Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego do zastosowań w multimodalnym obrazowaniu molekularnym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest synteza biofunkcjonalizowanych nanocząsteczek błękitu pruskiego do zastosowania jako multimodalne środki obrazowania molekularnego. Jest to realizowane poprzez wstępną syntezę nanocząsteczek błękitu pruskiego zawierających jony gadolinu lub manganu, które wzmacniają sygnał MRI. Drugim krokiem jest przyczepienie fluorescencyjnej awidyny do powierzchni nanocząsteczek, co nadaje im zdolność do obrazowania fluorescencyjnego.

Następnie nanocząstki powlekane awidonomi są biofunkcjonalizowane za pomocą wybranych biotynylowanych przeciwciał ukierunkowanych na konkretne komórki. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie kontroli jakości biofunkcjonalizowanych nanocząstek poprzez pomiar ich rozmiaru, potencjału zeta oraz stabilności czasowej. W końcowej fazie biofunkcjonalizowane nanocząstki są wykorzystywane w multimodalnym obrazowaniu molekularnym do wizualizacji specyficznej populacji docelowych komórek w mieszaninie przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego i MRI.

Obecne komercyjne środki kontrastowe służą zazwyczaj do obrazowania w jednym trybie i oferują rozdzielczość jedynie na poziomie anatomicznym. Nanocząsteczki błękitu pruskiego łączą dwa komplementarne tryby obrazowania – MRI i fluorescencję – co umożliwia obrazowanie molekularne oraz na poziomach podkomórkowych. Zastosowania multimodalnych nanocząsteczek obejmują diagnostykę nowotworów i chorób zapalnych, a także monitorowanie odpowiedzi na ich leczenie.

Dzieje się tak dlatego, że nanofunkcjonalizowane cząstki mogą celować i wiązać się z populacją komórek w określonym regionie organizmu. Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji w diagnostyce nowotworów i chorób zapalnych oraz w ocenie odpowiedzi na leczenie, może być ona również zastosowana w innych stanach patologicznych, które zyskają dzięki czułości i specyficzności obrazowania molekularnego. Wykorzystując fluorescencję i MRI, sformułowaliśmy koncepcję wytwarzania tych nanocząstek po ustaleniu, że błękit pruski — środek zatwierdzony przez FDA do spożycia doustnego przez ludzi — może być stabilnie syntetyzowany w ramach jednoetapowego schematu syntezy i skutecznie funkcjonalizowano biologicznie przy użyciu standardowych technik biokoniugacji.

Na początek należy przygotować 5 mM roztwór heksacyanoferanu(II) potasu w 5 ml wody dejonizowanej, aby otrzymać roztwór A. Następnie należy przygotować roztwór B zawierający 2,5 mM chlorku żelaza(III) oraz 2,5 mM chlorku manganu(II) w 10 ml wody dejonizowanej do syntezy nanocząsteczek błękitu pruskiego manganu. Inne nanocząsteczki można syntezować zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieść roztwór B do kolby okrągłodennej i mieszać roztwór z prędkością 1000 obr./min w temperaturze pokojowej.

Za pomocą pompy perystaltycznej dodać kroplami roztwór A do naczynia z prędkością 10 ml na godzinę. Po zakończeniu dodawania roztworu A mieszać mieszaninę przy 1000 RPM przez kolejne 30 minut. Następnie przenieść 1 ml aliquoty mieszaniny do probówek do mikrowirowania i dodać do każdej probówki 0,2 ml pięciu mili sodium chloride.

Wirować probówki przy 20 000 ×g przez co najmniej 10 minut, a następnie ostrożnie usunąć nadsącz, pozostawiając osad z nanocząsteczek. Następnie do każdego osadu dodać jeden mililitr wody dejonizowanej. Za pomocą mikropipety zawiesić nanocząsteczki równomiernie w roztworze, stosując sonikację.

Przemyć nanocząstki co najmniej trzy kolejne razy, aby usunąć z zawiesiny składniki początkowej reakcji po ostatnim wirowaniu, resuspender nanocząstki w jednym mililitrze wody dejonizowanej po pokryciu nanocząstek fluorescencyjnym barwnikiem zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie wyjąć z lodówki zapasy biotynilowanych przeciwciał. Należy użyć przeciwciała przeciwko antygenowi neuronalno-glejowemu 2 oraz przeciwciała przeciwko ludzkiej eotaksynie 3. Przenieść biotynilowane przeciwciało do nylonowego filtra do mikrowirówki 0,2 µm, a następnie wirować probówkę z prędkością 14 000 ×g przez 10 minut.

Następnie należy dodać mniej niż lub równo 0,05 mg przeciwciała na każdy miligram nanocząsteczek powlekanych Aden i zabezpieczyć probówki folią aluminiową przed światłem. Inkubować probówki przy łagodnym wstrząsaniu przez dwie do czterech godzin w temperaturze 4 °C. Po przyłączeniu przeciwciał dodać 10 µL próbki nanocząsteczek o stężeniu 1 mg/mL do 990 µL wody dejonizowanej w jednorazowej plastikowej probówce, zamknąć probówkę i wymieszać w wortexie.

Następnie wyznacz średnią wielkość nanocząstek za pomocą systemu dynamicznego rozpraszania światła pod kątem pomiaru 173 stopnie. Rozpocznij od przygotowania 10 mililitrowych zawiesin komórek w PBS o stężeniu około 100 000 komórek na mililitr; w przypadku probówek z kulturami mieszanymi zawierającymi różne proporcje poszczególnych linii komórkowych, należy je przygotować zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Do każdej probówki dodaj dwa mililitry 5% BSA, aby zablokować komórki i zminimalizować niespecyficzne wiązanie. Następnie do każdej probówki dodaj jeden mililitr biofunkcjonalizowanych nanocząstek o stężeniu jeden miligram na mililitr i inkubuj mieszaninę przez jedną godzinę.

Następnie wypłucz komórki z niezwiązanych nanocząsteczek, wirując probówki przy 1000 ×g przez pięć minut i resuspendując osady w 1 ml PBS. Powtórz ten proces co najmniej dwukrotnie. Utrwal komórki, używając 10% formaldehydu w PBS, a następnie dodaj 10 µg/ml streptawidyny-phalloidyny i DAPI w PBS w celu zabarwienia komórek, inkubuj probówkę na lodzie przez 30 minut, a następnie wypłucz komórki za pomocą PBS.

Następnie wprowadź próbkę do cytometru przepływowego i przeanalizuj 10 000 komórek z bramki dla każdej próbki. Podobna procedura obrazowania komórek związanych z nanocząsteczkami fluorescencyjnymi przy użyciu konfokalnej mikroskopii laserowej została opisana w protokole tekstowym. Na początek doprowadź komórki w kolbach T 75 do około 80% konfluencji, a następnie wypłucz komórki z medium, używając pięciu mililitrów PBS.

Dodać 5 ml 1% BSA w PBS i blokować komórki przez jedną godzinę. Następnie do kolby dodać 5 ml nanocząstek powlekanych przeciwciałami w stężeniu 0,5 mg/ml i inkubować komórki przez jedną godzinę, aby umożliwić związanie nanocząstek. Następnie trzykrotnie przemyć komórki 5 ml PBS w celu usunięcia niezwiązanych nanocząstek.

Następnie należy dodać 2 mL 0,25% roztworu trypsyny z EDTA i inkubować komórki przez 5 minut, aby odlepić je od kolby. Dodać 8 mL DMEM, aby zneutralizować trypsynę, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówek do wirowania. Wirować z prędkością 1000 ×g przez 5 minut w celu wytrącenia komórek w formie osadu.

Następnie odessaj nadsącz i resuspenduj komórki w 1 ml PBS. Dodaj 1 ml 10% formaldehydu w PBS, aby utrwalić komórki, a następnie przenieś 100 µL każdej próbki do oddzielnych dołków płytki 96-dołkowej z płaskim dnem. Do każdego dołka dodaj 100 µL roztopionego 1% agarozy w wodzie dejonizowanej i wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół.

Pozostaw żel do stężenia w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza przez 12 godzin w celu uzyskania fantoma. Po zestaleniu żelu umieść fantom w poziomym klinicznym magnesie 3T obok litego bloku agaru 2% o wymiarach 150 centymetrów sześciennych. Następnie zabezpiecz fantom i blok agarowy w centrum ośmiokanałowej cewki HD do obrazowania mózgu. Aby zmierzyć czasy relaksacji, wykonaj koronalne przekroje o grubości 0,5 milimetra na wysokości połowy płytki 96-dołkowej. Do wyznaczenia średnicy hydrodynamicznej otrzymanych nanocząstek wykorzystano analizy dynamicznego rozpraszania światła. Badania stabilności potwierdziły długoterminową stabilność nanocząstek wykorzystywanych zarówno w eksperymentach w środowisku wodnym, jak i w pożywkach komórkowych.

Mikroskopia konfokalna wykazała, że nanocząstki fluorescencyjne naładowane przeciwciałami przeciwko EOT three wiązały się specyficznie z powierzchnią komórek EOL one. W przypadku użycia przeciwciał przeciwko NG two, wiązały się one specyficznie z powierzchnią neurosfer BSG. Biofunkcjonalizowane nanocząstki umożliwiły skuteczne fluorescencyjne znakowanie populacji docelowych komórek, co potwierdzono w pomiarach przeprowadzonych za pomocą cytometrii przepływowej.

Dodatkowo nanocząsteczki były w stanie skierować się do specyficznej subpopulacji komórek w mieszaninie, nawet przy niskim stosunku komórek docelowych do komórek kontrolnych. W końcu nanocząsteczki biofunkcjonalizowane zwiększyły kontrast MRI w komórkach docelowych – komórkach traktowanych nanocząsteczkami obciążonymi nng. Dwa przeciwciała wykazały hiperintensywność w sekwencjach T1-zależnych w porównaniu do komórek traktowanych cząsteczkami kontrolnymi.

W przeciwieństwie do nich, dwie nanopartykuły A NNG wykazały hipointensywność w sekwencjach T2 w porównaniu z cząsteczkami kontrolnymi. Synteza biofunkcjonalizowanych nanopartykuł błękitu pruskiego może zostać zakończona w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo.

Podobnie jak w tej procedurze, nanocząstki mogą zostać biofunkcjonalizowane różnymi biopolimerami i ligandami celującymi w celu badania nowych chorób i stanów klinicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać pełną wiedzę na temat syntezy nanocząstek błękitu pruskiego do zastosowań w fluorescencji i obrazowaniu w celu znakowania populacji komórek. Należy pamiętać o ścisłym przestrzeganiu wytycznych dotyczących bezpieczeństwa oraz standardowych procedur operacyjnych podczas przeprowadzania badań w klinicznym magnesie MRI.