Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego do zastosowań w multimodalnym obrazowaniu molekularnym

Ogólnym celem tej procedury jest synteza biofunkcjonalizowanych pruskich niebieskich nanocząstek do zastosowania multimodalnych środków do obrazowania molekularnego. Osiąga się to poprzez syntezę najpierw nanocząstek błękitu pruskiego, które zawierają jony gadolinu lub manganu, które wzmacniają sygnał MRI. Drugim krokiem jest przymocowanie fluorescencyjnego awadonu do powierzchni nanocząstek, co daje możliwość obrazowania fluorescencyjnego.

Następnie nanocząstki pokryte awadonem są biofunkcjonalizowane za pomocą pożądanej komórki ukierunkowanej na biotynylowane przeciwciała. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie kontroli jakości biofunkcjonalizowanych nanocząstek poprzez pomiar ich wielkości, potencjału zeta i stabilności czasowej. Ostatecznie biofunkcjonalizowane nanocząstki są wykorzystywane w multimodalnych zastosowaniach obrazowania molekularnego do wizualizacji określonej docelowej populacji komórek w mieszaninie za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i rezonansu magnetycznego.

Obecne komercyjne środki do obrazowania są zazwyczaj jednomodowe i oferują rozdzielczość tylko na poziomie anatomicznym. Nanocząstki błękitu pruskiego łączą w sobie dwa uzupełniające się tryby obrazowania, rezonans magnetyczny i fluorescencję, oraz umożliwiają obrazowanie molekularne i subkomórkowe. Zastosowania multimodalnych nanocząstek obejmują diagnostykę nowotworów i chorób zapalnych, a także monitorowanie ich odpowiedzi na leczenie.

Dzieje się tak, ponieważ biofunkcjonalizowane nanocząstki mogą celować i wiązać się z populacją komórek w określonym regionie ciała. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w diagnostykę raka i choroby zapalnej oraz odpowiedź na leczenie, może być również stosowana do innych stanów patologicznych, które skorzystają na czułości i swoistości obrazowania molekularnego. Korzystając z fluorescencji i rezonansu magnetycznego, po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł produkcji tych nanocząstek, gdy ustaliliśmy, że błękit pruski i zatwierdzony przez FDA środek do spożycia doustnego u ludzi może być stabilnie syntetyzowany przy użyciu jednoczęściowego schematu syntezy i solidnie biofunkcjonalizowany przy użyciu standardowych technik biokoniugatu.

Na początek przygotuj 5 milionów molowych roztworów heksa sano potasu żelazianu dwa na pięć mililitrów dejonizowanej wody, aby przygotować roztwór A następny roztwór naprawczy B zawierający 2,5 milimolowego żelaza, trzy chlorki i 2,5 milimolowego manganu. Dwa chlorki w 10 mililitrach wody dejonizowanej do syntezy nanocząstek błękitu pruskiego manganu. Inne nanocząstki można zsyntetyzować, jak wskazano w protokole tekstowym, roztwór transferowy B do kolby okrągłodennej A i mieszać roztwór z prędkością 1000 obr./min w temperaturze pokojowej.

Za pomocą pompy perystaltycznej dodaj roztwór, kroplami do naczynia w ilości 10 mililitrów na godzinę. Po zakończeniu dodawania roztworu A mieszaj mieszaninę z prędkością 1000 obr./min przez dodatkowe 30 minut. Następnie przenieś jedną mililitrową porcję mieszaniny do mikroprobówek wirówkowych i dodaj 0,2 mililitra pięciu milimili chlorku sodu do każdej probówki.

Odwirować probówki w temperaturze 20 000 razy G przez co najmniej 10 minut, a następnie ostrożnie usunąć supinat, pozostawiając osad nanocząstek. Następnie dodaj jeden mililitr wody dejonizowanej do każdej granulki. Użyj mikrokońcówki, aby równomiernie zawiesić nanocząstki w roztworze za pomocą sonikacji.

Umyj nanocząstki jeszcze co najmniej trzy razy, aby usunąć składniki początkowej reakcji z zawiesiny po ostatnim wirowaniu, ponownie zawiesić nanocząstki w jednym mililitrze wody dejonizowanej po pokryciu nanocząstek fluorescencyjnym denem, jak opisano w protokole tekstowym, usunąć biotynylowane przeciwciała z lodówki. Tu. Użyj antyneuronalnego antygenu glejowego dwa i anty-ludzkiej eotaksyny trzy. Przenieś biotynylowane przeciwciało do 0,2 mikronylonowego filtra mikrofuge, a następnie odwiruj probówkę pod ciśnieniem 14 000 razy G przez 10 minut.

Następnie dodaj mniej niż lub równe 0,05 miligrama przeciwciała na miligram nanocząstek pokrytych Aden i przykryj probówki folią aluminiową, aby chronić je przed światłem. Inkubuj probówki, delikatnie potrząsając przez dwie do czterech godzin w czterech stopniach Celsjusza. Po przyłączeniu przeciwciał dodaj 10 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr próbki nanocząstek do 990 mikrolitrów wody dejonizowanej w jednorazowej plastikowej nasadce vete vete i V, aby wymieszać.

Następnie określ średnią wielkość nanocząstek za pomocą systemu dynamicznego rozpraszania światła o kącie pomiaru 173 stopnie. Zacznij od przygotowania 10 mililitrowych zawiesin komórek w PBS o stężeniu około 100 000 komórek na mililitr dla mieszanych kultur, probówki zawierające różne proporcje każdej linii komórkowej należy przygotować zgodnie z opisem w protokole tekstowym w dwóch mililitrach 5% BS, A do każdej probówki, aby zablokować komórki i zminimalizować niespecyficzne wiązanie. Następnie dodaj jeden mililitr jednego miligrama na mililitr, biofunkcjonalizuj nanocząstki do każdej probówki i inkubuj mieszaninę przez godzinę.

Następnie wypłucz komórki z niezwiązanych nanocząstek, obracając probówki z prędkością 1000 razy G przez pięć minut i ponownie zginając granulki w jednym mililitrze PBS. Powtórz ten proces jeszcze co najmniej dwa razy. Napraw komórki za pomocą 10% formaldehydu w PBS, a następnie dodaj 10 mikrogramów na mililitr, siedem aminoaktyny i mycynę D w PBS, aby wybarwić komórki, inkubuj probówkę na lodzie przez 30 minut, a następnie przepłucz komórki PBS.

Następnie załaduj próbkę do cytometru przepływowego i przeanalizuj 10 000 bramkowanych komórek z każdej próbki. Podobna procedura obrazowania komórek związanych z fluorescencyjnymi nanocząstkami za pomocą laserowej mikroskopii konfokalnej jest opisana w protokole tekstowym. Na początek noś komórki w kolbach T 75 do około 80% konfluencji, a następnie przepłucz komórki z pożywki pięcioma mililitrami PBS.

Dodaj pięć mililitrów 1% BSA do PBS i zablokuj komórki na jedną godzinę. Następnie dodaj pięć mililitrów nanocząstek pokrytych przeciwciałem po 0,5 miligrama na mililitr do kolby i inkubuj komórki przez godzinę, aby umożliwić związanie nanocząstek. Następnie przepłucz komórki trzykrotnie pięcioma mililitrami PBS, aby usunąć niezwiązane nanocząstki.

Następnie dodać dwa mililitry 0,25% roztworu EDTA i inkubować komórki przez pięć minut, aby odłączyć komórki od kolby. Dodaj osiem mililitrów DMEM, aby ugasić próbę, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówek wirówkowych. Wiruj je 1000 razy G przez pięć minut, aby wypelnić komórki.

Następnie odessać supinat i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze PBS. Dodaj jeden mililitr 10% formaldehydu do PBS, aby utrwalić komórki, a następnie przenieś 100 mikrolitrów każdej próbki do oddzielnych studzienek 96-dołkowej płaskiej płytki dennej. Dodaj 100 mikrolitrów stopionego 1% aros w dejonizowanej wodzie do każdej studzienki i wymieszaj, pipetując w górę iw dół.

Pozwól żelowi zastygnąć w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 godzin, aby uzyskać fantom. Po zestaleniu się żelu umieść fantom w poziomym magnesie klinicznym o rozmiarze trzech T obok solidnego 150-centymetrowego bloku sześciennego z 2% agarem. Następnie zabezpiecz fantom i blok agaru w środku ośmiokanałowej cewki mózgowej HD, aby zmierzyć czasy relaksacji, użyj plastrów koronalnych o grubości 0,5 milimetra pobranych w połowie wysokości 96-dołkowej płytki, zastosowano testy dynamicznego rozpraszania światła w celu określenia średnicy hydrodynamicznej generowanych nanocząstek, stabilność Badania potwierdziły, że długoterminowa stabilność nanocząstek jest stosowana zarówno w eksperymentach na bazie wody, jak i na pożywkach komórkowych.

Laserowa mikroskopia konfokalna wykazała fluorescencyjne nanocząstki załadowane przeciwciałami przeciwko EOT trzy, które znaleziono specyficznie na powierzchni komórek EOL one. Kiedy stosuje się przeciwciała dla NG dwa, specyficznie wiążą się one z powierzchnią neurosfer BSG. Biofunkcjonalizowane nanocząstki były w stanie z powodzeniem znakować fluorescencyjnie populację docelowych komórek mierzoną za pomocą cytometrii przepływowej.

Ponadto nanocząstki były w stanie celować w określoną subpopulację komórek w mieszaninie nawet przy niskich proporcjach komórek docelowych do komórek kontrolnych. Wreszcie, biofunkcjonalizowane nanocząstki zwiększyły kontrast MRI komórek docelowych, komórek potraktowanych nanocząstkami załadowanymi nng. Dwa przeciwciała wykazały hiperintensywność w sekwencjach ważonych T jeden w porównaniu z komórkami traktowanymi cząstkami kontrolnymi.

W przeciwieństwie do tego, dwie nanocząstki A NNG nadawały hipointensywność w T dwie ważone sekwencje w porównaniu z cząstkami kontrolnymi. Kiedyś mistrzowie. Synteza biofunkcjonalizowanych niebieskich nanocząstek presjonalnych może zostać zakończona w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo.

Podobnie jak w tej procedurze, nanocząstki mogą być biofunkcjonalizowane za pomocą różnych biopolimerów i ligandów celujących w celu zbadania nowych chorób i nowych warunków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak syntetyzować nanocząstki błękitu pruskiego do zastosowań fluorescencyjnych i obrazowania w celu znakowania populacji komórek. Nie zapomnij o rygorystycznym przestrzeganiu wytycznych bezpieczeństwa i standardowych procedur operacyjnych dotyczących przeprowadzania badań na klinicznym magnesie MRI.