Przygotowanie, oczyszczanie i charakterystyka kompleksów lantanowców do stosowania jako środki kontrastowe w obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego

Ogólnym celem tej procedury jest synteza, oczyszczenie i scharakteryzowanie kompleksów zawierających lantanowców, które można wykorzystać do znakowania makrocząsteczek biologicznych. Osiąga się to poprzez pierwsze zmieszanie metalowego materiału wyjściowego i liganda, jednocześnie kontrolując pH roztworu. Drugim etapem zabiegu jest oczyszczenie powstałego kompleksu za pomocą dializy.

Następnie należy zweryfikować brak wolnego metalu. Ostatnim etapem procedury jest scharakteryzowanie właściwości kompleksu, które są istotne dla obrazowania. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują, że zsyntetyzowane kompleksy będą zachowywać się jak środki kontrastowe poprzez pomiary aktywności relaksacyjnej.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie obrazowania, takie jak to, czy liczba koordynacyjna wody środka kontrastowego zmienia się po związaniu z białkiem. Ogólnie rzecz biorąc, osoby potrzebujące tej metody będą miały trudności, ponieważ uważne kontrolowanie pH spowoduje, że LI stanie się bezużyteczny dla edukacji biologicznej. Demonstracją pomiarów dializ i aktywności będą Buda i Sashi.

Absolwenci z mojego laboratorium: Aby rozpocząć metanację za pomocą soli lantanowców, najpierw rozpuść jeden odpowiednik liganda w wodzie, aby uzyskać roztwór o stężeniu od 30 do 265 milimolowym. Ligand Paraiso Benzyl DTPA jest tutaj stosowany w stężeniu 73 milimolów. Następnie dostosuj pH roztworu liganda do zakresu od 5,5 do siedmiu, dodając jeden molowy wodorotlenek amonu.

W tym filmie stosuje się 0,2 mililitra jednomolowego roztworu wodorotlenku amonu, rozpuszczając jeden do dwóch odpowiedników chlorku lantanowca w wodzie, aby uzyskać roztwór o stężeniu od pięciu do 1000 milimolów. Można stosować zarówno chlorek bium euro, jak i chlorek gadolinu w stężeniach 111 milimolowych. Często nadmiar metalu jest wykorzystywany do doprowadzenia wentylacji do końca, a tym samym do uproszczenia oczyszczania.

Następnie dodaj każdy roztwór soli lanowych do przygotowanego roztworu liganda, mieszając. Teraz dostosuj pH powstałych mieszanin reakcyjnych do zakresu od 5,5 do siedmiu, dodając 0,2 molowego wodorotlenku amonu. W tym przypadku do regulacji roztworu stosuje się łącznie 0,5 mililitra 0,2-molowego roztworu wodorotlenku amonu.

Jeśli używany ligand zawiera wrażliwe na kwasy grupy funkcyjne, na tym etapie kilkakrotnie dostosuj pH. Należy zachować ostrożność podczas regulacji pH, ponieważ jeśli roztwór stanie się zbyt zasadowy, wszelkie wrażliwe na zasady grupy funkcyjne, takie jak izotiocyjanian, staną się bezużyteczne. W przypadku koniugacji należy ściśle monitorować reakcję za pomocą pomiarów pH.

Reakcja jest zakończona, gdy pH pozostaje stałe W przypadku ligandów bez żadnych wrażliwych na zasady grup funkcyjnych przydatne może być również badanie, które polega na podniesieniu pH. Aby rozpocząć diagnostykę dializy, należy określić odpowiednią długość rurki dializacyjnej, która utrzyma objętość próbki, oraz dodatkową długość, aby pomieścić dodatkowe 10% objętości próbki. Następnie postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta, aby przyciąć rurkę do tej długości.

W tym filmie zastosowano membranę odcinającą masę cząsteczkową o masie cząsteczkowej od 100 do 500 daltonów, ale rurki odcinające o większej masie cząsteczkowej mogą być odpowiednio użyte, jeśli koniugacja jest wykonywana przed metacją, w razie potrzeby, w oparciu o wytyczne producenta, namocz przecięty przewód dializacyjny i wodę przez 15 minut w temperaturze otoczenia. Następnie napełnij zbiornik dializacyjny wodą, która posłuży jako dializat. Używana jest tutaj zlewka o pojemności jednego litra.

Objętość dializatu powinna być około 100 razy większa niż objętość próbki. Teraz złóż dwukrotnie jeden koniec rurki i zabezpiecz złożoną część zaciskiem zamykającym do dializy. Owinąć koniec zamknięcia gumową opaską, aby upewnić się, że pozostaje zamknięte podczas dializy.

Przygotowany wcześniej mieszaninę reakcyjną przefiltrować przez filtr 0,2 mikrona. Następnie załaduj filtrat do otwartego końca rurki. Uważając, aby nie rozerwać rurki.

Upewnij się, że zostawiłeś wystarczająco dużo miejsca nad głową, aby zamknąć rurkę. Złóż dwukrotnie pozostały otwarty koniec rurki, a następnie zabezpiecz go zamknięciem i owiń zamknięcie gumową opaską. Następnie przymocować szklaną fiolkę z powietrzem do zacisku na jednym końcu rurki do dializy za pomocą innej gumki.

Następnie przymocuj fiolkę zawierającą piasek do drugiego zacisku. Fiolki te zapewniają, że rurka pozostaje zanurzona w dializacie. Teraz umieść pełną rurkę w zbiorniku dializacyjnym, który zawiera dializat.

Wymieszać dializat za pomocą magnetycznej płytki mieszającej z małą prędkością w temperaturze otoczenia. Upewnij się, że prędkość mieszania pozostaje niska, a roztwór nie. Wir. Zmieniaj dialate trzy razy w ciągu dnia.

W tym filmie dialate jest zmieniany po 2,5, 6,5 i 11,5 godzinie. Pozwól, aby dializa była kontynuowana przez noc przez łącznie 20 do 28 godzin. Po zakończeniu dializy wyjmij rurkę z dialatu i ostrożnie otwórz jedno zamknięcie, aby usunąć próbkę.

Umyć rurkę dializacyjną trzykrotnie wodą i połączyć popłuczyny z próbką. Na koniec usuń wodę z próbki pod zmniejszonym ciśnieniem. Osiąga się to poprzez liofilizację.

Próbka jest zamrażana, a następnie umieszczana w aparacie do liofilizacji. Aby ocenić obecność wolnego metalu w próbce, najpierw przygotuj bufor octanowy, rozpuszczając 1,4 mililitra kwasu octowego w 400 mililitrach wody, a następnie dostosuj pH do 5,8 za pomocą jednego molowego wodorotlenku amonu i dodaj wodę, aby uzyskać całkowitą objętość 500 mililitrów. Następnie rozpuścić 0,3 miligrama każdego kompleksu w 0,3 mililitra buforu.

Teraz przygotuj pomarańczowy wskaźnik xol, który powinien mieć 16 mikromoli w buforze pH 5,8. Dodaj trzy mililitry tego roztworu wskaźnika do wcześniej rozpuszczonych kompleksów metali. Wykryj obecność wolnego metalu poprzez obserwację zmiany koloru wskaźnika z żółtego na fioletowy.

W razie potrzeby ilość wolnego metalu można określić ilościowo, tworząc krzywą kalibracyjną. Jeśli pozostaje wolny metal, próbka powinna być dalej oczyszczana za pomocą dializy lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej przed charakterystyką. Następnie, aby określić liczbę koordynacyjną wody dla próbki opium, należy przygotować roztwór około jednego milimola kompleksu zawierającego opium w wodzie, a następnie inny roztwór o tym samym stężeniu w tlenku deuteru.

Przed analizą roztwór tlenku deuteru należy trzykrotnie odparować i rozpuścić w tlenku deuteru w celu usunięcia resztek wody, włączyć spektrofluorymetr, dodać roztwór wodny do czystego spektrofluorymetru i umieścić go w spektrofluorymetrze. Teraz wykonaj wzbudzenie i emisje, aby określić maksima dla każdego z nich odpowiednio na około 395 nanometrach i 595 nanometrach. Następnie wykonaj eksperyment z zanikiem czasu fosforescencji, używając właśnie określonych długości fal wzbudzenia i emisji oraz wyświetlanych tutaj parametrów.

Powtórz ten krok z przygotowanym roztworem tlenku deuteru z właśnie uzyskanych danych o rozpadzie luminescencji, logarytmu naturalnego intensywności w funkcji czasu. Nachylenie tych linii to tempo zanikania. W tym filmie wideo program Microsoft Excel 2007 został użyty do wygenerowania wykresów logarytmu naturalnego na podstawie nieprzetworzonych danych.

Użyj szybkości zaniku w równaniu opracowanym przez hors i współpracowników widocznych tutaj. Jeśli twój ligand zawiera grupy OH lub NH skoordynowane z metalem, równanie należy zmodyfikować przed użyciem. Aby najpierw określić pomiary względności próbki, wybierz żądany tryb aplikacji w analizatorze czasu relaksacji, T jeden lub T dwa.

W tym miejscu wybierane jest ustawienie T one. Następnie należy przygotować serię próbek, które zawierają różne stężenia kompleksu zawierającego lantanowców w rozpuszczalniku. Tutaj woda jest używana jako rozpuszczalnik, a roztwory dziesięciu pięciu po 0,5, 1,25, 0,625 i zero.

Milimolowe są przygotowane. Można stosować inne rozpuszczalniki lub przyzwolenia, ale ważne jest, aby używać rozpuszczalnika jako ślepej próby. Ostateczna objętość próbki jest specyficzna dla używanego instrumentu.

Umieść próbkę w instrumencie i pozostaw ją na pięć minut, aby zrównoważyła się z temperaturą instrumentu, która wynosi 37 stopni Celsjusza dla jednostki użytej w tym filmie. Teraz określ czas relaksacji w jednostkach sekund, dostosowując parametry oprogramowania, aby uzyskać gładką krzywą wykładniczą dla T jeden lub T dwa. Powtórzyć tę czynność dla wszystkich próbek, w tym dla próby ślepej.

Teraz oblicz odwrotność zmierzonej wartości relaksacji T jeden lub T dwie i wykreśl wykres. Te wartości w stosunku do stężenia Lathana i jednostek milimolowych pasują do wykresu z linią prostą. Nachylenie dopasowanej linii jest czynnością relaksacyjną wynoszącą R jeden lub R dwa odpowiednio dla T jeden i T dwa.

Widzimy tu ogólny schemat mediacji i oczyszczenia. Ten schemat przedstawia ogólną procedurę metacji i powody, dla których warto wybrać różne korzenie oczyszczające. Tutaj widzimy reprezentatywny wykres rozpadu luminescencji, na którym wykreślany jest naturalny log rozpadu w funkcji czasu, nachylenia linii wygenerowanych z podobnych krzywych wymaganych dla roztworów wody i tlenku deuteru są używane z równaniem pierwszym do określenia liczby koordynacyjnej wody kompleksów zawierających opium.

Reprezentatywny przykład pomiarów żywotności można zobaczyć tutaj, gdzie nachylenie dopasowanej linii jest żywotnością T one próbki. Oprócz opisanej w protokole charakterystyki liczby koordynacyjnej wody i żywotności, ważne jest również scharakteryzowanie produktów końcowych przy użyciu standardowych technik chemicznych. Tożsamość związku można uzyskać za pomocą reprezentatywnych widm masowych spektrometrii mas, które pokazują wzorce diagnostyczne izotopów dla kompleksów zawierających gadolin i opium.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak spektroskopia endr, HPLC i analiza elementarna, w celu dalszego scharakteryzowania powstałych kompleksów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak syntetyzować, oczyszczać i charakteryzować kompleksy zawierające lantanowców, które można wykorzystać do znakowania makrocząsteczek biologicznych.