Wykorzystanie panwirusej macierzy mikroarray (Virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych w kierunku patogenów wirusowych

Niniejsza procedura wykorzystuje chip Viro, czyli panwirusekny test mikromacierzy do analizy próbek klinicznych w celu wykrycia znanych i nieznanych wirusów. W pierwszej kolejności z próbek klinicznych ekstrahuje się kwasy nukleinowe. Następnie wyekstrahowane RNA poddaje się odwrotnej transkrypcji z użyciem starterów losowych.

Przeprowadzana jest synteza drugiej nici cDNA, a następnie biblioteka cDNA jest amplifikowana za pomocą randomowego PCR. Następnie amplifikowane cDNA jest znakowane barwnikami fluorescencyjnymi i hybrydyzowane z mikrotablicą wirusową. Ostatnim krokiem jest skanowanie i analiza mikrotablicy.

Ostatecznie, dzięki analizie mikrochipu można uzyskać wyniki wskazujące na obecność lub brak jednego lub kilku wirusów. Metody detekcji o szerokim spektrum, takie jak mikrochipy wirusowe, są niezbędne w mikrobiologii diagnostycznej, ponieważ powszechne zespoły kliniczne, takie jak zapalenie płuc, nie są specyficzne dla żadnego pojedynczego patogenu, a ponadto nieustannie pojawia się zagrożenie nowymi patogenami wirusowymi, takimi jak koronawirus SARS czy nowy wirus grypy H1N1 z 2009 roku. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii diagnostycznej, na przykład jaki odsetek niezdiagnowanych infekcji w warunkach klinicznych może być wywoływany przez nieznane dotąd nowe wirusy. Zastosowanie tej techniki prowadzi do lepszej diagnostyki ostrych schorzeń klinicznych w szpitalach, ponieważ umożliwia jednoczesne badanie setek lub tysięcy potencjalnych patogenów.

Pomysł na tę metodę pojawił się u nas w 2002 roku, kiedy zdecydowaliśmy się zastosować nowo opracowaną technologię mikromacierzy, zapoczątkowaną w laboratorium dr. Josepha DeRisi na UCSF, do detekcji wirusów. Naszym pierwszym rzeczywistym przypadkiem testowym było wykorzystanie chipa wirusowego do identyfikacji nowego koronawirusa odpowiedzialnego za SARS w 2003 roku. Całą procedurę od początku do końca zaprezentuje technik z mojego laboratorium, który zademonstruje zastosowanie testu z użyciem chipa wirusowego na próbce wymazu z nosa pobranej od dziecka w celu zdiagnozowania przyczyny ostrej choroby dróg oddechowych. Próbki wymazów z nosogardzieli zbierane są w sterylnych pojemnikach zawierających płynne medium transportowe dla wirusów i przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C.

W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy odmrozić probówkę zawierającą próbkę, a następnie krótko zamieszać wymaz w medium przed wyrzuceniem go do pojemnika na odpady biologiczne. Następnie należy odpipetować 200 µL próbki do probówki o pojemności 1,5 mL. Próbkę należy przepuścić przez filtr wirówkowy o porach 0,22 µm w celu oczyszczenia cząsteczek wirusowych i zebrać ją do nowej probówki o pojemności 1,5 mL.

Następnie, zgodnie z instrukcjami producenta, należy użyć zestawu Turbo DNA od Ambien w celu degradacji genomowego DNA gospodarza i oczyszczenia chronionego, enkapsydowanego kwasu nukleinowego wirusa. Kolejnym krokiem jest ekstrakcja RNA przy użyciu zestawu do ekstrakcji viralnego RNA XMO ZR lub zestawu do wirusów Qiagen ultrasound, zgodnie z instrukcjami producenta. Stężenie wyekstrahowanego RNA należy zmierzyć za pomocą spektrofotometru kwasów nukleinowych NanoDrop.

Zalecane stężenie RNA wynosi co najmniej 10 ng/µL, jednak może ono różnić się w zależności od próbki przy użyciu cienkościennej probówki o pojemności 200 µL. Do 4 µL wyekstrahowanego RNA należy dodać 1 µL startera A o stężeniu 40 pmol/µL. Próbkę należy podgrzać do 65 °C przez pięć minut w termocyklerze, a następnie pozostawić probówkę do ochłodzenia do temperatury pokojowej przez pięć minut.

Następnie do termocyklera dodaje się 5 µL master mixu zawierającego 2 µL 5× buforu RT, 1 µL 12,5 mM dNTP, 1 µL wody, 0,5 µL 0,1 M DTT oraz 0,5 µL odwrotnej transkryptazy. Probówkę inkubuje się w temperaturze 42 °C przez 60 minut. Następnie próbkę podgrzewa się do 94 °C przez 2 minuty.

Aby przerwać reakcję odwrotnej transkrypcji, należy schłodzić próbki do 10 °C przez dwie minuty i krótko odwirować w wirówce pulsacyjnej przez pięć sekund. Następnie dodać 5 µL mieszaniny quease, składającej się z 1 µL buforu quease 5×, 3,8 µL wody oraz 0,15 µL enzymu quease do syntezy drugiej nici. W termocyklerze należy zwiększyć temperaturę z 10 °C do 37 °C w ciągu ośmiu minut.

Inkubować w temperaturze 37 °C przez osiem minut. Następnie podgrzać do 94 °C przez dwie minuty, aby inaktywować nukleazę, a następnie schłodzić do 10 °C. W razie potrzeby próbkę zawierającą 15 µL cDNA przechowywać w temperaturze -20 °C.

Najpierw dodaj 5 µL próbki CD NA do 45 µL master mixu składającego się z 5 µL 10x buforu do PCR, 1 µL 12,5 mM dNTP, 1 µL 100 pmol/µL startera B, 1 µL cleantech LA oraz 37 µL wody. Następnie przeprowadź protokół PCR w następujący sposób: 94 °C przez 2 minuty, a następnie 25 cykli obejmujących 94 °C przez 30 sekund, 50 °C przez 45 sekund i 72 °C przez 1 minutę.

Następnie przeprowadza się etap wyżarzania w temperaturze 72 stopni Celsjusza przez pięć minut, po czym po zakończeniu PCR próbkę utrzymuje się w temperaturze 10 stopni Celsjusza. Produkt PCR należy sprawdzić za pomocą elektroforezy w 1,5% żelu agarozowym. Powinien być widoczny rozmaz od około 200 do 1000 par zasad.

Aby wprowadzić AAD DNTP, należy dodać 5 µL produktu PCR wirusa do 45 µL master mixu składającego się z 5 µL 10x buforu PCR, 1 µL 12,5 mM A-A-D-N-T-P, 1 µL 100 p z kilku mikrolitrów startera B, 1 µL ClinTech LA oraz 37 µL wody. Protokół PCR należy przeprowadzić w następujący sposób: 94 °C przez 2 minuty, a następnie 15 cykli obejmujących 94 °C przez 30 sekund oraz 50 °C przez 45 sekund.

72°C przez jedną minutę, a następnie etap wyżarzania w 72°C przez pięć minut i utrzymywanie w 10°C. Następnie oczyścić nowy produkt PCR za pomocą zestawu DNA clean and concentrator three zgodnie z instrukcjami producenta i rozpuścić w 10 µL buforu elucyjnego. Do 10 µL produktu PCR dodać 1 µL 1 M wodorowęglanu oraz 1 µL si three i inkubować przez jedną godzinę w ciemności.

Następnie ponownie oczyść próbkę oznakowaną S za pomocą zestawu DNA clean and concentrator five i eluuj w 12 µL buforu do elucji. Użyj 1,5 µL próbki do sprawdzenia stężenia cDNA oraz ilości wbudowanego barwnika na spektrofotometrze NanoDrop w probówce z paska PCR, zawierającej 1 µL 25-krotnego buforu do fragmentacji, 5 µL 5-krotnego buforu blokującego, 9,5 µL lub ilości niezbędnej do uzyskania znormalizowanego stężenia końcowego 10 pM lub moli na µL próbki oznakowanej SI3 oraz wody do całkowitej objętości 25 µL. Następnie dodaj 25 µL 2-krotnego buforu do hybrydyzacji GX i krótko wiruj, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

Umieść nowy szkiełko z uszczelką w komorze hybrydyzacyjnej. Nanieś 40 µL próbki na szkiełko z uszczelką. Następnie umieść nadrukowaną macierz wirusową Agilent stroną oznaczoną napisem Agilent do dołu na szkiełku z uszczelką i mocno dokręć śrubę.

Umieść komorę hybrydyzacyjną w inkubatorze ustawionym na 65 °C i przeprowadź hybrydyzację przez noc, stosując powolną rotację z prędkością 10 obr./min w celu przemycia macierzy. Najpierw podgrzej bufor dwa do 37 °C. Napełnij plastikowy pojemnik o pojemności 500 ml około 250 ml buforu jeden.

Wyjmij macierz z komory hybrydyzacyjnej, zanurz ją i oddziel od szkiełka z uszczelką. Przenieś macierz do czystego pojemnika i przemyj w buforze jeden przez jedną minutę. Następnie użyj oddzielnego plastikowego pojemnika o pojemności 500 mililitrów.

Przemyj macierz w podgrzanym buforze dwa przez jedną minutę. Po przemyciu powoli wyjmij macierz z buforu dwa, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.

Użyj chusteczki typu Kimwipe, aby odsączyć nadmiar wilgoci, uważając, by nie dotykać bezpośrednio aktywnej strony macierzy. Na koniec umieść szkiełko w uchwycie do szkiełek stroną Agilent do góry i włóż je do skanera macierzy. W tej procedurze używamy skanera mikromacierzy DNA Agilent o rozdzielczości dwóch mikronów.

Przeskanuj znakowaną macierz SI w rozdzielczości pięciu mikronów lub dwóch mikronów, zgodnie ze standardowym protokołem skanowania instrumentu. Przeanalizuj mikromacierze wirusowe za pomocą analizy skupień lub zautomatyzowanego programu analizy chipów RO e unpredic. Przy użyciu mikromacierzy Viro Chipp nowym wirusem grypy H1N1 z 2009 roku można łatwo wykryć go w próbce z wymazu z nosa pobranej od dziecka z objawami grypopodobnymi.

Dodatkowo wykazaliśmy, że chip wirusowy jest w stanie zidentyfikować nie tylko wirusy oddechowe, ale także szeroki zakres wirusów pochodzących z wielu różnych tkanek i płynów ustrojowych. Przedstawiono tutaj niektóre przykłady detekcji wirusów w krwi pełnej i surowicy przy użyciu vichi. Są to wyniki odpowiadające mikromacierzy viro chip z próbek krwi, albo krwi pełnej, albo surowicy pobranej od czterech pacjentów; dla każdej próbki wyświetlono dwie najwyższe predykcje wirusa, przy czym najwyższa predykcja posiada najniższą wartość P.

Na przykład w próbce zaznaczonej jasnoniebieskim kolorem najprawdopodobniejszą predykcją dla tej próbki jest wirus dengi typu 1. Chociaż drugą w rankingu predykcją jest wirus dengi typu 2, faktyczny wirus w tej próbce krwi pełnej został rzeczywiście potwierdzony jako wirus dengi typu 1, co jest zgodne z wynikami analizy.

Przykłady obejmują odkrycia koronawirusa sars X-M-R-V-A, retrowirusa OME powiązanego z rakiem prostaty i zespołem chronicznego zmęczenia u ludzi oraz HTCV, nowego ludzkiego wirusa serca związanego z infekcjami dróg oddechowych i biegunkami u dzieci. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu 12 godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że cały niezbędny sprzęt i odczynniki wymienione w tej procedurze są dostępne.

W celu potwierdzenia i dalszej analizy nietypowych wzorów hybrydyzacji na chipie wirusowym lub wyników sugerujących obecność nowego wirusa można zastosować inne metody, takie jak specyficzna amplifikacja PCR wirusa oraz sekwencjonowanie głębokie. Opracowanie tej techniki utorowało drogę badaczom w dziedzinie onkologii do badania związku nowych wirusów z nowotworami, specjalistom z zakresu obrony biologicznej i mikrobiologii klinicznej do opracowywania skondensowanych testów opartych na mikromacierzach w celu szybkiej diagnostyki patogenów, a w dziedzinie wirusologii do charakteryzacji nowych wirusów i ich związku z chorobami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykonywania wszystkich etapów badania z wykorzystaniem mikromacierzy wirusowych – szerokospektrowego testu nadzorowania służącego do wykrywania patogenów wirusowych w próbkach klinicznych – począwszy od ekstrakcji kwasów nukleinowych z próbek klinicznych, aż po hybrydyzację na mikromacierzy i analizę wyników.

Należy pamiętać, że praca z próbkami klinicznymi jest uznawana za pracę z materiałem potencjalnie zakaźnym (biologicznie niebezpiecznym), a ekstrakcję kwasów nukleinowych należy przeprowadzać w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 lub wyższym.