Wykorzystanie testu mikromacierzy panwirusowej (Virochip) do badań przesiewowych próbek klinicznych pod kątem patogenów wirusowych

Ta procedura wykorzystuje chip Viro, test mikromacierzy wirusowej do analizy próbek klinicznych zarówno pod kątem znanych, jak i nieznanych wirusów. Pierwsze kwasy nukleinowe są ekstrahowane z próbek klinicznych. Następnie wyekstrahowany RNA jest odwrócony i transkrybowany przy użyciu losowych starterów.

Przeprowadza się syntezę drugiej nici CD NA, a bibliotekę CD NA amplifikuje się losowym PCR. Następnie amplifikowana płyta CD NA jest znakowana barwnikami fluorescencyjnymi i hybrydyzowana do mikromacierzy chipów wirusowych. Ostatnim krokiem jest zeskanowanie i przeanalizowanie mikromacierzy.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na obecność lub brak wirusa lub kilku wirusów poprzez analizę mikromacierzy chipa. Metody wykrywania o szerokim spektrum, takie jak mikromacierz wirusa chipp, są potrzebne w mikrobiologii diagnostycznej, ponieważ powszechne zespoły kliniczne, takie jak zapalenie płuc, nie są specyficzne dla żadnego pojedynczego patogenu, a także ze względu na ciągłe pojawiające się zagrożenie nowymi patogenami wirusowymi, takimi jak koronawirus SARS i nowy wirus grypy H one N one z 2009 r., Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii diagnostycznej, Na przykład, jaki odsetek niezdiagnozowanych zakażeń w warunkach klinicznych może być spowodowany przez jeszcze niezidentyfikowane nowe wirusy. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku lepszej diagnozy ostrej choroby klinicznej w szpitalu, ponieważ testujemy setki do tysięcy potencjalnych patogenów jednocześnie.

Po raz pierwszy pomysł na tę metodę wpadł nam do głowy w 2002 roku, kiedy zdecydowaliśmy się zastosować nowo opracowaną technologię mikromacierzy, zapoczątkowaną w laboratorium dr Josepha DeRisi na UCSF, do wykrywania wirusów. Naszym pierwszym prawdziwym przypadkiem testowym było użycie chipa wirusowego do zidentyfikowania nowego koronawirusa odpowiedzialnego za SARS w 2003 roku, demonstrując procedurę od początku do końca, będzie technikiem z mojego laboratorium, który zademonstruje zastosowanie testu wirusowego na próbce wymazu z nosa od dziecka, aby zdiagnozować przyczynę jej ostrej choroby układu oddechowego. Próbki wymazów z nosogardzieli są zbierane w sterylnych pojemnikach zawierających transport wirusa, płynne podłoża i przechowywane w stanie zamrożonym w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

W kapturze bezpieczeństwa biologicznego pozwól probówce zawierającej próbkę rozmrozić się i krótko wymieszaj wacik z pożywką przed wyrzuceniem wacika do pojemnika na biozagrożenie. Następnie podwielokrotność 200 mikrolitrów próbki do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Przepuść próbkę przez filtr wirowy o średnicy 0,22 mikrona w celu oczyszczenia z cząstek wirusa i do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie użyj zestawu Turbo DNA firmy Ambien zgodnie z instrukcjami producenta, aby zdegradować genomowe DNA gospodarza i oczyścić go w celu uzyskania chronionego kapsułkowanego wirusowego kwasu nukleinowego. Następnie wykonaj ekstrakcję RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji wirusowego RNA XMO ZR lub zestawu wirusów ultrasonograficznych Qiagen zgodnie z instrukcjami producenta. Zmierz stężenie wyekstrahowanego RNA za pomocą spektrofotometru kwasów nukleinowych NanoDrop.

Stężenie RNA jest korzystnie co najmniej 10 nanogramów na mikrolitr, ale będzie się różnić w zależności od próbki przy użyciu cienkościennej probówki o pojemności 200 mikrolitrów. Dodaj jeden mikrolitr startera A o stężeniu 40 moli PICA na mikrolitr do czterech mikrolitrów wyekstrahowanego RNA. Podgrzej próbkę do 65 stopni Celsjusza przez pięć minut w termocyklerze, a następnie pozwól probówce ostygnąć do temperatury pokojowej przez pięć minut.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów mieszanki głównej zawierającej dwa mikrolitry pięciokrotnego buforu RT, jeden mikrolitr 12,5 milimolowy, DNTP jeden mikrolitr wody 0,5 mikrolitra, 0,1 mola DTT i 0,5 mikrolitra indeksu górnego trzy, odwrotną transkryptazę w termocyklerze. Inkubować probówkę w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 60 minut. Następnie podgrzewaj próbkę do 94 stopni Celsjusza przez dwie minuty.

Aby przerwać reakcję odwrotnej transkryptazy, zadzwoń do 10 stopni Celsjusza na dwie minuty i wiruj pulsacyjnie przez pięć sekund. Następnie dodaj pięć mikrolitrów mieszanki quease składającej się z jednego mikrolitra pięciokrotnego buforu do tłumienia, 3,8 mikrolitra wody i 0,15 mikrolitra mieszanki syntezy drugiej nici. Rozgrzej termocykler z 10 stopni Celsjusza do 37 stopni Celsjusza w ciągu ośmiu minut.

Trzymaj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem minut. Następnie podgrzewaj do 94 stopni Celsjusza przez dwie minuty, aby dezaktywować płyn i w tym momencie wezwij do 10 stopni Celsjusza. W razie potrzeby przechowuj próbkę zawierającą 15 mikrolitrów CDNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Najpierw dodaj pięć mikrolitrów próbki CD NA do 45 mikrolitrów mieszanki głównej składającej się z pięciu mikrolitrów 10-krotnego buforu PCR, jednego mikrolitra 12,5 milimola, DNTP jednego mikrolitra 100 pomo na mikrolitr startera, B jednego mikrolitra cleantech LA i 37 mikrolitrów wody. Następnie uruchom protokół PCR w następujący sposób, 94 stopnie Celsjusza przez dwie minuty, a następnie 25 cykli 94 stopni Celsjusza przez 30 sekund. 50 stopni Celsjusza przez 45 sekund i 72 stopnie Celsjusza przez minutę.

Następnie krok klęczący w temperaturze 72 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie utrzymanie w temperaturze 10 stopni Celsjusza po PCR. Sprawdź produkt PCR i żel do elektroforezy 1,5% AOSE. Należy uwidocznić rozmaz od około 200 do 1000 par zasad.

Aby włączyć AAD DNTP, dodaj pięć mikrolitrów wirusowego produktu PCR do 45 mikrolitrów mieszanki głównej składającej się z pięciu mikrolitrów 10-krotnego buforu PCR, jednego mikrolitra 12,5 milimolowego, A-A-D-N-T-P jednego mikrolitra 100 p wielomikrolitrowego startera, B jednego mikrolitra ClinTech LA i 37 mikrolitrów wody. Uruchom protokół PCR w następujący sposób, 94 stopnie Celsjusza przez dwie minuty, 15 cykli po 94 stopnie Celsjusza przez 30 sekund. 50 stopni Celsjusza przez 45 sekund.

72 stopnie Celsjusza przez jedną minutę i klęczący krok 72 stopni Celsjusza przez pięć minut i trzymaj w temperaturze 10 stopni Celsjusza. Następnie wyczyść nowy produkt PCR za pomocą zestawu do czyszczenia i koncentratora DNA zgodnie z instrukcjami producenta i umieść w 10 mikrolitrach buforu elucyjnego. Dodaj jeden mikrolitr jednego molowego wodorowęglanu i jeden mikrolitr si trzy do 10 mikrolitrów produktu PCR i inkubować przez godzinę w ciemności.

Następnie ponownie oczyść próbkę znakowaną S za pomocą zestawu DNA clean i koncentratora five i wymyj w 12 mikrolitrach buforu elucyjnego. Użyj 1,5 mikrolitra próbki, aby sprawdzić stężenie CDNA i ilość barwnika zawartego na spektrofotometrze NanoDrop w probówce paskowej PCR w jednym mikrolitrze 25-krotnym buforze fragmentacyjnym, pięciu mikrolitrach pięciokrotnym buforze blokującym 9,5 mikrolitra lub ilości niezbędnej do znormalizowanego stężenia końcowego 10 pików lub moli na mikrolitr SI, trzech znakowanych próbek SI i wody do całkowitej objętości 25 mikrolitrów. Następnie dodaj 25 mikrolitrów dwukrotnego buforu hybrydyzacyjnego GX i krótko odwiruj, aby usunąć pęcherzyki.

Umieść nowy suwak uszczelki w komorze hybrydyzacji. Załaduj 40 mikrolitrów próbki na suwak uszczelki. Następnie umieść wydrukowaną tablicę wirusową Agilent stroną oznaczoną Agilent w dół na górze suwaka uszczelki i mocno dokręć.

Umieść komorę hybrydyzacyjną w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza i hybrydyzuj przez noc, wykonując powolne obroty 10 obrotów na minutę, aby umyć matryce. Najpierw podgrzej bufor od dwóch do 37 stopni Celsjusza podczas podgrzewania. Napełnij plastikowy pojemnik o pojemności 500 mililitrów około 250 mililitrami buforu. Jeden.

Wyjmij matrycę z komory hybrydyzacyjnej, zanurz matrycę i oddziel ją od suwaka uszczelki. Przenieść macierz do czystego pojemnika i myć w buforze przez jedną minutę. Następnie za pomocą osobnego plastikowego pojemnika o pojemności 500 mililitrów.

Umyć matrycę w podgrzanym buforze drugim przez jedną minutę. Po umyciu powoli wyjmij macierz z bufora. Po drugie, uważając, aby uniknąć bąbelków.

Użyj chusteczki kim, aby odprowadzić nadmiar wilgoci, uważając, aby nie dotykać bezpośrednio aktywnej strony matrycy. Na koniec umieść szkiełko w uchwycie szkiełek Agilent stroną do góry i włóż do skanera matrycowego. W tej procedurze używamy dwumikronowego skanera mikromacierzy DNA firmy Agilent.

Zeskanuj matrycę z trzema znakami SI przy pięciu mikronach lub dwóch mikronach zgodnie ze standardowym protokołem skanowania instrumentu. Analizuj mikromacierze chipów wirusowych za pomocą analizy skupień lub zautomatyzowanego programu do analizy chippów RO i niepredykcyjnego. Korzystając z mikromacierzy Viro Chipp 2009, nowy wirus grypy H jeden N jeden jest łatwo wykrywalny w próbce wymazu z nosa pobranej od dziecka z chorobą grypopodobną.

Ponadto wykazaliśmy, że chip wirusowy jest w stanie zidentyfikować nie tylko wirusy układu oddechowego, ale także szeroką gamę wirusów z wielu różnych tkanek i płynów ustrojowych. Kilka przykładów wykrywania wirusa w pełnej krwi i surowicy za pomocą vichi, jak pokazano tutaj. Są to wywołania odpowiadające mikropromieniom viro chip z próbek krwi, krwi pełnej lub surowicy pobranej od czterech pacjentów dla każdej próbki, pokazane są dwie górne prognozy wirusa, przy czym górna prognoza wirusa ma najniższą wartość P.

Na przykład w próbce wyróżnionej kolorem jasnoniebieskim główną prognozą dla tej próbki jest wirus dengi typu pierwszego. Podczas gdy drugą w kolejności prognozą jest wirus dengi typu drugiego, rzeczywisty wirus w tej próbce krwi pełnej został rzeczywiście potwierdzony jako wirus dengi typu pierwszego, co jest zgodne z wynikami dict. Innym zastosowaniem chipa viro jest odkrywanie nowych patogenów.

Niektóre przykłady obejmują odkrycia koronawirusa SARS X-M-R-V-A, retrowirusa OME związanego z rakiem prostaty i zespołem przewlekłego zmęczenia u ludzi oraz HTCV, nowego ludzkiego wirusa sercowo-naczyniowego związanego z infekcjami dróg oddechowych i biegunką u dzieci po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w ciągu 12 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Przystępując do tej procedury, należy pamiętać o zapewnieniu dostępności całego niezbędnego sprzętu i odczynników zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak specyficzna amplifikacja wirusa PCR i głębokie sekwencjonowanie, mogą być wykonywane w celu potwierdzenia i śledzenia nietypowych wzorców hybrydyzacji chipów wirusowych lub wyników chipów wirusowych, które sugerują obecność nowego wirusa po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny onkologii do zbadania związku nowych wirusów z rakiem w dziedzinie obrony biologicznej i mikrobiologii klinicznej w celu opracowania skondensowanych testów mikro do szybkiej diagnostyki patogenów oraz w dziedzinie wirusologii do charakterystyki nowych wirusów i ich związku z chorobą. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać wszystkie etapy testu mikrorentgenowskiego chipa wirusowego, testu nadzoru o szerokim spektrum w celu wykrycia patogenów wirusowych w próbkach klinicznych, od ekstrakcji kwasów nukleinowych, od próbek klinicznych po hybrydyzację i analizę mikropromieni.

Nie zapominaj, że praca z próbkami klinicznymi jest uważana za niebezpieczną biologicznie, a ekstrakcja kwasów nukleinowych powinna być przeprowadzana w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego drugim lub wyższym.