Name: Wykorzystanie testu mikromacierzy panwirusowej (Virochip) do badań przesiewowych próbek klinicznych pod kątem patogenów wirusowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Poznaj metodę Virochip do wykrywania znanych i nowych wirusów w próbkach klinicznych. Ta technika mikromacierzowa poprawia diagnostykę infekcji wirusowych w mikrobiologii klinicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Davidowi Wangowi, Anatoly'emu Urismanowi, Amy Kistler, Kaelowi Fischerowi, Patrickowi Tangowi oraz Alexanderowi Greningerowi za początkowe opracowanie i optymalizację protokołu Virochip. Praca ta jest wspierana przez grant NIH K08 i Abbott Discovery Award (dla CC) oraz Howard Hughes Medical Institute (dla JLD).

Etapy badania Virochip obejmują (1) ekstrakcję kwasów nukleinowych z próbek klinicznych, (2) odwrotną transkrypcję wyekstrahowanego RNA oraz 2ndsynteza cDNA nici minus, (3) amplifikacja PCR cDNA z wykorzystaniem randomowych starterów, (3) wbudowanie barwnika fluorescencyjnego Cy3, (4) hybrydyzacja znakowanego materiału z mikromacierzą Virochip oraz (5) skanowanie i analiza (rycina 1). Poniższy protokół zademonstruje zastosowanie testu Virochip w próbce z wymazu z nosa dziecka z objawami infekcji grypopodobnej.
Sekwencje starterów
Starter A 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3'
Starter B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3'
1. Ekstrakcja kwasów nukleinowych
<ol>
	<li>Ekstrakcję kwasów nukleinowych z próbek klinicznych należy przeprowadzać w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) lub wyższego, ponieważ próbki te mogą być zakaźne.</li>
	<li>Próbka z wymazu z nosa jest transportowana w medium transportowym do wirusów. Należy przenieść 20 μL próbki do probówki mikrocentryfugi Eppendorf o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Opcjonalnie: przepuścić próbkę przez filtr 0,22 μm (w celu oczyszczenia cząstek wirusowych)</li>
	<li>Opcjonalnie: poddać próbkę wstępnej obróbce za pomocą DNazy (aby zdegradować genomowe DNA gospodarza i oczyścić chronione, zamknięte w kapsydach kwasy nukleinowe wirusa), wykorzystując zestaw Turbo DNAse (Ambion) zgodnie z instrukcją producenta</li>
	<li>Wyekstrahować kwas nukleinowy z próbki, używając zestawu Zymo ZR Viral RNA Extraction Kit lub Qiagen Ultrasens Virus Kit zgodnie z instrukcją producenta.</li>
</ol>
2. Odwrotna transkrypcja i 2ndSynteza cDNA nici minus („Runda A”)
<ol>
	<li>Dodać 1 μl 40 pmol / μL Dodaj 4 µL wyekstrahowanego RNA do startera A. Podgrzej do 65°C przez 5 min w termocyklerze (np. GeneAmp PCR System 970), a następnie pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
	<li>Dodaj 5 μL mieszaniny master mix składającej się z 2 μL bufor RT 5X, 1 μL 12,5 mM dNTP, 1 μL woda 0.5 μL 0,1 M DTT oraz 0.5 μL SSIII RT (Invitrogen). Inkubować w 42°C x 60 minut.</li>
	<li>W programowalnym termocyklerze podgrzać do 94°C x 2 min (aby przerwać reakcję odwrotnej transkrypcji), schłodzić do 10°C, wirówkę pulsacyjną, a następnie dodać 5 μL Mieszanina Sequenase składająca się z 1 μL bufor 5X Sequenase, 3.8 μL woda, i 0.15 μL Sequenase (USB Corporation). Dla 2nd synteza nici, zwiększanie wartości od 10°C Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 37°C przez ponad 8 min, utrzymać przez 8 min, a następnie podgrzać do 94°C x 2 min (aby dezaktywować Sequenazę) i schłodzić do 10°C (przytrzymać).</li>
	<li>Opcjonalnie Próbkę cDNA z reakcji odwrotnej transkrypcji (RdA) można w tym momencie przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
3. Amplifikacja PCR cDNA z wykorzystaniem losowych starterów („Runda B”)
<ol>
	<li>Dodaj 5 uL próbki Rd A do 45 μL mieszaniny master mix składającej się z 5 μL buforu PCR 10X, 1 μL dNTP 12,5 mM, 1 μL primera B 10 pmol / μL, 1 μL KlenTaq LA (Sigma) oraz 37 μL wody.</li>
	<li>Przeprowadź protokół PCR według następującego schematu: 94°C, 2 min →(25 cykli: 94°C, 30 s / 50°C, 45 s / 72°C, 1 min) →72°C, 5 min →10°C (przechowywanie)</li>
	<li>Sprawdź próbkę Rd B na żelu z agarozy 1,5% w elektroforezie. Powinien być widoczny rozmaz w zakresie około 200 - 10 bp (Rycina 2A)</li>
</ol>
4. Inkorporacja barwnika fluorescencyjnego Cy3
<ol>
	<li>Opcjonalnie: kolejną próbkę można znakować barwnikiem fluorescencyjnym Cy5 i hybrydyzować z tą samą macierzą mikrozespołową.</li>
	<li>Aby włączyć aa-dNTP, dodać 5 uL próbki Rd B do 45 uL mieszaniny master mix składającej się z 5 uL 10X buforu PCR, 1 uL 12,5 mM aa-dNTP (Invitrogen), 1 uL 10 pmol / uL primera B, 1, 1 uL KlenTaq LA (Sigma) oraz 37 uL wody. Wykonać protokół PCR w następujący sposób: 94°C, 2 min → (15 cykli: 94°C, 30 s / 50°C, 45 s / 72°C, 1 min) → 72°C, 5 min → 10°C (przechowywanie)</li>
	<li>Oczyścić próbkę Rd C za pomocą zestawu DNA Clean and Concentrator-5 Kit (Zymo Research) zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować w 10 μL.</li>
	<li>Do próbki Rd C dodać 1 uL 1M wodorowęglanu (Sigma) oraz 1 uL Cy5 (GE Healthcare).</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w ciemności.</li>
	<li>Oczyścić próbkę znakowaną Cy3 za pomocą zestawu DNA Clean and Concentrator-5 Kit (Zymo Research) zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować w 12 μL.</li>
</ol>
5. Hybrydyzacja z mikromacierzą Virochip
<ol>
	<li>Opcjonalnie: użyć 1,5 μL do sprawdzenia stężenia cDNA oraz ilości wbudowanego barwnika za pomocą spektrofotometru Nanodrop (w celu normalizacji próbek)</li>
	<li>Do probówki paskowej do PCR dodać 1 μL 25X buforu do fragmentacji, 5 μL 5X buforu blokującego, 9,5 μL (lub ilość niezbędną do normalizacji) próbki znakowanej Cy3 oraz wodę do uzyskania całkowitej objętości 25 μL (Agilent)</li>
	<li>Dodać 25 μL 2X buforu hybrydyzacyjnego GEx (Agilent). Krótko odwirować, aby usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Nanieść 40 μL próbki na uszczelkę szkiełka.</li>
	<li>Umieścić matrycę Virochip (University of California, San Francisco / Agilent) (stroną oznaczoną napisem „Agilent” skierowaną w dół) na uszczelce szkiełka i mocno dokręcić śrubę.</li>
	<li>Hybrydyzować przez noc w inkubatorze w temperaturze 65°C, przy ustawieniu prędkości obrotowej 10 rpm.</li>
	<li>Aby przemyć matryce, podgrzać bufor 2 (Agilent) do 37°C. Rozdzielić zestaw szkiełko/matryca pod wodą w buforze 1 (Agilent). Przemyć w buforze 1 przez 1 min. Przemyć w podgrzanym buforze 2 przez 1 min. Powoli wyjmować szkiełko z buforu 2, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza (użyć chusteczki typu kimwipe do odsączenia nadmiaru wilgoci, unikając bezpośredniego dotykania aktywnej strony matrycy)</li>
	<li>Umieścić szkiełko w uchwycie i włożyć do skanera matryc.</li>
</ol>
6. Skanowanie i analiza Virochip
<ol>
	<li>Zeskanuj macierz znakowaną Cy3 w rozdzielczości 5 μm lub 2 μm zgodnie ze standardowym protokołem skanowania instrumentu (Rysunek 2B).</li>
	<li>Przeanalizuj mikromacierze Virochip poprzez inspekcję wizualną, analizę skupień lub za pomocą zautomatyzowanego programu analitycznego Virochip, E-Predict1. Każdą z tych trzech metod pozwala na łatwe wykrycie wirusa grypy w próbce z wymazu z nosa (pobranej od dziecka z objawami grypopodobnymi) (Rysunek 2C)</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Przy prawidłowym wykonaniu protokołu, po etapie Rd B, w elektroforezie na żelu agarozowym powinien być widoczny rozmaz (Rysunek 2A). Analiza wizualna mikroarray Virochip na platformie Agilent będzie trudna (Rysunek 2B), ale w przypadku obecności wirusa powinien on zostać łatwo zidentyfikowany poprzez inspekcję wizualną, analizę klastrową i/lub E-Predict (Rysunek 1C). Próbki można wzbogacić zmierzoną ilością kwasu nukleinowego znanego wirusa (np. wirusa mozaiki tytoniu; bakteriofaga MS2), aby służyły one jako kontrola dodatnia w badaniu.
<img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig1.jpg" alt="Ekstrakcja kwasów nukleinowych, amplifikacja PCR, skanowanie mikromacierzy oraz analiza w celu detekcji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Schemat przetwarzania i analizy mikroarray Virochip. Kwasy nukeinowe wyekstrahowane z próbek klinicznych są poddawane losowej amplifikacji, znakowane barwnikami fluorescencyjnymi, a następnie hybrydyzowane z mikromacierzą Virochip. Mikromacierze są skanowane przy 2 μm rozdzielono i przeanalizowano przy użyciu różnych narzędzi obliczeniowych, w tym E-Predict.
<img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig2.jpg" alt="wynik elektroforezy DNA, analiza mikroarray, wykres porównawczy ekspresji genów wirusowych" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rycina 2. Etapy analizy Virochip. Po amplifikacji za pomocą losowej reakcji PCR, rozmaz o wielkości 20–100 bp można zwizualizować za pomocą elektroforezy żelowej (A). (B) Przedstawiono trzy macierze Virochip z 8 macierzy / szkiełek przedmiotowych, przy czym niewielki fragment jednej macierzy został powiększony na wstawce w prawym dolnym rogu. (C) Zautomatyzowana analiza wirusowa za pomocą mikromacierzy z wykorzystaniem systemu E-Predict wykazująca obecność wirusa grypy A w próbce klinicznej. Wysoki wynik podobieństwa (s=0,5) odpowiada wartości p bliskiej zeru, co czyni tę predykcję niezwykle istotną.

<ol><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+detection+and+genotyping+of+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+a+critical+respiratory+illness+caused+by+human+metapneumovirus+by+use+of+a+pan-virus+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray.</a> J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+detection+of+human+parainfluenzavirus+4+infection+associated+with+respiratory+failure+in+an+immunocompetent+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult.</a> Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+DNA+microarrays+for+detection+of+viruses+in+acute+respiratory+tract+infections+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children.</a> J Pediatr. 153, 76-83 (2008).</li>
<li>Kistler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-viral+screening+of+respiratory+tract+infections+in+adults+with+and+without+asthma+reveals+unexpected+human+coronavirus+and+human+rhinovirus+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity.</a> J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).</li>
<li>Rota, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+coronavirus+associated+with+severe+acute+respiratory+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome.</a> Science. 300, 1394-1399 (2003).</li>
<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+discovery+and+sequence+recovery+using+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays.</a> PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+Gammaretrovirus+in+prostate+tumors+of+patients+homozygous+for+R462Q+RNASEL+variant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant.</a> PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).</li>
<li>Kistler, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+divergent+avian+bornaviruses+from+cases+of+proventricular+dilatation+disease%3A+identification+of+a+candidate+etiologic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent.</a> Virol J. 5, e25-e25 (2008).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardioviruses+related+to+Theiler%27s+murine+encephalomyelitis+virus+in+human+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Predict%3A+a+computational+strategy+for+species+identification+based+on+observed+DNA+microarray+hybridization+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns.</a> Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).</li>
</ol>

Brak declared konfliktów interesów.

Protokół Virochip opisany w niniejszym opracowaniu jest złożony i wymaga skrupulatności oraz wysokich kwalifikacji technika badawczego. Kluczowe znaczenie mają poprawne stężenia odczynników oraz warunki przeprowadzania PCR, znakowania i hybrydyzacji. Protokół Virochip można łatwo zmodyfikować w celu analizy tkanek chorobowych, stosując metodę ekstrakcji tkankowej, taką jak TRIzol (Invitrogen), do izolacji kwasów nukleinowych. Sondy można dodawać lub usuwać w zależności od potrzeb, aby uzyskać pożądane spektrum i zakres wykrywania; na przykład sondy do detekcji celów niewirusowych, takich jak bakterie i grzyby, mogą być projektowane i dodawane na bieżąco. Niektóre obecnie opracowywane zastosowania testu Virochip obejmują szerokospektrową diagnostykę wirusologiczną w laboratoriach klinicznych, badanie ognisk epidemicznych, kontrolę czystości leków i szczepionek oraz odkrywanie nowych patogenów wirusowych.

wykorzystanie panwirusej macierzy mikroarray (virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych w kierunku patogenów wirusowych

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Diagnostyka wirusowych przyczyn wielu chorób zakaźnych jest trudna ze względu na naturalną różnorodność sekwencji wirusów, a także ciągłe pojawianie się nowych patogenów wirusowych, takich jak koronawirus SARS i pandemiczny wirus grypy H1N1 z 2009 roku, których nie można wykryć tradycyjnymi metodami. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy i zwalidowaliśmy wcześniej uniwersalną platformę mikromacierzy wirusowej o nazwie Virochip, która umożliwia wykrywanie wszystkich znanych wirusów, a także nowych wariantów w oparciu o konserwowaną homologię sekwencji1. Dzięki zastosowaniu Virochip zidentyfikowaliśmy pełne spektrum wirusów związanych z infekcjami dróg oddechowych, w tym przypadki niewyjaśnionych stanów krytycznych u pacjentów hospitalizowanych, z czułością równą lub wyższą niż w przypadku konwencjonalnych testów klinicznych2-5. Virochip był również wykorzystywany do identyfikacji nowych wirusów, w tym koronawirusa SARS6,7, nowej klady rinowirusów5, XMRV (retrowirusa powiązanego z rakiem prostaty)8, ptasiego bornawirusa (przyczyny choroby wyniszczającej u papug)9 oraz nowego kardjowirusa u dzieci z infekcjami dróg oddechowych i biegunką10. Obecna wersja Virochip została przeniesiona na platformę mikromacierzy Agilent i składa się z około 36 000 sond pochodzących z ponad 1 500 wirusów zarejestrowanych w bazie GenBank do grudnia 2009 roku. W niniejszej pracy prezentujemy kolejne etapy przetwarzania testu Virochip od początku do końca (całkowity czas realizacji około 24 godzin), w tym ekstrakcję kwasów nukleinowych z próbki, amplifikację PCR z użyciem randomowych starterów, inkorporację barwników fluorescencyjnych, a także hybrydyzację na mikromacierzy, skanowanie i analizę.

Virochip to panwirulowa macierz mikroukładów zaprojektowana do jednoczesnego wykrywania wszystkich znanych wirusów, a także nowych wirusów, w oparciu o konserwatywną homologię sekwencji. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przeprowadzić badanie z użyciem Virochip w celu analizy próbek klinicznych pod kątem obecności wirusów znanych i nieznanych.

Wykorzystanie panwirusej macierzy mikroarray (Virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych w kierunku patogenów wirusowych

Diagnostyka wirusowych przyczyn wielu chorób zakaźnych jest trudna ze względu na immanentną różnorodność sekwencji wirusów, a także ciągłe pojawianie się...

W niniejszej procedurze wykorzystano chip Viro, czyli panwiralesową analizę mikroarray do badania próbek klinicznych w kierunku znanych i nieznanych wirusów. W pierwszej kolejności z próbek klinicznych izoluje się kwasy nukleinowe. Następnie wyekstrahowane RNA poddaje się odwrotnej transkrypcji z wykorzystaniem starterów losowych.Przeprowadzono syntezę drugiej nici CD NA, a następnie bibliotekę CD NA powielono za pomocą losowego PCR. Następnie powielone cd NA oznakowano barwnikami fluorescencyjnymi i poddano hybrydyzacji z macierzą mikroprzewodową typu viral chip. Ostatnim krokiem jest skanowanie i analiza mikromacierzy.Ostatecznie, dzięki analizie mikroarray na chipie można uzyskać wyniki wykazujące obecność lub brak jednego lub kilku wirusów. Metody detekcji o szerokim spektrum, takie jak mikroarray wirusowy, są niezbędne w mikrobiologii diagnostycznej, ponieważ powszechne zespoły kliniczne, takie jak zapalenie płuc, nie są specyficzne dla żadnego pojedynczego patogenu, a dodatkowo istnieje stałe zagrożenie pojawieniem się nowych patogenów wirusowych, takich jak koronawirus SARS czy nowy wirus grypy H1N1 z 2009 roku. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii diagnostycznej, np. jaki procent niezdiagnowanych infekcji w warunkach klinicznych może być wywołany przez dotychczas niezidentyfikowane nowe wirusy. Zastosowanie tej techniki prowadzi do lepszej diagnostyki ostrych schorzeń klinicznych w szpitalach, ponieważ pozwala ona na jednoczesne badanie obecności od setek do tysięcy potencjalnych patogenów.Pomysł na tę metodę pojawił się u nas w 2002 roku, kiedy zdecydowaliśmy się zastosować nowo opracowaną technologię mikromacierzy, zapoczątkowaną w laboratorium dr. Josepha DeRisiego na UCSF, do wykrywania wirusów. Naszym pierwszym przypadkiem testowym w warunkach rzeczywistych było wykorzystanie chipa wirusowego do identyfikacji nowego koronawirusa odpowiedzialnego za SARS w 2003 roku; całą procedurę od początku do końca zaprezentuje technik z mojego laboratorium, który zademonstruje użycie testu z chipem wirusowym na próbce wymazu z nosa pobranej od dziecka w celu zdiagnozowania przyczyny ostrej choroby dróg oddechowych. Próbki wymazów z nosogardzieli zbierane są w sterylnych pojemnikach zawierających płynne medium transportowe dla wirusów i przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C.W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy odmrozić probówkę zawierającą próbkę, a następnie krótko wymieszać wymaz w medium przed wyrzuceniem wymazu do pojemnika na odpady biologiczne. Następnie należy odpipetować 200 µL próbki do probówki o pojemności 1,5 mL. Próbkę należy przepuścić przez filtr wirówkowy 0,22 µm w celu oczyszczenia cząstek wirusowych i zebrać ją do nowej probówki 1,5 mL.Następnie, zgodnie z instrukcjami producenta, należy użyć zestawu Turbo DNA firmy Ambien w celu degradacji genomowego DNA gospodarza i oczyszczenia chronionych, enkapsydowanych kwasów nukleinowych wirusa. Po tym kroku należy przeprowadzić ekstrakcję RNA, korzystając z zestawu do ekstrakcji wirusowego RNA XMO ZR lub zestawu do wirusów Qiagen ultrasound, zgodnie z instrukcjami producenta. Stężenie wyekstrahowanego RNA należy zmierzyć za pomocą spektrofotometru kwasów nukleinowych NanoDrop.Stężenie RNA powinno wynosić preferencyjnie co najmniej 10 nanogramów na mikrolitr, jednak może ono różnić się w zależności od próbki, przy użyciu cienkościennej probówki o objętości 200 mikrolitrów. Do czterech mikrolitrów wyekstrahowanego RNA należy dodać jeden mikrolitr primera A o stężeniu 40 PICA moli na mikrolitr. Próbkę należy podgrzać do 65 stopni Celsjusza przez pięć minut w termocyklerze, a następnie pozostawić probówkę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie dodaj pięć µL master mix zawierającego dwa µL 5× buforu RT, jeden µL 12,5 mM dNTP, jeden µL wody, 0,5 µL 0,1 M DTT oraz 0,5 µL odwrotnej transkryptazy w termocyklerze. Inkubuj probówkę w temperaturze 42 °C przez 60 minut. Następnie podgrzej próbkę do 94 °C przez dwie minuty.Aby przerwać reakcję odwrotnej transkrypcji, schłodzić próbkę do 10 °C przez dwie minuty i odwiruć w wirówce pulsacyjnej przez pięć sekund. Następnie dodać 5 µL mieszaniny quease, składającej się z 1 µL buforu quease 5x, 3,8 µL wody i 0,15 µL quease do syntezy drugiej nici. W termocyklerze zwiększyć temperaturę z 10 °C do 37 °C w ciągu ośmiu minut.Inkubować w temperaturze 37 °C przez osiem minut. Następnie podgrzać do 94 °C przez dwie minuty w celu inaktywacji odwrotnej transkryptazy, a w tym momencie schłodzić do 10 °C. W razie potrzeby przechowywać próbkę zawierającą 15 µL cDNA w temperaturze -20 °C.Najpierw dodaj 5 µL próbki CD NA do 45 µL mieszaniny master mix składającej się z 5 µL 10x buforu do PCR, 1 µL 12,5 mM dNTP, 1 µL 100 pmol/µL startera B, 1 µL Cleantech LA oraz 37 µL wody. Następnie przeprowadź protokół PCR w następujący sposób: 94 °C przez 2 minuty, a następnie 25 cykli obejmujących 94 °C przez 30 sekund, 50 °C przez 45 sekund i 72 °C przez 1 minutę.Następnie wykonuje się etap wyżarzania w temperaturze 72 °C przez pięć minut, a po zakończeniu PCR próbki utrzymuje się w temperaturze 10 °C. Produkt PCR należy sprawdzić za pomocą elektroforezy w 1,5% żelu AGE. Powinien być widoczny rozmaz w zakresie od około 200 do 1000 par zasad.Aby wprowadzić AAD DNTP, dodaj 5 µL produktu PCR wirusa do 45 µL mieszaniny master mix składającej się z 5 µL 10-krotnego buforu do PCR, 1 µL 12,5 mM A-A-D-N-T-P, 1 µL 100 p wielu mikrolitrów startera B, 1 µL ClinTech LA oraz 37 µL wody. Przeprowadź protokół PCR w następujący sposób: 94 °C przez 2 minuty, 15 cykli obejmujących 94 °C przez 30 sekund oraz 50 °C przez 45 sekund.72 °C przez jedną minutę, a następnie etap wyżarzania w 72 °C przez pięć minut i utrzymanie w 10 °C. Następnie oczyścić nowy produkt PCR za pomocą zestawu DNA clean and concentrator three zgodnie z instrukcjami producenta i rozpuścić w 10 µL buforu elucyjnego. Do 10 µL produktu PCR dodać 1 µL 1 M wodorowęglanu oraz 1 µL si three i inkubować przez jedną godzinę w ciemności.Następnie ponownie oczyść próbkę oznakowaną S za pomocą zestawu DNA clean and concentrator five i eluuj w 12 µL buforu do elucji. Użyj 1,5 µL próbki do sprawdzenia stężenia cDNA i ilości wbudowanego barwnika na spektrofotometrze NanoDrop. W probówce paskowej do PCR przygotuj mieszaninę: 1 µL 25-krotnego buforu do fragmentacji, 5 µL 5-krotnego buforu blokującego, 9,5 µL lub ilość niezbędna do uzyskania znormalizowanego końcowego stężenia 10 pM lub moli na µL oznakowanej próbki SI3 oraz wody do całkowitej objętości 25 µL. Następnie dodaj 25 µL 2-krotnego buforu do hybrydyzacji GX i krótko odwiruj, aby usunąć pęcherzyki powietrza.Umieść nową szkiełko z uszczelką w komorze hybrydyzacyjnej. Nanieś 40 µL próbki na szkiełko z uszczelką. Następnie połóż wydrukowany przez Agilent panel wiralny stroną oznaczoną jako Agilent do dołu na szkiełku z uszczelką i mocno dokręć śrubę.Umieść komorę hybrydyzacyjną w piecu w temperaturze 65 °C i przeprowadzaj hybrydyzację przez noc przy powolnej rotacji z prędkością 10 obr./min w celu przemycia macierzy. Najpierw podgrzej bufor dwa do temperatury 37 °C. Napełnij 500-mililitrowy plastikowy pojemnik około 250 mililitrami buforu jeden.Wyjmij matrycę z komory hybrydyzacyjnej, zanurz ją i oddziel od slajdu z uszczelką. Przenieś matrycę do czystego pojemnika i przemyj w buforze jeden przez jedną minutę. Następnie użyj oddzielnego plastikowego pojemnika o pojemności 500 ml.Przemyj matrycę w podgrzanym buforze dwa przez jedną minutę. Po przemyciu powoli wyjmij matrycę z buforu dwa, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.Użyj chusteczki typu Kimwipe, aby odsączyć nadmiar wilgoci, uważając, aby nie dotykać bezpośrednio aktywnej strony matrycy. Na koniec umieść szkiełko w uchwycie stroną Agilent do góry i włóż je do skanera matryc. W tej procedurze wykorzystujemy skaner mikromacierzy DNA Agilent two micron.Zeskanuj oznakowaną macierz SI o trzech kanałach w rozdzielczości pięciu mikronów lub dwóch mikronów, zgodnie ze standardowym protokołem skanowania instrumentu. Przeanalizuj mikro macierze wirusowe chipp za pomocą analizy skupień lub zautomatyzowanego programu analizy chipp RO o nazwie unpredic. Przy użyciu mikro macierzy Viro Chipp nowa wersja wirusa grypy H1N1 z 2009 roku jest łatwo wykrywana w próbce wymazu z nosa pobranej od dziecka z objawami grypopodobnymi.Ponadto wykazaliśmy, że chip wirusowy jest w stanie zidentyfikować nie tylko wirusy oddechowe, ale także szeroki zakres wirusów pochodzących z różnych tkanek i płynów ustrojowych. Poniżej przedstawiono kilka przykładów wykrywania wirusów w krwi pełnej i surowicy przy użyciu vichi. Są to wyniki odpowiadające mikromacierzy viro chip z próbek krwi – krwi pełnej lub surowicy pobranej od czterech pacjentów dla każdej próbki; przedstawiono dwie najwyższe prognozy wirusowe, przy czym najwyższa prognoza posiada najniższą wartość P.Na przykład w próbce zaznaczonej na jasnoniebiesko najwyższą przewidywaną wartością jest wirus dengi typu pierwszego. Choć drugie w rankingu przewidywanie wskazuje na wirusa dengi typu drugiego, w tej próbce krwi pełnej faktycznie potwierdzono obecność wirusa dengi typu pierwszego, co jest zgodne z wynikami dict. Kolejnym zastosowaniem mikroarray viro chip jest wykrywanie nowych patogenów.Przykłady obejmują odkrycia koronawirusa sars X-M-R-V-A, retrowirusa OME powiązanego z rakiem prostaty i zespołem chronicznego zmęczenia u ludzi oraz HTCV, nowego ludzkiego wirusa sercowego związanego z infekcjami dróg oddechowych i biegunką u dzieci. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w 12 godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procesu. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zapewnienie dostępności całego niezbędnego sprzętu i odczynników zgodnie z poniższym opisem.W celu potwierdzenia i dalszej analizy nietypowych wzorów hybrydyzacji na chipie wirusowym lub wyników sugerujących obecność nowego wirusa można zastosować inne metody, takie jak specyficzna amplifikacja PCR wirusowa oraz sekwencjonowanie głębokie. Opracowanie tej techniki otworzyło przed badaczami w dziedzinie onkologii możliwość eksploracji powiązań między nowymi wirusami a nowotworami, a w obszarach obrony biologicznej i mikrobiologii klinicznej pozwoliło na opracowanie skondensowanych testów opartych na mikromacierzach do szybkiej diagnostyki patogenów, natomiast w wirologii umożliwiło charakterystykę nowych wirusów oraz ich związku z chorobami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykonywania wszystkich etapów analizy z wykorzystaniem mikromacierzy wirusowej — szeroko zakrojonego testu nadzorczego do wykrywania patogenów wirusowych w próbkach klinicznych — począwszy od ekstrakcji kwasów nukleinowych z próbek klinicznych, aż po hybrydyzację na mikromacierzy i analizę wyników.Należy pamiętać, że praca z próbkami klinicznymi jest uznawana za materiał biologicznie niebezpieczny, a ekstrakcja kwasów nukleinowych powinna być przeprowadzana w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego dwa lub wyższym.

using-pan-viral-microarray-assay-virochip-to-screen-clinical-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie ogólnowirusowego testu mikroarray (Virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych pod kątem wirusowych patogenów

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest przedstawiona jako niedroga alternatywa dla detekcji fluorescencyjnej w macierzach mikroukładów. W oparciu o fotopolimeryzację, ampliPHOX wytwarza stałe polimerowe plamki widoczne gołym okiem w zaledwie kilka minut. Wyniki są następnie obrazowane i automatycznie interpretowane za pomocą prostego, a zarazem wydajnego pakietu oprogramowania.

Kolorymetryczna detekcja ampliPHOX na mikrotablicy DNA do wykrywania grypy

W tym filmie pokazujemy proces wykrywania izotypów przeciwciał w wielu próbkach ludzkiej surowicy za pomocą szkiełka mikromatrycowego wydrukowanego z antygenowymi podtypami szczepów wirusa grypy.

Test mikromacierzy antygenu wirusowego do wykrywania izotypów przeciwciał w surowicy przeciwko antygenowi wirusowemu

Ten film demonstruje test przyczepiania wirusów do badania przesiewowego związków przeciwwirusowych. Wykorzystując genetycznie zmodyfikowany wirus zapalenia wątroby typu C i lucyferazy, ocenia hamujący wpływ na przyłączanie się wirusa, na co wskazuje niższe natężenie światła w studzienkach poddanych działaniu kooperacji w porównaniu ze studzienkami leczonymi samym wirusem.

Test przyłączania wirusa do badań przesiewowych związków przeciwwirusowych

Zintegrowany mikroprzepływowy układ termoplastyczny został opracowany do użytku jako diagnostyka molekularna. Chip wykonuje ekstrakcję kwasów nukleinowych, odwrotną transkryptazę i PCR. Opisano metody wytwarzania i uruchamiania chipa.

Wytwarzanie chipów mikroprzepływowych i metoda wykrywania grypy

Identyfikacja ekspresji poszczególnych loci HERV w oparciu o mikromacierze: zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty

Trzy testy, w tym test oparty na działaniu cytopatycznym (CPE), test dawka-odpowiedź i test czasu dodania (ToA) zostały opracowane, zoptymalizowane, zatwierdzone i wykorzystane do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV), a także do określenia możliwego mechanizmu działania (MoA) dla nowo zidentyfikowanych leków przeciwwirusowych.

Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

Testy in vitro do pomiaru replikacji wirusa zostały znacznie ulepszone dzięki rozwojowi rekombinowanych wirusów RNA wyrażających lucyferazy lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy takie rekombinowane szczepy wirusów odry i chikungunya w celu wyizolowania leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

Wysokoprzepustowe testowanie patogenów opartych na DNA i RNA za pomocą nanoskalowego PCR jest opisane za pomocą syndromicznego panelu PCR na psach i koniach.

Wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale PCR

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w celu odkrycia celów gospodarza, które mogą być manipulowane w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, w szczególności terapii wirusem rabodu i krowianki, ale można go łatwo dostosować do innych platform wirusów onkolitycznych lub do odkrywania genów gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Poznaj metodę Virochip do wykrywania znanych i nowych wirusów w próbkach klinicznych. Ta technika mikromacierzowa poprawia diagnostykę infekcji wirusowych w mikrobiologii klinicznej.

Wykorzystanie testu mikromacierzy panwirusowej (Virochip) do badań przesiewowych próbek klinicznych pod kątem patogenów wirusowych (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie panwirusej macierzy mikroarray (Virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych w kierunku patogenów wirusowych

Przeglądaj więcej filmów