wirusów DNA oparty na RPA-CRISPR/Cas12a-SPM i głębokim uczeniu

Tutaj prezentujemy szybki i ekonomiczny proces charakteryzowania genomów wirusa wścieklizny (RABV) za pomocą technologii nanoporowej. Przepływ pracy ma na celu wsparcie nadzoru opartego na genomice na poziomie lokalnym, dostarczając informacji na temat krążących linii RABV i ich umiejscowienia w regionalnych filogenezach w celu ukierunkowania środków kontroli wścieklizny.

Sekwencjonowanie całego genomu w celu szybkiej charakterystyki wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Poznaj ekonomiczną metodę śledzenia źródeł mikrobiologicznych w wodzie przy użyciu wirusów adenowirusów i poliomawirusów. Technika ta wykorzystuje ilościowe PCR do identyfikacji zanieczyszczeń kałowych pochodzenia ludzkiego i zwierzęcego.

Kosztowo efektywna metoda śledzenia źródeł mikrobów z wykorzystaniem specyficznych wirusów ludzkich i zwierzęcych

Przeglądaj więcej filmów