Name: Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego do zastosowań w multimodalnym obrazowaniu molekularnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Poznaj syntezę biofunkcjonalizowanych nanocząstek błękitu pruskiego z jonami gadolinu lub manganu do obrazowania MRI i fluorescencyjnego. Ta metoda umożliwia wizualizację konkretnych populacji komórek w badaniach biomedycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Sheikh Zayed Institute for Pediatric Surgical Innovation (RAC Awards #30000174 i 30001489).

<ol><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li>
<li>Mankoff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Definition+of+Molecular+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">A Definition of Molecular Imaging.</a> J Nucl Med. 48 (6), 18N-21N (2007).</li>
<li>James, M. L., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+Imaging+Primer%3A+Modalities%2C+Imaging+Agents%2C+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev%22%5BJournal%5D)">A Molecular Imaging Primer: Modalities, Imaging Agents, and Applications.</a> Phys Rev. 92, 897-965 (2012).</li>
<li>Cao, W., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+Molecular+Imaging+of+Tumor+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis.</a> J Nucl Med. 49 (2), 113S-129S (2008).</li>
<li>Heinrich, J. L., Berseth, P. A., Long, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Prussian+Blue+analogues%3A+synthesis+and+structure+of+cubic+Cr4Co4%28CN%2912+and+Co8%28CN%2912+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular Prussian Blue analogues: synthesis and structure of cubic Cr4Co4(CN)12 and Co8(CN)12 clusters.</a> Chem Commun. 11, 1231-1232 (1998).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Molecular+Imaging+and+Contrast+Agent+Database+%28MICAD%29%22">Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD)</a>. , National Center for Biotechnology Information. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK5330">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK5330</a> (2004).</li>
<li>Zhu, D., Liu, F., Ma, L., Liu, D., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-Based+Systems+for+T1-Weighted+Magnetic+Resonance+Imaging+Contrast+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-Based Systems for T1-Weighted Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents.</a> Int J Mol Sci. 14 (5), 10607-1010 (2013).</li>
<li>Bartolini, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+the+toxicity+of+gadolinium+based+MRI+contrast+agents+using+neutron+activation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">An investigation of the toxicity of gadolinium based MRI contrast agents using neutron activation analysis.</a> Magn. Reson. Imaging. 21 (5), 541-544 (2003).</li>
<li>Adel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+validation+of+iron-oxide+and+gadolinium+based+MRI+contrast+agents+in+experimental+atherosclerosis%3A+The+do%27s+and+don%27t%27s%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Histological validation of iron-oxide and gadolinium based MRI contrast agents in experimental atherosclerosis: The do's and don't's.</a> Atherosclerosis. 225 (2), 274-280 (2012).</li>
<li>Dumont, M. F., Yadavilli, S., Sze, R. W., Nazarian, J., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-containing+Prussian+blue+nanoparticles+for+imaging+of+pediatric+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Manganese-containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors.</a> Int J Nanomedicine. 9, 2581-2595 (2014).</li>
<li>Dumont, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofunctionalized+gadolinium-containing+prussian+blue+nanoparticles+as+multimodal+molecular+imaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Biofunctionalized gadolinium-containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents.</a> Bioconjug Chem. 25 (1), 129-137 (2014).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrogenic+Systemic+Fibrosis+and+Class+Labeling+of+Gadolinium-based+Contrast+Agents+by+the+Food+and+Drug+Administration%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Nephrogenic Systemic Fibrosis and Class Labeling of Gadolinium-based Contrast Agents by the Food and Drug Administration.</a> Radiology. 265 (1), 248-253 (2012).</li>
<li>Information on Gadolinium-Based Contrast Agents. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPatientsandProviders/ucm142882.htm">http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPatientsandProviders/ucm142882.htm</a> (2013).</li>
<li>Mendonca-Dias, M. H., Gaggelli, E., Lauterbur, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+contrast+agents+in+nuclear+magnetic+resonance+medical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+in+Nuc+Med%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging.</a> Sem in Nuc Med. 13 (4), 364-376 (1983).</li>
<li>Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Dynamics+Study+of+Unbinding+of+the+Avidin-Biotin+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Molecular Dynamics Study of Unbinding of the Avidin-Biotin Complex.</a> Biophys. 72 (4), 1568-1581 (1997).</li>
<li>Chen, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advance+of+Molecular+Imaging+Technology+and+Targeted+Imaging+Agent+in+Imaging+and+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Advance of Molecular Imaging Technology and Targeted Imaging Agent in Imaging and Therapy.</a> Biomed Res Int. 2014, 1-12 (2014).</li>
<li>Weissleder, R., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+the+era+of+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging in the era of molecular oncology.</a> Nature. 452 (7187), 580-589 (2008).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Mattoussi, H., Mauro, J. M., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+multiple+color+imaging+of+live+cells+using+quantum+dot+bioconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotech%22%5BJournal%5D)">Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates.</a> Nature Biotech. 21 (1), 47-51 (2002).</li>
<li>Mangrum, W., Christianson, K., Duncan, S., Hoang, P., Song, A., Merkle, E. Duke Review of MRI Principles. 304, Mosby. Philadelphia, PA. 304(2012).</li>
<li>Shokouhimehr, M., Soehnlen, E. S., Hao, J., Griswold, M., Flask, C., Fan, X., Basilion, J. P., Basu, S., Huang, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+purpose+prussian+blue+nanoparticles+for+cellular+imaging+and+drug+delivery%3A+a+new+generation+of+T1-weighted+MRI+contrast+and+small+molecule+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual purpose prussian blue nanoparticles for cellular imaging and drug delivery: a new generation of T1-weighted MRI contrast and small molecule delivery agents.</a> J. Mater. Chem. 20, 5251-5259 (2010).</li>
<li>Hoffman, H. A., Chakrabarti, L., Dumont, M. F., Sandler, A. D., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prussian+blue+nanoparticles+for+laser-induced+photothermal+therapy+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Prussian blue nanoparticles for laser-induced photothermal therapy of tumors.</a> RSC Adv. 4 (56), 29729-29734 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule przedstawiono metody syntezy nowej klasy multimodalnych środków do obrazowania molekularnego opartych na biofunkcjonalizowanych nanocząstkach błękitu pruskiego. Metodami obrazowania molekularnego zawartymi w nanocząstkach są obrazowanie fluorescencyjne i molekularny rezonans magnetyczny, ze względu na ich uzupełniające się cechy. Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego mają konstrukcję typu rdzeń-powłoka. Kluczowymi etapami syntezy tych nanocząstek są: 1) synteza jednoetapowa, w wyniku której powsta...

Obrazowanie molekularne to nieinwazyjna i ukierunkowana wizualizacja procesów biologicznych na poziomie komórkowym, subkomórkowym i molekularnym1. Obrazowanie molekularne pozwala próbce pozostać w jej naturalnym mikrośrodowisku, podczas gdy jej endogenne szlaki i mechanizmy są oceniane w czasie rzeczywistym. Zazwyczaj obrazowanie molekularne polega na podaniu egzogennego środka obrazującego w postaci małej cząsteczki, makrocząsteczki lub nanocząstki w celu wizualizacji, ukierunkowania i śledzenia odpowiednich badanych procesów fizjologicznych2. Różne metody obrazowania, które zostały zbadane w obrazowaniu molekularnym, obejmują MRI, CT, PET, SPECT, ultradźwięki, fotoakustykę, spektroskopię Ramana, bioluminescencję, fluorescencję i mikroskopię przyżyciową3. Obrazowanie multimodalne to połączenie dwóch lub więcej modalności obrazowania, w którym połączenie zwiększa zdolność do wizualizacji i charakteryzowania różnych procesów i zdarzeń biologicznych4. Obrazowanie multimodalne wykorzystuje mocne strony poszczególnych technik obrazowania, kompensując jednocześnie ich indywidualne ograniczenia3.
Ten artykuł przedstawia protokół syntezy biofunkcjonalizowanych pruskich niebieskich nanocząstek (PB NPs) - nowej klasy multimodalnych, molekularnych środków obrazowania. Nanocząsteczki PB są wykorzystywane do obrazowania fluorescencyjnego i molekularnego rezonansu magnetycznego. PB jest pigmentem składającym się z naprzemiennych atomów żelaza (II) i żelaza (III) w sześciennej sieci skoncentrowanej na powierzchni (ryc. 1). Sieć PB składa się z liniowych ligandów cyjanku w wiązaniu FeII-CN-Fe III, które zawiera kationy w celu zrównoważenia ładunków w swojej trójwymiarowej sieci5. Zdolność PB do włączania kationów do swojej sieci jest wykorzystywana przez oddzielne ładowanie jonów gadolinu i manganu do NP PB w celu kontrastu MRI.
Uzasadnieniem dla projektu nanocząsteczek dla kontrastu MRI są korzyści, jakie ten projekt oferuje w stosunku do obecnych środków kontrastowych MRI. Zdecydowana większość zatwierdzonych przez amerykańską FDA środków kontrastowych MRI to chelaty gadolinu, które mają charakter paramagnetyczny i zapewniają dodatni kontrast dzięki mechanizmowi relaksacji sieci spinowej6,7,8. W porównaniu z pojedynczym chelatem gadolinu, który sam w sobie zapewnia niską intensywność sygnału, włączenie wielu jonów gadolinu do sieci PB nanocząstek zapewnia zwiększoną intensywność sygnału (dodatni kontrast)3,9. Co więcej, obecność wielu jonów gadolinu w sieci PB zwiększa ogólną gęstość spinu i wielkość paramagnetyzmu nanocząstek, co zaburza lokalne pole magnetyczne w ich pobliżu, generując w ten sposób ujemny kontrast przez mechanizm relaksacji spinowo-spinowej. W ten sposób nanocząstki zawierające gadolin działają zarówno jako środki kontrastowe T1 (dodatni), jak i T2 (ujemne)10,11.
W podgrupie pacjentów z zaburzeniami czynności nerek, podawanie środków kontrastowych na bazie gadolinu zostało powiązane z rozwojem nerkopochodnego zwłóknienia układowego8,12, 13. Obserwacja ta skłoniła do badań nad zastosowaniem alternatywnych jonów paramagnetycznych jako środków kontrastowych w rezonansie magnetycznym. W związku z tym wszechstronna konstrukcja nanocząstek jest przystosowana do włączania jonów manganu do sieci PB. Podobnie jak chelaty gadolinu, chelaty manganu są również paramagnetyczne i są zwykle używane do zapewnienia dodatniej intensywności sygnału w MRI7,14. Podobnie jak w przypadku NP PB zawierających gadolin, NP PB zawierające mangan działają również jako środki kontrastowe T1 (dodatni) i T2 (ujemny).
Aby włączyć możliwości obrazowania fluorescencyjnego, "rdzenie" nanocząsteczek są pokryte "biofunkcjonalną" powłoką składającą się z znakowanej fluorescencyjnie glikoproteiny awidyny (Rysunek 1). Awidyna nie tylko umożliwia obrazowanie fluorescencyjne, ale służy również jako platforma dokująca dla biotynylowanych ligandów, które celują w określone komórki i tkanki. Wiązanie awidyna–biotyna jest jednym z najsilniejszych znanych, niekowalencyjnych wiązań charakteryzujących się niezwykle silnym powinowactwem wiązania pomiędzy awidyną a biotyną15. Przyłączenie biotynylowanych ligandów do nanocząsteczek PB pokrytych awidyną nadaje nanocząsteczkom PB możliwości celowania molekularnego.
Motywacją do kontynuowania obrazowania fluorescencyjnego i MR za pomocą NP PB jest to, że te metody obrazowania posiadają cechy komplementarne. Obrazowanie fluorescencyjne jest jedną z najczęściej stosowanych technik optycznego obrazowania molekularnego i pozwala na jednoczesną wizualizację wielu obiektów przy wysokiej czułości1,16,17. Obrazowanie fluorescencyjne jest bezpieczną, nieinwazyjną metodą, ale wiąże się z niską głębokością penetracji i rozdzielczościami przestrzennymi1,3,16. Z drugiej strony, rezonans magnetyczny generuje wysoką rozdzielczość czasową i przestrzenną nieinwazyjnie i bez konieczności stosowania promieniowania jonizującego1,3,16. Jednak MRI cierpi na niską czułość. Dlatego obrazowanie fluorescencyjne i MRI zostały wybrane jako techniki obrazowania molekularnego ze względu na ich uzupełniające się cechy penetracji głębokości, czułości i rozdzielczości przestrzennej.
Ten artykuł przedstawia protokół syntezy i biofunkcjonalizacji NP PB, NP zawierających gadolin (GdPB) i NP PB zawierających mangan (MnPB)10,11. Opisano następujące metody: 1) pomiar wielkości, ładunku i stabilności czasowej nanocząstek, 2) ocena cytotoksyczności nanocząstek, 3) pomiar relaksacji MRI oraz 4) wykorzystanie nanocząstek do obrazowania fluorescencyjnego i molekularnego MR populacji docelowych komórek in vitro. Wyniki te wskazują na potencjał nanocząsteczek do stosowania jako multimodalne środki do obrazowania molekularnego in vivo.

<table><tbody><tr><td>Trójwodzian heksacyjanożelazianu (II) potasu (K4Fe(CN)6&middot; 3H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Czterowodny chlorek manganu (II) (MnCl2&middot; 4H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>sześciowodny azotan gadolinu (III) (Gd(NO3)3&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211591</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek żelaza (III) (FeCl3&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Anty-NG2 Siarczan chondroityny Proteoglikan Przeciwciało koniugatu biotyny</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowana anty-ludzka eotaksyna-3</td><td>Peprotech</td><td>500-P156GBT</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa Neuro-2a</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa BSG D10</td><td>Magazyn laboratoryjny</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>OE21 Linia komórkowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>96062201</td><td></td></tr><tr><td>SUDIPG1 Neurospheres</td><td>Lab stock</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>Eol-1 Cell Line</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94042252</td><td></td></tr><tr><td>Bromek poli(L-lizyny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1399</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Aminoaktynomycyna D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9400</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Kalceina czerwono-pomarańczowa, AM</td><td>Life Technologies</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>Avidin-Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21370</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Instech</td><td>P270</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>QSonica</td><td>Q125</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło z płytą grzejną/magnetyczną</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>Ultra czysta folia aluminiowa</td><td>VWR</td><td>89107-732</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mieszalnik</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe 1,7 ml</td><td>VWR</td><td>87003-295</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe stożkowe 15 ml</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty probówek</td><td>VWR</td><td>82024-342</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety jednorazowe z tworzywa sztucznego</td><td>VWR</td><td>7000-590 (/586)</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer kapilarny</td><td>VWR</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe, kolumna wirująca 0,2 mikrometra</td><td>VWR</td><td>82031-356</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa taca do hodowli komórkowych</td><td>VWR</td><td>29442-056</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA 0,25% roztwór 1x</td><td>JR Scientific</td><td>82702</td><td></td></tr><tr><td>Klasa hodowli komórkowej PBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania proliferacji komórek XTT</td><td>Trevigen</td><td>4891-025-K</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T75</td><td>89092-700</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle's Medium</td><td>Biowhitaker</td> firmy Dulbecco <td>12-604Q</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Life Technologies</td><td>10437-010</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep 1x</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview FV1200 Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe komorowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Okulary Micro Cover Glasses, kwadratowe, nr 1.5</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 T Kliniczny magnes MRI</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ml kolba</td><td></td><td></td><td></td> okrągłodenna</tr></tbody></table>

biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego do zastosowań w multimodalnym obrazowaniu molekularnym

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodalne, obrazowanie molekularne pozwala na wizualizację procesów biologicznych w rozdzielczościach komórkowych, subkomórkowych i molekularnych przy użyciu wielu, uzupełniających się technik obrazowania. Te środki do obrazowania ułatwiają ocenę szlaków i mechanizmów in vivo w czasie rzeczywistym, co zwiększa skuteczność zarówno diagnostyczną, jak i terapeutyczną. W artykule przedstawiono protokół syntezy biofunkcjonalizowanych nanocząstek błękitu pruskiego (PB NPs) - nowej klasy środków do zastosowania w multimodalnych, molekularnych aplikacjach obrazowania. Metody obrazowania zawarte w nanocząstkach, obrazowanie fluorescencyjne i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), mają cechy komplementarne. Nanocząsteczki PB mają konstrukcję rdzeń-powłoka, w której jony gadolinu i manganu włączone w przestrzenie śródmiąższowe sieci PB generują kontrast MRI, zarówno w sekwencjach zależnych T1, jak i T2. Nanocząsteczki PB są powlekane fluorescencyjną awidyną za pomocą elektrostatycznej samoorganizacji, która umożliwia obrazowanie fluorescencyjne. Nanocząstki pokryte awidyną są modyfikowane biotynylowanymi ligandami, które nadają nanocząstkom zdolność celowania molekularnego. Mierzona jest stabilność i toksyczność nanocząstek, a także ich relaksacyjność w MRI. Multimodalne, molekularne możliwości obrazowania tych biofunkcjonalizowanych nanocząsteczek PB są następnie demonstrowane poprzez wykorzystanie ich do obrazowania fluorescencyjnego i molekularnego rezonansu magnetycznego in vitro.

Wykorzystując schemat syntezy w jednym naczyniu (one-pot), można powtarzalnie syntetyzować monodyspersyjne (mierzone za pomocą DLS) nanocząsteczki PB NPs (średnica średnia 78,8 nm, indeks polidyspersyjności (PDI) = 0,230; obliczone przez instrument do dynamicznego rozpraszania światła), GdPB (średnica średnia 164,2 nm, PDI = 0,102) lub MnPB (średnica średnia 122,4 nm, PDI = 0,124) (Rycyna 2A). Zmierzone potencjały zeta zsyntetyzowanych nanocząsteczek wynoszą mniej niż -30 mV (Rycina 2B),...

Ten protokół opisuje syntezę biofunkcjonalizowanych pruskich niebieskich nanocząstek i ich zastosowanie jako multimodalnych, molekularnych środków obrazowania. Nanocząstki mają konstrukcję rdzeń-powłoka, w której jony gadolinu lub manganu w rdzeniu nanocząstki generują kontrast MRI. Otoczka biofunkcjonalna zawiera fluorofory do obrazowania fluorescencyjnego i ligandy celujące do celowania molekularnego.

Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego do zastosowań w multimodalnym obrazowaniu molekularnym

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest synteza biofunkcjonalizowanych nanocząsteczek błękitu pruskiego do zastosowania jako multimodalne środki obrazowania molekularnego. Jest to realizowane poprzez wstępną syntezę nanocząsteczek błękitu pruskiego zawierających jony gadolinu lub manganu, które wzmacniają sygnał MRI. Drugim krokiem jest przyczepienie fluorescencyjnej awidyny do powierzchni nanocząsteczek, co nadaje im zdolność do obrazowania fluorescencyjnego.Następnie nanocząstki powlekane awidonomi są biofunkcjonalizowane za pomocą wybranych biotynylowanych przeciwciał ukierunkowanych na konkretne komórki. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie kontroli jakości biofunkcjonalizowanych nanocząstek poprzez pomiar ich rozmiaru, potencjału zeta oraz stabilności czasowej. W końcowej fazie biofunkcjonalizowane nanocząstki są wykorzystywane w multimodalnym obrazowaniu molekularnym do wizualizacji specyficznej populacji docelowych komórek w mieszaninie przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego i MRI.Obecne komercyjne środki kontrastowe służą zazwyczaj do obrazowania w jednym trybie i oferują rozdzielczość jedynie na poziomie anatomicznym. Nanocząsteczki błękitu pruskiego łączą dwa komplementarne tryby obrazowania – MRI i fluorescencję – co umożliwia obrazowanie molekularne oraz na poziomach podkomórkowych. Zastosowania multimodalnych nanocząsteczek obejmują diagnostykę nowotworów i chorób zapalnych, a także monitorowanie odpowiedzi na ich leczenie.Dzieje się tak dlatego, że nanofunkcjonalizowane cząstki mogą celować i wiązać się z populacją komórek w określonym regionie organizmu. Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji w diagnostyce nowotworów i chorób zapalnych oraz w ocenie odpowiedzi na leczenie, może być ona również zastosowana w innych stanach patologicznych, które zyskają dzięki czułości i specyficzności obrazowania molekularnego. Wykorzystując fluorescencję i MRI, sformułowaliśmy koncepcję wytwarzania tych nanocząstek po ustaleniu, że błękit pruski — środek zatwierdzony przez FDA do spożycia doustnego przez ludzi — może być stabilnie syntetyzowany w ramach jednoetapowego schematu syntezy i skutecznie funkcjonalizowano biologicznie przy użyciu standardowych technik biokoniugacji.Na początek należy przygotować 5 mM roztwór heksacyanoferanu(II) potasu w 5 ml wody dejonizowanej, aby otrzymać roztwór A. Następnie należy przygotować roztwór B zawierający 2,5 mM chlorku żelaza(III) oraz 2,5 mM chlorku manganu(II) w 10 ml wody dejonizowanej do syntezy nanocząsteczek błękitu pruskiego manganu. Inne nanocząsteczki można syntezować zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieść roztwór B do kolby okrągłodennej i mieszać roztwór z prędkością 1000 obr./min w temperaturze pokojowej.Za pomocą pompy perystaltycznej dodać kroplami roztwór A do naczynia z prędkością 10 ml na godzinę. Po zakończeniu dodawania roztworu A mieszać mieszaninę przy 1000 RPM przez kolejne 30 minut. Następnie przenieść 1 ml aliquoty mieszaniny do probówek do mikrowirowania i dodać do każdej probówki 0,2 ml pięciu mili sodium chloride.Wirować probówki przy 20 000 ×g przez co najmniej 10 minut, a następnie ostrożnie usunąć nadsącz, pozostawiając osad z nanocząsteczek. Następnie do każdego osadu dodać jeden mililitr wody dejonizowanej. Za pomocą mikropipety zawiesić nanocząsteczki równomiernie w roztworze, stosując sonikację.Przemyć nanocząstki co najmniej trzy kolejne razy, aby usunąć z zawiesiny składniki początkowej reakcji po ostatnim wirowaniu, resuspender nanocząstki w jednym mililitrze wody dejonizowanej po pokryciu nanocząstek fluorescencyjnym barwnikiem zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie wyjąć z lodówki zapasy biotynilowanych przeciwciał. Należy użyć przeciwciała przeciwko antygenowi neuronalno-glejowemu 2 oraz przeciwciała przeciwko ludzkiej eotaksynie 3. Przenieść biotynilowane przeciwciało do nylonowego filtra do mikrowirówki 0,2 µm, a następnie wirować probówkę z prędkością 14 000 ×g przez 10 minut.Następnie należy dodać mniej niż lub równo 0,05 mg przeciwciała na każdy miligram nanocząsteczek powlekanych Aden i zabezpieczyć probówki folią aluminiową przed światłem. Inkubować probówki przy łagodnym wstrząsaniu przez dwie do czterech godzin w temperaturze 4 °C. Po przyłączeniu przeciwciał dodać 10 µL próbki nanocząsteczek o stężeniu 1 mg/mL do 990 µL wody dejonizowanej w jednorazowej plastikowej probówce, zamknąć probówkę i wymieszać w wortexie.Następnie wyznacz średnią wielkość nanocząstek za pomocą systemu dynamicznego rozpraszania światła pod kątem pomiaru 173 stopnie. Rozpocznij od przygotowania 10 mililitrowych zawiesin komórek w PBS o stężeniu około 100 000 komórek na mililitr; w przypadku probówek z kulturami mieszanymi zawierającymi różne proporcje poszczególnych linii komórkowych, należy je przygotować zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Do każdej probówki dodaj dwa mililitry 5% BSA, aby zablokować komórki i zminimalizować niespecyficzne wiązanie. Następnie do każdej probówki dodaj jeden mililitr biofunkcjonalizowanych nanocząstek o stężeniu jeden miligram na mililitr i inkubuj mieszaninę przez jedną godzinę.Następnie wypłucz komórki z niezwiązanych nanocząsteczek, wirując probówki przy 1000 ×g przez pięć minut i resuspendując osady w 1 ml PBS. Powtórz ten proces co najmniej dwukrotnie. Utrwal komórki, używając 10% formaldehydu w PBS, a następnie dodaj 10 µg/ml streptawidyny-phalloidyny i DAPI w PBS w celu zabarwienia komórek, inkubuj probówkę na lodzie przez 30 minut, a następnie wypłucz komórki za pomocą PBS.Następnie wprowadź próbkę do cytometru przepływowego i przeanalizuj 10 000 komórek z bramki dla każdej próbki. Podobna procedura obrazowania komórek związanych z nanocząsteczkami fluorescencyjnymi przy użyciu konfokalnej mikroskopii laserowej została opisana w protokole tekstowym. Na początek doprowadź komórki w kolbach T 75 do około 80% konfluencji, a następnie wypłucz komórki z medium, używając pięciu mililitrów PBS.Dodać 5 ml 1% BSA w PBS i blokować komórki przez jedną godzinę. Następnie do kolby dodać 5 ml nanocząstek powlekanych przeciwciałami w stężeniu 0,5 mg/ml i inkubować komórki przez jedną godzinę, aby umożliwić związanie nanocząstek. Następnie trzykrotnie przemyć komórki 5 ml PBS w celu usunięcia niezwiązanych nanocząstek.Następnie należy dodać 2 mL 0,25% roztworu trypsyny z EDTA i inkubować komórki przez 5 minut, aby odlepić je od kolby. Dodać 8 mL DMEM, aby zneutralizować trypsynę, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówek do wirowania. Wirować z prędkością 1000 ×g przez 5 minut w celu wytrącenia komórek w formie osadu.Następnie odessaj nadsącz i resuspenduj komórki w 1 ml PBS. Dodaj 1 ml 10% formaldehydu w PBS, aby utrwalić komórki, a następnie przenieś 100 µL każdej próbki do oddzielnych dołków płytki 96-dołkowej z płaskim dnem. Do każdego dołka dodaj 100 µL roztopionego 1% agarozy w wodzie dejonizowanej i wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół.Pozostaw żel do stężenia w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza przez 12 godzin w celu uzyskania fantoma. Po zestaleniu żelu umieść fantom w poziomym klinicznym magnesie 3T obok litego bloku agaru 2% o wymiarach 150 centymetrów sześciennych. Następnie zabezpiecz fantom i blok agarowy w centrum ośmiokanałowej cewki HD do obrazowania mózgu. Aby zmierzyć czasy relaksacji, wykonaj koronalne przekroje o grubości 0,5 milimetra na wysokości połowy płytki 96-dołkowej. Do wyznaczenia średnicy hydrodynamicznej otrzymanych nanocząstek wykorzystano analizy dynamicznego rozpraszania światła. Badania stabilności potwierdziły długoterminową stabilność nanocząstek wykorzystywanych zarówno w eksperymentach w środowisku wodnym, jak i w pożywkach komórkowych.Mikroskopia konfokalna wykazała, że nanocząstki fluorescencyjne naładowane przeciwciałami przeciwko EOT three wiązały się specyficznie z powierzchnią komórek EOL one. W przypadku użycia przeciwciał przeciwko NG two, wiązały się one specyficznie z powierzchnią neurosfer BSG. Biofunkcjonalizowane nanocząstki umożliwiły skuteczne fluorescencyjne znakowanie populacji docelowych komórek, co potwierdzono w pomiarach przeprowadzonych za pomocą cytometrii przepływowej.Dodatkowo nanocząsteczki były w stanie skierować się do specyficznej subpopulacji komórek w mieszaninie, nawet przy niskim stosunku komórek docelowych do komórek kontrolnych. W końcu nanocząsteczki biofunkcjonalizowane zwiększyły kontrast MRI w komórkach docelowych – komórkach traktowanych nanocząsteczkami obciążonymi nng. Dwa przeciwciała wykazały hiperintensywność w sekwencjach T1-zależnych w porównaniu do komórek traktowanych cząsteczkami kontrolnymi.W przeciwieństwie do nich, dwie nanopartykuły A NNG wykazały hipointensywność w sekwencjach T2 w porównaniu z cząsteczkami kontrolnymi. Synteza biofunkcjonalizowanych nanopartykuł błękitu pruskiego może zostać zakończona w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo.Podobnie jak w tej procedurze, nanocząstki mogą zostać biofunkcjonalizowane różnymi biopolimerami i ligandami celującymi w celu badania nowych chorób i stanów klinicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać pełną wiedzę na temat syntezy nanocząstek błękitu pruskiego do zastosowań w fluorescencji i obrazowaniu w celu znakowania populacji komórek. Należy pamiętać o ścisłym przestrzeganiu wytycznych dotyczących bezpieczeństwa oraz standardowych procedur operacyjnych podczas przeprowadzania badań w klinicznym magnesie MRI.

biofunctionalized-prussian-blue-nanoparticles-for-multimodal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Biofunkcjonalizowane nanocząstki pruskiego błękitu do zastosowań w multimodalnym obrazowaniu molekularnym

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Tutaj opisujemy protokół syntezy magneto-plazmonicznych nanocząstek o silnym momencie magnetycznym i silnej absorbancji bliskiej podczerwieni (NIR). Protokół obejmuje również koniugację przeciwciał z nanocząstkami za pomocą ugrupowania Fc do różnych zastosowań biomedycznych, które wymagają specyficznego celowania molekularnego.

Synteza immunoukierunkowanych magnetoplazmonicznych nanoklastrów

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskania 68Ga domieszkowanych rdzeniem nanocząstek tlenku żelaza poprzez szybką syntezę mikrofalową. Metodologia ta pozwala uzyskać nanocząstki PET/(T1)MRI o skuteczności znakowania radioaktywnego wyższej niż 90% i czystości radiochemicznej 99% w 20-minutowej syntezie.

Synteza nanocząstek tlenku żelaza domieszkowanego rdzeniem 68Ga do podwójnej pozytonowej tomografii emisyjnej /(T1)Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego

W tej pracy dostarczamy protokół do biofunkcjonalizacji magnetycznych nanomateriałów z przeciwciałami do określonego celowania w komórki. Na przykład wykorzystujemy nanodruty żelaza do celowania w komórki rakowe.

Biofunkcjonalizacja nanomateriałów magnetycznych

Ten artykuł przedstawia integrację modułu spektralnego ogniskowania i lasera impulsowego o podwójnym wyjściu, umożliwiającego szybkie obrazowanie hiperspektralne nanocząsteczek złota i komórek rakowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów multimodalnych nieliniowych technik optycznych na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym.

Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej

Obecny protokół opisuje szczegółową operację obrazowania fluorescencyjnego NIR-II w czasie rzeczywistym myszy za pomocą urządzenia do obrazowania optycznego NIR-II.

Jasna sonda fluorescencyjna NIR-II do obrazowania naczyń krwionośnych i nowotworów

Przedstawiono protokół syntezy trwałych nanomateriałów luminescencyjnych (PLNP) i ich potencjalnych zastosowań w wyświetlaczach wielokrotnego zapisu i przetwarzaniu artystycznym wykorzystującym efekt poświaty pod wpływem promieniowania ultrafioletowego (365 nm).

Synteza trwałych nanocząstek luminescencyjnych do wyświetlaczy wielokrotnego zapisu i zastosowań oświetleniowych

Bariera krew-mózg jest znaczącą przeszkodą w dostarczaniu terapii glejaka, choroby, na którą nie ma lekarstwa. W tym miejscu przedstawiamy sterowaną obrazem in vivo terapeutyczną platformę nano tlenku żelaza, która może ominąć tę fizjologiczną barierę ze względu na rozmiar i gromadzić się w guzie.

Dostarczanie nanocząstek ładunku oligonukleotydowego w modelu zwierzęcym glejaka wielopostaciowego

Tutaj opisujemy protokół przygotowania nanokulek kropek kwantowych (QDNB) i wykrywania biomarkerów choroby za pomocą pasków do testów immunologicznych opartych na przepływie bocznym opartych na QDNB. Wyniki testu można ocenić jakościowo przy oświetleniu światłem UV i zmierzyć ilościowo za pomocą fluorescencyjnego czytnika pasków w ciągu 15 minut.

Fluorescencyjny test immunologiczny przepływu bocznego oparty na nanokulkach kropek kwantowych

Poznaj syntezę biofunkcjonalizowanych nanocząstek błękitu pruskiego z jonami gadolinu lub manganu do obrazowania MRI i fluorescencyjnego. Ta metoda umożliwia wizualizację konkretnych populacji komórek w badaniach biomedycznych.

Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego do zastosowań w multimodalnym obrazowaniu molekularnym

Przeglądaj więcej filmów