Ekonomiczna metoda śledzenia źródeł mikrobiologicznych przy użyciu określonych wirusów ludzkich i zwierzęcych

Opłacalna metoda śledzenia źródeł drobnoustrojów przy użyciu określonych wirusów ludzkich i zwierzęcych. W badaniu opisano opłacalną metodę identyfikacji źródła zanieczyszczenia kałem moczu lub zanieczyszczenia azotanami w wodzie przy użyciu ilościowej reakcji PCR w celu specyficznego oznaczania ilościowego wirusów trzody chlewnej, bydła, DNA, adenowirusów i poliomawirusów zaproponowanych jako narzędzia śledzenia źródeł drobnoustrojów. Opracowaliśmy protokół koncentracji wirusów z 10 litrowych próbek wody metodą flokulacji organicznej z wykorzystaniem ekstrakcji wirusowych kwasów nukleinowych z odtłuszczonego mleka z osadu oraz oznaczania ilościowego wirusów DNI bydła lub świń za pomocą ilościowego PCR.

Powszechnie wiadomo, że zanieczyszczenie mikrobiologiczne witaminą stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia i musimy znać źródła tego zanieczyszczenia. Zaproponowaliśmy wykorzystanie wysoce rozpowszechnionych wirusów DNA jako narzędzi do śledzenia źródeł drobnoustrojów. Wybrane wirusy to adenowirusy i poliomawirusy.

Wirusy te są wydalane w sposób ciągły przez cały rok i we wszystkich obszarach geograficznych. Badane w poprzednich badaniach. Opracowaliśmy solidne, tanie metody koncentracji wirusów w wodzie i pracowaliśmy nad opracowaniem testów QPCR do ilościowego oznaczania adenowirusów purynowych i poliomawirusów bydlęcych.

Ponadto używamy ludzkich adenowirusów, poliomawirusów NGC, testowanych metodą QPCR, również jako markerów zanieczyszczenia człowieka w wodzie, Pobieranie próbek wody. W tym badaniu cztery powtórzenia po 10 litrów na próbkę wody są zbierane w plastikowych pojemnikach z płaskim dnem i jedną dodatkową próbkę jako kontrolę procesu. Ta ostatnia próbka zostanie wysiana znaną ilością cząstek wirusa użytych jako kontrola.

Kontrolę ujemną przygotowuje się w laboratorium przy użyciu wody z kranu w jednym dodatkowym plastikowym pojemniku o pojemności 10 litrów. Jeśli próbka zawiera dużą ilość zawieszonego materiału, piasku i innych materiałów, pozwól jej osiadać przez 15 minut, przenieś wodę do nowego pojemnika. Koncentracja wirusa przez flokulację organiczną.

Wykrycie wirusów w próbkach wody o niskim lub umiarkowanym zanieczyszczeniu wymaga zagęszczenia wirusów z co najmniej kilku litrów wody w znacznie mniejszej objętości. Procedura zatężania obejmuje zakwaszenie 10 litrowych próbek wody, flokulację za pomocą grawitacji mleka odtłuszczonego, sedymentację stad i zebranie osadu w 10 mililitrach buforu fosforanowego w celu rozpoczęcia procesu, roztwór lokalizacji mleka odtłuszczonego w sztucznej wodzie morskiej przygotowuje się poprzez rozpuszczenie 10 gramów odtłuszczonego mleka w proszku w jednym litrze sztucznej wody morskiej i ostrożne dostosowanie pH do 3,5. W przypadku kwasu solnego stado powinno być widoczne.

Przygotuj roztwór tuż przed użyciem lub przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny. Próbki wody miesza się i mierzy przewodność w próbkach. Jeśli jest poniżej 1,5 milisiemensa, zostaną dodane sole morskie.

Doprowadzić pH próbki wody do 3,5 przez dodanie kwasu solnego. Zapisać pH próbek przed i po kondycjonowaniu, a także objętość użytego kwasu solnego. Należy również rejestrować przewodność.

Po dostosowaniu pH dodajemy 100 mililitrów odtłuszczonego mleka pref flod, 1% do 10-litrowej próbki wody i mieszamy próbki przez osiem do 10 godzin, aby wirusy mogły wchłonąć się do stad. W przypadku próbki kolca używanej do kontroli procesu należy dodać standardową objętość wirusa kontrolnego, na przykład jeden mililitr, na przykład do próbki. Przerwij mieszanie i pozwól kłaczku osiadać grawitacyjnie przez osiem do 10 godzin.

Po 16 godzinach, zwykle następnego dnia, będziemy mogli zebrać osady. W tym celu należy usunąć supernatant za pomocą pompy perystaltycznej. Zbierz osad ze stadami, około 500 mililitrów do butelki wirówkowej.

Zrównoważyć garnki przez dodanie odtłuszczonego mleka o pH 3,5, odwirować garnki za pomocą wirówki o wysokiej prędkości, 8 000 G 30 minut w czterech stopniach Celsjusza. Gdy tylko wirówka się zatrzyma, ostrożnie wyjmij garnki wirówkowe z wirówki. Bardzo delikatnie odlewać i wyrzucać supernatant.

Rozpuścić osad w każdej butelce wirówkowej do końcowej objętości 10 mililitrów fosforanu, ekstrakcja kwasów nukleinowych i oznaczanie ilościowe wirusów. Koncentrat wirusowy służy do ekstrakcji wirusowych kwasów nukleinowych oraz specyficznych adenowirusów i polioma Wirusy będące przedmiotem zainteresowania zostaną określone ilościowo za pomocą A-Q-P-C-R. Wykonaj ekstrakcję kwasów nukleinowych za pomocą mini zestawu Key Amp viral RNA.

Liza wirusów obecnych w 140. Mikrolitry koncentratów wirusowych wykonuje się ręcznie, a całkowite kwasy nukleinowe ekstrahuje się do 80 mikrolitrów. Zestaw ten umożliwia korzystanie z zautomatyzowanej platformy, takiej jak Key cube.

Kolejnym krokiem jest kwantyfikacja genomu wirusa. Kopie w próbkach przy użyciu ilościowej reakcji PCR z sondami tac man, adenowirusy ludzkie, wirusy JC Polyoma i wirusy polioma bydła mogą być oznaczane ilościowo na tej samej płytce 96-dołkowej. Ponieważ wszystkie wykorzystują te same cykle amplifikacji, adenowirusy świń powinny być badane oddzielnie na niezależnej płytce w celu określenia ilościowego docelowego wirusa.

Przygotować ilościową mieszaninę PCR w czystym, oddzielnym obszarze. Po przygotowaniu mieszanki przydziel 15 mikrolitrów do każdej studzienki, łącznie z kontrolami. Dodać ekstrakcje kwasów nukleinowych z próbek 10 mikrolitrów w oddzielnym obszarze, uruchomić bezpośrednio i dziesięciokrotnie rozcieńczyć w oczyszczonej wodzie każdą próbkę dwukrotnie, całkowita objętość dla jednej reakcji po dodaniu celu wyniesie 25 mikrolitrów, 15 mieszaniny plus 10 próbki lub wzorca przykryj studzienki zawierające próbki częścią osłony samoprzylepnej.

Zachowaj drugą część pokrywy do następnego kroku. Rozcieńczenie AB wzorcowych zawiesin DNA. 10 mikrolitrów od 10 do zera do 10 do sześciu kopii genomu, udawaj mikrolitry trzykrotnie i przy użyciu mikro pbit używanego wyłącznie do standardowej okładki DNA.

Studzienki zawierające wzorce z uprzednio wyciętą osłoną samoprzylepną. Rysunek ten przedstawia rozkład standardowych próbek zawiesiny i prób kontrolnych. W płytce 96-dołkowej.

Wykonać QPCR w odpowiednim systemie, dobierając odpowiednie parametry po aktywacji złota amplitudy na 10 minut. W temperaturze 95 stopni Celsjusza po zakończeniu reakcji wykonuje się 40 cykli amplifikacji. Przechowuj dane i wyniki zgodnie z opisem w instrukcji obsługi używanego sprzętu.

Ilość DNA zostanie zdefiniowana jako mediana danych uzyskanych po skorygowaniu współczynnika rozcieńczenia, gdy zajdzie taka potrzeba. Wykres amplifikacji i krzywa standardowa uzyskane do oznaczania ilościowego adenowirusów świń wykazały współczynnik korelacji wynoszący 0,999. Dopuszczalne wartości nachylenia wahają się od minus 3,1 do minus 3,6 zgodnie z procedurą.

Opisane wirusy ludzkie i zwierzęce zostały przebadane w próbkach wód gruntowych z obszaru o wysokim poziomie azotanów w celu określenia źródeł skażenia. Cztery analizowane powtórzenia wykazały pozytywne wyniki dla średniej wartości adenowirusów świń, 7,74 na 10 do dwóch kopii genomu na litr, co byłoby związane z obecnością gnojowicy świńskiej w obszarze otaczającym miejsce pobierania próbek i udowodniłoby obecność zanieczyszczenia kałem świń w wodach gruntowych. W żadnej z badanych próbek nie stwierdzono skażenia ludźmi.

Dane wirusologiczne potwierdzono za pomocą zagnieżdżonej reakcji PCR i analizy sekwencjonowania. Konkluzja. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki analizy próbek wód gruntowych, przedstawiające zanieczyszczenie pochodzenia wieprzowego przy braku zanieczyszczenia ludzkiego lub bydlęcego. Procedura ta została również zastosowana do analizy wód kąpielowych, wody morskiej i wody rzecznej.

Przedstawiamy w tym miejscu procedurę zastosowania tych narzędzi do identyfikacji źródła zanieczyszczeń w wodach podziemnych, przedstawiając wysokie poziomy azotanów jako przykład możliwości zastosowania opracowanych metod wykrywania źródła skażenia w środowisku.