Kwantyfikacja oparta na nanocząstkach sprzężonych z przeciwciałami przy użyciu mikroskopii ciemnego pola: procedura wychwytywania i ilościowego oznaczania określonych egzosomów z płynów ustrojowych

Egzosomy to małe, zamknięte w błonie struktury, które są wydzielane przez komórki do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Egzosomy są obficie obecne w biopłynach.

Aby zidentyfikować i wychwycić określone egzosomy z płynów ustrojowych, zacznij od wykonania wielodołkowego testu immunologicznego. Ten szkiełko jest funkcjonalizowany białkami, które działają jak antygeny i wiążą się ze specyficznymi przeciwciałami.

Uzupełnić szkiełko pożądanym roztworem przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować. Przeciwciała te wiążą się z wstępnie pokrytymi antygenami na powierzchni szkiełka.

Odessać pozostały roztwór, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała. Teraz dodaj bufor blokujący, który blokuje wolne antygeny, zapobiegając w ten sposób niespecyficznemu wiązaniu egzosomów.

Następnie usuń bufor blokujący, załaduj egzosomy zawierające zawiesinę surowicy na szkiełko i inkubuj. Pozwala to na wyłączne wiązanie egzosomów specyficznych dla celu z wychwyconymi przeciwciałami pierwotnymi.

Następnie załaduj zawiesinę przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z nanocząstkami złota na powierzchnię szkiełka. Przeciwciała te przyłączają się do wstępnie związanych egzosomów i tworzą kompleks wykrywający.

Na koniec, za pomocą pipety, odrzuć wszelkie niezwiązane przeciwciała drugorzędowe. Wizualizuj szkiełka pod mikroskopem ciemnego pola. Nanocząstki złota obecne na powierzchni egzosomów rozpraszają światło i pojawiają się jako jasne plamy na ciemnym tle.

Aby rozpocząć przygotowanie szkiełka, rozcieńczyć pożądane przeciwciała wychwytujące egzosomy do 0,025 miligrama na mililitr w PBS. Odpipetować 1 mikrolitr roztworu do każdego dołka szkiełka podstawowego poddanego działaniu białka A/G, pokrytego szkłem optycznym. Następnie przenieś szkiełko do pudełka nawilżającego, aby upewnić się, że studzienki nie wyschną podczas inkubacji.

Inkubować szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1 godzinę, aby unieruchomić przeciwciała wychwytujące. Następnie odessać pozostały roztwór, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Umyj studzienki, dodając i trzykrotnie zasysając 1 mikrolitr PBS. Następnie szybko załaduj każdą studzienkę 1 mikrolitrem bufora blokującego na bazie PBS i inkubuj szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2 godziny.

W przypadku około 15 próbek musimy użyć pipety jednokanałowej, aby załadować bufor roboczy do 120 dołków w czasie krótszym niż 5 minut, aby uniknąć odparowania środka blokującego.

Rozpocznij przygotowywanie roztworu złotych nanoprętów sprzężonych z przeciwciałami podczas blokowania szkiełka. Na około 30 minut przed zakończeniem blokowania szybko rozmrozić próbki osocza lub surowicy w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Rozmrożone próbki należy mieszać wirowo przez 30 sekund, aby upewnić się, że zawiesiny są jednorodne. Następnie odwirować próbki o masie 500 x g przez 15 minut, aby wytrącić agregaty białkowe i inne zanieczyszczenia.

Przenieść 10 mikrolitrowych porcji supernatantów do świeżych probówek i rozcieńczyć jeden do jednego PBS. Rozcieńczone próbki należy wymieszać przez delikatne wirowanie lub odwrócenie, w zależności od przypadku. Po zakończeniu blokowania szkiełka należy zassać bufor blokujący i trzykrotnie przemyć studzienki porcjami PBS o pojemności 1 mikrolitra. Natychmiast załaduj próbki do studzienek po 1 mikrolitrze na studzienkę i 8 powtórzeniach na próbkę.

W ten sam sposób załaduj wzorce egzosomów do odpowiednich studzienek. Inkubuj szkiełko przez 12 do 18 godzin w lodówce w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie odessać studzienki i umyć każdą studzienkę raz 1 mikrolitrem PBS. Załaduj 1 mikrolitr zawiesiny złotych nanoprętów sprzężonej z przeciwciałami do każdej studzienki i inkubuj szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2 godziny.

Następnie odessać zawiesinę nanoprętów i umyć szkiełko w PBS uzupełnionym 0,01% Polysorbate-20 przez 10 minut za pomocą mieszalnika. Następnie zassać studzienki i umyć szkiełko w wodzie dejonizowanej przez 10 minut na obrotowym mikserze. Usuń wodę i pozostaw szkiełko do wyschnięcia na czystej szalce Petriego przed umieszczeniem szkiełka pod mikroskopem ciemnego pola.