Name: Wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego określenia egzosomów pochodzących z guza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metodę nPES do szybkiej analizy biomarkerów egzosomów bez konieczności ich izolacji. Technika ta umożliwia ilościowe określenie egzosomów z małych próbek klinicznych, co znajduje zastosowanie w diagnostyce nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była głównie wspierana przez fundusze na badania zapewnione przez NIH (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 i R21Al126361-01), nagrodę dla młodego badacza Arizona Biomedical Research Commission (ABRC).

1. Przygotowanie sond nanocząstek
UWAGA: Ten test wykorzystuje funkcjonalizowane nanopręty złota (AuNRs; średnica 25 nm x długość 71 nm), które są kowalencyjnie sprzężone z polimerami neutrawidyny (AV) i mają powierzchniowy pik rezonansu plazmonowego, który wytwarza czerwony (pik 641 nm) sygnał rozpraszający po oświetleniu DFM.
<ol>
	<li>Przepłukać 40 μl AuNR-AV (2,56 x 1011 cząstek) trzykrotnie 200 μl PBS (pH 7,0) przez odwirowanie i aspirację (8 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut), a następnie końcowy etap wirowania i aspiracji, po którym osad AuNR-AV zawiesza się w 40 μl PBS.</li>
	<li>Zmieszać tę zawiesinę AuNR-AV z 10 μl biotynylowanego przeciwciała (0,5 mg/ml) specyficznego dla antygenu na powierzchni podtypu egzosomu będącego przedmiotem zainteresowania i 150 μl PBS, a następnie mieszać w temperaturze 4 °C przez 2 godziny za pomocą mieszalnika, aby umożliwić zakończenie wiązania neutrawityny-biotyny.</li>
	<li>Otrzymane sprzężone z przeciwciałami AuNR (AuNR-IgG) przemyć trzykrotnie przez odwirowanie i aspirację (6 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut), a następnie zawiesić je w 200 μl PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. 
	UWAGA: Należy stosować sterylną technikę i krótkie czasy przechowywania, aby uniknąć zanieczyszczenia i degradacji AuNR-IgG. Najlepiej jest stosować AuNR sprzężone z przeciwciałami w ciągu 24 godzin od ich koniugacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie slajdów do przechwytywania EV
<ol>
	<li>Rozcieńczyć wybrane przeciwciała wychwytujące egzosomy do 0,025 mg/ml w PBS i dodać 1 μl/studzienkę tego rozcieńczenia na wielodołkowym szkiełku białkowym A/G, a następnie inkubować to szkiełko w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w wilgotnej komorze, aby umożliwić wiązanie przeciwciała wychwytującego z białkiem A/G unieruchomionym na szkiełku.</li>
	<li>Odessać studzienki w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał i przemyć studzienki trzykrotnie przez dodanie i aspirację 1 μl/basenik PBS, następnie załadować każdą studzienkę 1 μl buforu blokującego (patrz tabela materiałów) i inkubować szkiełko przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze w celu zablokowania wszelkich pozostałych miejsc wiązania białek.</li>
	<li>Odessać studzienki w celu usunięcia buforu blokującego, umyć studzienki trzykrotnie przez dodanie i aspirację 1 μl / studzienkę PBS i natychmiast użyć zablokowanych szkiełek do wychwytywania i analizy egzosomów.</li>
</ol>
3. Przygotowanie krzywej standardowej
<ol>
	<li>Aby dokładnie określić ilościowo bezwzględną lub względną obfitość określonego podtypu egzosomu, użytkownik musi wygenerować standardową krzywą z czystą populacją egzosomów, która jednolicie wyraża interesujący nas biomarker powierzchni egzosomu. W tym badaniu przeanalizowano obfitość egzosomów wyrażających białko błonowe związane z przerzutami, receptor Efryny A2, który ma zgłoszony związek ze stopniem zaawansowania raka trzustki i rokowaniem6,18. 
	UWAGA: Ludzka linia komórkowa raka trzustki PANC-1 i jej egzosomy są znane z ekspresji tego białka, a wyizolowane egzosomy z tej linii komórkowej wykorzystano do wygenerowania krzywej standardowej w celu ilościowego określenia liczby egzosomów, które wyrażają to białko w złożonych próbkach egzosomów.</li>
	<li>Hodować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w pożywkach hodowlanych bez surowicy, aby umożliwić akumulację egzosomów w pożywce, a następnie wyizolować supernatanty do hodowli komórkowych przez odwirowanie kultur zawiesinowych lub bezpośrednią aspirację pożywek hodowlanych z przylegających kultur komórkowych.</li>
	<li>Odwirować zebrane podłoże o sile 2000 x g przez 30 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń i odzyskania supernatantu.</li>
	<li>Przefiltrować sklarowany supernatant kultury przez jednostkę filtrującą o niskiej zawartości wiązań białkowych o odpowiedniej pojemności 0,45 μm (np. jednostkę filtracji próżniowej z polieterosulfonu o pojemności 250 ml).</li>
	<li>Zagęścić otrzymany filtrat przez odwirowanie przy 3200 x g przy użyciu systemu filtrów granicznych o nominalnej masie cząsteczkowej 100 000 do końcowej objętości 250 μl. Zbierz zatrzymaną objętość z tego filtra, a następnie umyj filtr 200 μl PBS i połącz tę objętość płukania z objętością zebranej próbki egzosomu.</li>
	<li>Odwirować tę próbkę przy masie 21 000 x g przez 45 minut i ostrożnie odzyskać supernatant, uważając, aby nie zebrać żadnego wytrąconego materiału.</li>
	<li>Odwirować odzyskany supernatant o stężeniu 100 000 x g przez 3 godziny, aby wytrącić egzosomy. Odessać supernatant i zebrać osad egzosomu w 100 μl PBS.</li>
	<li>Powstałe zawiesiny egzosomów należy przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli zostaną użyte w ciągu 24 godzin, lub w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania. 
	UWAGA: Nie poddawaj próbek egzosomów powtarzaniu cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Określić ilościowo podwielokrotność zawiesiny egzosomu po zmieszaniu przez bezpośredni pomiar liczby egzosomów (np. przez analizę śledzenia nanocząstek lub przestrajalne wykrywanie impulsów rezystancyjnych lub przez pomiar stężenia białka w lizatach egzosomów za pomocą testu kwasu mikro-bicynkowego lub równoważnej metody, jako sposób na przybliżenie ilości egzosomu)16,19.</li>
	<li>Wygeneruj zestaw seryjnych rozcieńczeń zawiesiny egzosomu, aby umożliwić porównanie sygnału nanocząstek z liczbą wejściową egzosomu lub zawartością białka.</li>
	<li>Przenieść 1 μl każdego wzorca egzosomu do każdej z jego kontrprób na płytce testowej. 
	UWAGA: Krzywe standardowe można wykorzystać do obliczenia nachylenia linii korelacji między sygnałem nanocząstek a stężeniem egzosomów w celu (1) oceny wydajności testu i (2) określenia względnego stężenia docelowych egzosomów w próbkach eksperymentalnych.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie próbek ludzkiego osocza lub surowicy
<ol>
	<li>Pobrać próbki osocza lub surowicy standardowymi metodami i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne do analizy egzosomów. Szybko rozmrozić próbki w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Rozmrożone próbki należy kilkakrotnie mieszać metodą inwersji, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. 
	UWAGA: Wyniki próbek surowicy i osocza mogą nie być równoważne, ponieważ podczas reakcji krzepnięcia dochodzi do znacznego uwalniania egzosomów.</li>
	<li>Odwirować próbki osocza lub surowicy o masie 500 x g przez 15 minut w celu wytrącenia agregatów białkowych i innych zanieczyszczeń. Przenieść podwielokrotność próbki osocza lub surowicy do świeżej probówki i dodać PBS w celu uzyskania rozcieńczenia 1:1. Wymieszać rozcieńczoną próbkę przez delikatne wirowanie lub odwrócenie, w zależności od przypadku. Przenieść 1 μl każdej zawiesiny osocza lub surowicy do każdej z kontrprób na płytce testowej.</li>
</ol>
5. Wychwytywanie i wykrywanie egzosomów
<ol>
	<li>Załadować studzienki zablokowanego szkiełka wychwytującego EV 1 μl/studzienkę próbki egzosomu, stosując 8 powtórzeń na próbkę, i inkubować szkiełko przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze. Odessać wszystkie dołki na próbki, a następnie dodać 1 μl / studzienkę PBS, aby przemyć dołki i usunąć niezwiązane egzosomy i inne zanieczyszczenia z załadowanej próbki egzosomu.</li>
	<li>Do studzienek na próbki należy załadować 1 μl/basenik uprzednio przygotowanej zawiesiny AuNR-IgG (patrz sekcja 1 powyżej) i inkubować szkiełko przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze. Zassać roztwór nanocząstek i przemyć szkiełko w PBS uzupełnionym 0,01% Tween-20 (PBST) przez 10 minut za pomocą mieszalnika, następnie odessać i przemyć wszystkie dołki próbki wodą dejonizowaną przez 10 minut za pomocą mieszalnika obrotowego i wysuszyć na powietrzu w celu późniejszego obrazowania LMDFM. 
	UWAGA: Współczynniki zmienności między testami (CV) ocenia się na podstawie ośmiu powtórzeń tej samej próbki. Próbki, które wykazują CV >20%, są uważane za nieinformacyjne i należy je powtórzyć, jeśli jest wystarczająca próba.</li>
</ol>
6. Przechwytywanie obrazu DFM
<ol>
	<li>Rejestruj obrazy w celu ilościowego oznaczania egzosomów przy stałym oświetleniu za pomocą kamery cyfrowej podłączonej do mikroskopu wyposażonego w kondensor ciemnego pola (1,2 < NA < 1,4) i obiektyw 4x o czasie naświetlania 1/220 s.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do przechwytywania obrazu. 
	UWAGA: Używamy oprogramowania do obrazowania mikroskopowego NIS-Elements (patrz Tabela materiałów) dla protokołu opisanego poniżej, ale możliwe jest użycie innego oprogramowania, które może dopasować jego parametry przechwytywania obrazu. Oprogramowanie do obrazowania NIS-Elements Viewer to bezpłatny, samodzielny program do przeglądania plików obrazów i zestawów danych, który zawiera narzędzia do analizy, wizualizacji i archiwizacji. Poniższe parametry dotyczą również mikroskopu z autofokusem i zautomatyzowanym stolikiem, który umożliwia automatyczne przechwytywanie wielu obrazów i łączenie ich w jeden obraz.</li>
	<li>Umieść szkiełko do góry nogami na stoliku mikroskopu, wyreguluj pozycję szkiełka i nałóż niewielką kroplę olejku immersyjnego na tył szkiełka, w miejscu, w którym soczewka skraplacza styka się ze szkiełkiem.</li>
	<li>Kliknij przycisk na żywo w interfejsie oprogramowania i dobrze dostosuj czas ekspozycji do standardu wysokiego stężenia, aby upewnić się, że obraz nie jest nasycony.</li>
	<li>Otwórz okno Skanuj duży obraz z zakładki Acquire (Pobieranie) i ustaw parametry interfejsu oprogramowania w następujący sposób: Macro Image Optical conf = current; Obiektyw: 2:10x, Skanowanie Konfiguracja optyczna = prąd, Obiektyw: 2:10x; Zakładka szwów = 20%; Zszywanie za pomocą = optymalna ścieżka.</li>
	<li>Wybierz Utwórz duży obraz, Zamknij aktywną migawkę podczas ruchu sceny, Poczekaj przed każdym zrobieniem zdjęcia: 20 ms, Ustaw ostrość ręcznie na początku i Użyj ostrości krok po kroku co 20 pól. Te ustawienia zostaną zapisane wraz z zeskanowanymi obrazami.</li>
	<li>Przesuń stolik mikroskopu, aby zdefiniować lewy, górny, prawy, dolny limit pola skanowania docelowego. Dostosuj ostrość, aby uzyskać wyraźny obraz na monitorze, a w razie potrzeby dostosuj ustawienia kondensora i oświetlenie otoczenia, aby zminimalizować wszelkie nieprawidłowości oświetlenia w ostrym obrazie.</li>
	<li>Nazwij plik wyjściowy obrazu w oprogramowaniu. Kliknij przycisk Skanuj i pozwól mikroskopowi na skanowanie oraz utworzenie i zapisanie zszytego obrazu całego preparatu.</li>
	<li>Otwórz zapisany obraz za pomocą używanego oprogramowania do przechwytywania obrazu i zapisz go w skali 1/8 do późniejszej analizy we wtyczce DSM w ImageJ.</li>
</ol>
7. Analiza obrazu DFM
<ol>
	<li>Pobierz program ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Zainstaluj wtyczkę algorytmu DSM w ImageJ, postępując zgodnie z instrukcjami podanymi na stronie https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie ImageJ, a następnie ustaw następujące parametry wejściowe w algorytmie DSM: Próg konturu (Ct) = 253,020, Typ = Czerwony, Skala środkowa (S) = 0,8, Dolna (Lt)/Wysoka (Ht) granica kwantyfikacji = 0/62.</li>
	<li>Otwórz zapisany obraz z sekcji 6.8 za pomocą ImageJ. Wybierz przycisk Skanowanie DSM na karcie Wtyczki, a następnie zdefiniuj liczbę kolumn i wierszy zgodnie z otwartym obrazem. Program może automatycznie rozpoznawać obszary wykrywania i analizować intensywność rozpraszania nanocząstek w odpowiednich obszarach. Ustaw następujące parametry wejściowe w oknie DSM Scan: Procent zmiany rozmiaru = 25, Średnica plamki (w pikselach) = 190 – 200, Zakres średnic = 32, Przyrost średnicy (w pikselach) = 8, Konfiguracja DSM — dolny limit = 0, Górny limit = 62, Sąsiednia odległość = 100, Odejmij odchylenie = 0, 
UWAGA: Wyniki intensywności rozpraszania nanocząstek odzwierciedlają ilość związanych egzosomów na szkiełku.</li>
</ol>

<ol><li>Andaloussi S, E. L., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li>
<li>Choi, D. S., Kim, D. K., Kim, Y. K., Gho, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%2C+transcriptomics+and+lipidomics+of+exosomes+and+ectosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes.</a> Proteomics. 13 (10-11), 1554-1571 (2013).</li>
<li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li>
<li>Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Composition%2C+Biological+Relevance%2C+and+Methods+of+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study.</a> Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).</li>
<li>Liang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoplasmonic+Quantification+of+Tumor-derived+Extracellular+Vesicles+in+Plasma+Microsamples+for+Diagnosis+and+Treatment+Monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Nanoplasmonic Quantification of Tumor-derived Extracellular Vesicles in Plasma Microsamples for Diagnosis and Treatment Monitoring.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).</li>
<li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles+in+Bile+as+Markers+of+Malignant+Biliary+Stenoses%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles in Bile as Markers of Malignant Biliary Stenoses.</a> Gastroenterology. 153 (2), e498 495-504 (2017).</li>
<li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+proteomic+characterization+of+extracellular+vesicles+in+human+pancreatic+juice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Detection and proteomic characterization of extracellular vesicles in human pancreatic juice.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 499 (1), 37-43 (2018).</li>
<li>Bulacio, R. P., Nosetto, E. C., Brandoni, A., Torres, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+finding+of+caveolin-2+in+apical+membranes+of+proximal+tubule+and+first+detection+of+caveolin-2+in+urine%3A+A+promising+biomarker+of+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel finding of caveolin-2 in apical membranes of proximal tubule and first detection of caveolin-2 in urine: A promising biomarker of renal disease.</a> Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).</li>
<li>Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+exosomes+as+potential+biomarkers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer.</a> Oral Oncology. 84, 31-40 (2018).</li>
<li>Kim, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+value+of+microRNAs+derived+from+exosomes+in+bronchoalveolar+lavage+fluid+of+early-stage+lung+adenocarcinoma%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Thoracic+Cancer%22%5BJournal%5D)">Diagnostic value of microRNAs derived from exosomes in bronchoalveolar lavage fluid of early-stage lung adenocarcinoma: A pilot study.</a> Thoracic Cancer. 9 (8), 911-915 (2018).</li>
<li>Boussadia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+microenvironment+plays+a+key+role+in+human+melanoma+progression+through+a+sustained+exosome+mediated+transfer+of+clinically+relevant+metastatic+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Acidic microenvironment plays a key role in human melanoma progression through a sustained exosome mediated transfer of clinically relevant metastatic molecules.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 245(2018).</li>
<li>An, M., Wu, J., Zhu, J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+an+Optimized+Ultracentrifugation+Method+versus+Size-Exclusion+Chromatography+for+Isolation+of+Exosomes+from+Human+Serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of an Optimized Ultracentrifugation Method versus Size-Exclusion Chromatography for Isolation of Exosomes from Human Serum.</a> Journal of Proteome Research. , (2018).</li>
<li>Brenner, A. W., Su, G. H., Momen-Heravi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Extracellular+Vesicles+for+Cancer+Diagnosis+and+Functional+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Extracellular Vesicles for Cancer Diagnosis and Functional Studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 229-237 (2019).</li>
<li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li>
<li>Sun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+Reduction+Method+for+Quantifying+Nanoparticle+Light+Scattering+in+Low+Magnification+Dark-Field+Microscope+Far-Field+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images.</a> Analytical Chemistry. 88 (24), 12001-12005 (2016).</li>
<li>Sun, D., Hu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+cost+mobile+phone+dark-field+microscope+for+nanoparticle-based+quantitative+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A low cost mobile phone dark-field microscope for nanoparticle-based quantitative studies.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 513-518 (2018).</li>
<li>Koshikawa, N., Minegishi, T., Kiyokawa, H., Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+detection+of+soluble+EphA2+fragments+in+blood+as+a+new+biomarker+for+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Specific detection of soluble EphA2 fragments in blood as a new biomarker for pancreatic cancer.</a> Cell Death & Disease. 8 (10), e3134(2017).</li>
<li>Clayton, A., Turkes, A., Navabi, H., Mason, M. D., Tabi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+heat+shock+proteins+in+B-cell+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Induction of heat shock proteins in B-cell exosomes.</a> Journal of Cell Science. 118 (Pt 16), 3631-3638 (2005).</li>
<li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ESCRT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The ESCRT pathway.</a> Developmental Cell. 21 (1), 77-91 (2011).</li>
<li>Panagiotara, A., Markou, A., Lianidou, E. S., Patrinos, G. P., Katsila, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+a+cancer+theranostics+road+map%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Genomics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: a cancer theranostics road map.</a> Public Health Genomics. 20 (2), 116-125 (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Egzosomy powstają w wyniku regulowanych wgłębień zewnętrznej błony endosomu, które wytwarzają ciała wielopęcherzykowe, wyspecjalizowany podzbiór endosomów, które zawierają dużą liczbę pęcherzyków śródświetlnych, które ulegają fuzji z błoną plazmatyczną, aby uwolnić dojrzałe egzosomy do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Ze względu na ten szlak biogenezy egzosomy mogą przenosić czynniki związane z błoną związaną z frakcjami błonowymi, które zawierają lub łączą się z błoną endosomu, a także wiele różnych typów składników cytozolowych, a tym samym zawierać ładunki białek, DNA i różnych podtypów RNA (mRNA, mikroRNA, długie niekodujące RNA), które mogą odzwierciedlać fenotyp ich komórki pochodzenia20. Ponieważ egzosomy są wydzielane przez większość, jeśli nie wszystkie typy komórek, mogą wykazywać zwiększone wydzielanie z komórek chorych lub złośliwych i gromadzić się w większości płynów ustrojowych, egzosomy są przedmiotem kompleksowych i systematycznych badań jako obiecujący minimalnie inwazyjny sposób wykrywania określonych stanów chorobowych i monitorowania ich odpowiedzi na leczenie21.
Izolacja egzosomów, która jest wymagana w większości obecnych analiz egzosomów, jest długotrwałą i pracochłonną procedurą, ograniczającą kliniczną translację biomarkerów związanych z egzosomami o potencjalnym znaczeniu medycznym. Wiele powszechnych metod izolacji (ultrawirowanie, wykluczanie wielkości, wytrącanie itp.) często nie odróżnia wystarczająco egzosomów (30–100 nm) od mikropęcherzyków (100–1000 nm) i ciał apoptotycznych (100–5000 nm) ze względu na nakładanie się ich zakresów wielkości lub właściwości fizycznych lub może uszkodzić integralność egzosomów15. Opracowywane są nowe podejścia, które mogą pozwolić na szybsze analizy egzosomów, ale nie jest jasne, na ile wykonalne może być wdrożenie wielu z tych platform w warunkach klinicznych ze względu na to.
W tym raporcie przedstawiamy nowatorskie podejście, które umożliwia wysokoprzepustową kwantyfikację egzosomów w oparciu o nanocząstki przy użyciu obrazów mikroskopowych ciemnego pola o małym powiększeniu. Metoda ta nie wymaga oczyszczania egzosomów, drogiego dedykowanego sprzętu ani nowatorskiej wiedzy technicznej, a zatem powinna być podatna na szybkie tłumaczenie w większości warunków badawczych i klinicznych. Nasz test można zastosować do precyzyjnego ilościowego określenia stężenia docelowej populacji egzosomów zawierających określony biomarker, gdy wyniki testu są porównywane z krzywą standardową, ponieważ nasze wyniki pokazują, że istnieje silna korelacja liniowa (R2 = 0,99) między odpowiedzią optyczną a stężeniem egzosomu. Aby zademonstrować rzeczywisty potencjał tego podejścia, dostarczyliśmy dane, w których zastosowaliśmy tę metodę do ilościowego określenia stężenia biomarkera egzosomu związanego z rakiem trzustki w próbkach surowicy uzyskanych od pacjentów z rakiem trzustki i bez niego.
W LMDFM cała studzienka próbki jest obrazowana, aby uniknąć błędu selekcji występującego w analizach DFM o dużym powiększeniu, w których użytkownicy muszą bezpośrednio wybrać pola próbki do przechwycenia do późniejszej analizy obrazu, ale podlega artefaktom rozpraszania światła z nierówności powierzchni, w tym zadrapań i resztek próbki. To tło można zredukować, aby wykryć sygnał pochodzący z docelowego egzosomu za pomocą naszego algorytmu redukcji szumów DSM, który działa w programie do analizy obrazu NIH, ImageJ, ale nadal należy zachować ostrożność, aby uniknąć wprowadzania takich artefaktów, które mogą zmniejszyć zakres dynamiczny testu.
Materiały użyte w tym teście:
Wielodołkowe szkiełka SuperProtein A/G zawierające 1 μl/studzienkę zakupiono od Arrayit Corporation (AGMSM192BC). Nanocząstki uzyskano z Nanopartz (C12-25-650-TN-DIH-50-1, 6,4 x 1012/mL). Zdjęcia DFM zostały wykonane aparatem cyfrowym Nikon DiR2 podłączonym do mikroskopu Nikon Ti-Eclipse, przy stałym oświetleniu i czasie naświetlania 1/220 s. Linia komórkowa PANC-1 wykorzystana w tym badaniu została zakupiona z American Type Culture Collection.

Egzosomy są uwalniane z większości typów komórek i odgrywają kluczową rolę w komunikacji między komórkami, w tym w procesach patofizjologicznych związanych z różnymi chorobami, ponieważ mogą być domem dla określonych tkanek lub typów komórek i zawierają różnorodne kwasy nukleinowe, białka i lipidy, które odzwierciedlają ich pochodzenie i mogą wywierać wpływ regulacyjny na komórki odbiorcy1, 2,3,4. Egzosomy są często wydzielane w podwyższonych stężeniach w stanach chorobowych, mogą wchodzić w interakcje zarówno z sąsiednimi, jak i odległymi komórkami i znajdują się w stosunkowo wysokim stężeniu w krążeniu, podobnie jak większość innych płynów ustrojowych, w tym ślina, mocz, sok trzustkowy i żółciowy oraz płyn z płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych5,6,7,8,9,10,11. Ta obfitość i stabilność egzosomów w płynach ustrojowych człowieka, w połączeniu z ich bogatą w informacje naturą, czyni je idealnymi biomarkerami do diagnozowania chorób i monitorowania leczenia.
Obejmuje to egzosomy pochodzące z nowotworu (TDE), które zawierają specyficzne dla nowotworu lub selektywne czynniki, które mogą służyć jako biomarkery choroby, w tym zmutowane allele związane z nowotworem. TDE mogą uczestniczyć w przebudowie mikrośrodowiska guza, aby ułatwić rozwój guza i przerzuty oraz regulować reakcje przeciwnowotworowe12. Zwiększone wydzielanie TDE jest powszechnym fenotypem większości nowotworów, a kilka cech mikrośrodowiska guza, w tym niedotlenienie, kwaśne pH i stan zapalny, sprzyja wydzielaniu egzosomów. Co zaskakujące, biorąc pod uwagę liczbę komórek wydzielających egzosomy, wzrost całkowitego poziomu egzosomów może sam w sobie funkcjonować jako biomarker raka. Na przykład niedawne badanie wykazało, że całkowite stężenie EV w soku żółciowym rozróżnia złośliwe i niezłośliwe u pacjentów ze wspólnym zwężeniem dróg żółciowych ze 100% dokładnością7. Podobne wyniki uzyskano w badaniach z użyciem innych płynów ustrojowych, w tym osocza. Jednak ze względu na możliwość zmienności w zależności od podmiotu i innych czynników zakłócających, większość badań nad egzosomami jako biomarkerami choroby koncentrowała się na wykrywaniu biomarkerów, które są selektywnie związane z TDE, a nie z całkowitą liczbą egzosomów.
Przeniesienie biomarkerów egzosomów do praktyki klinicznej pozostaje jednak wyzwaniem, ponieważ większość zgłoszonych metod testowania egzosomów wymaga czasochłonnych i pracochłonnych procedur izolacji 13. Obecnie popularne metody izolacji egzosomów obejmują ultrawirowanie, gradienty gęstości, wykluczanie wielkości, współstrącanie, wychwytywanie powinowactwa i izolację mikroprzepływową. Ultrawirowanie jest "złotym standardem" i jest najczęściej stosowane do izolacji egzosomów, ale ta procedura jest czasochłonna i powoduje uszkodzenie egzosomów i grupowanie błony egzosomów, a także wytwarza próbki egzosomów, które są zanieczyszczone białkami, lipoproteinami i innymi czynnikami, które mogą wpływać na późniejsze analizy14. Większość metod izolacji egzosomów, w tym ultrawirowanie, nie jest w stanie oddzielić egzosomów (30–150 nm) od mikropęcherzyków (100–1000 nm) i ciał apoptotycznych (100–5000 nm), które powstają w wyniku różnych mechanizmów i pełnią różne funkcje, ze względu na nakładanie się wielkości tych grup i różnorodność populacji egzosomów15. Potrzebne są nowe podejścia, aby poprawić czułość i odtwarzalność testów egzosomów poprzez poprawę odzyskiwania egzosomów przy jednoczesnym zmniejszeniu uszkodzeń i zanieczyszczeń egzosomów, chociaż wszelkie testy oparte na takich metodach będą również musiały zostać zoptymalizowane, aby nadawały się do translacji do zastosowań w warunkach klinicznych.
Kilka ostatnich badań zaproponowało wykorzystanie zintegrowanych platform do przechwytywania i analizowania egzosomów bezpośrednio z płynów ustrojowych. Metody te wykorzystują mikroprzepływowe, elektrokinetyczne, wychwytywanie powinowactwa i różne inne metody izolacji egzosomów oraz elektrochemii, powierzchniowego rezonansu plazmonowego i inne metody wykrywania wychwyconych egzosomów. Nie jest jasne, na ile wiele z tych podejść będzie wykonalnych w warunkach klinicznych ze względu na ich złożoność, koszty, niską przepustowość lub inne problemy.
Opracowaliśmy szybki i tani test, który może być używany do czułej i specyficznej kwantyfikacji całkowitych egzosomów i określonych podtypów egzosomów, w tym egzosomów związanych z chorobą, takich jak TDE, który wymaga tylko niewielkiej ilości próbki i który wykorzystuje usprawniony przepływ pracy odpowiedni dla środowisk klinicznych. W tym teście szkiełko jest pokryte przeciwciałami, które wiążą marker specyficzny dla egzosomu lub specyficzny dla choroby wyrażony na powierzchni egzosomu w celu bezpośredniego wychwycenia docelowych egzosomów obecnych w próbkach osocza lub surowicy o małej objętości nałożonych na studzienki na szkiełku. Uchwycone egzosomy są następnie hybrydyzowane z nanocząstką sprzężoną z przeciwciałem, która rozpoznaje biomarker zainteresowania na tych egzosomach, który może być ogólnym markerem egzosomu lub czynnikiem specyficznym dla podtypu egzosomu będącego przedmiotem zainteresowania. Obrazy tych studzienek na próbki są następnie rejestrowane za pomocą mikroskopu ciemnego pola (DFM) i analizowane w celu zmierzenia światła rozproszonego od nanocząstek związanych z interesującymi egzosomami uchwyconymi w każdej próbce studzienki6,16,17. Warto zauważyć, że dobre obrazowanie całej próbki za pomocą DFM o małym powiększeniu (LMDFM) pozwala uniknąć błędu selekcji występującego w przypadku analiz DFM o dużym powiększeniu, gdy użytkownicy muszą bezpośrednio wybrać, które pola przechwycić do późniejszej analizy obrazu. Analiza obrazu LMDFM podlega artefaktom rozpraszania światła wynikającym z nierówności powierzchni, w tym zadrapań i resztek próbki, ale to tło można zredukować za pomocą prostego algorytmu redukcji szumów, który opracowaliśmy do uruchomienia w programie do analizy obrazu NIH, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Algorytm ten najpierw stosuje wejściowy próg konturu, który jest używany do wykrywania granic studni próbki w celu zdefiniowania obszaru obrazu do późniejszej analizy. Obszar zdefiniowany przez ten obszar konturu jest następnie dzielony w celu oddzielenia sygnału obecnego w kanałach czerwonym, niebieskim i zielonym obrazu, a kanał niebieski jest odejmowany od kanału czerwonego, aby usunąć sygnał wynikający z artefaktów powierzchniowych i nierównomiernego oświetlenia z sygnału nanoprętowego.
Ten artykuł opisuje, jak używać tego testu do szybkiego ilościowego oznaczania całkowitych lub specyficznych poziomów egzosomów w próbkach osocza lub surowicy.

<table><tbody><tr><td>Eppendorf Repeater stream</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-401-040</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus</td><td>Eppendorf</td><td>3120000011</td><td>0.1 &ndash; 2.5 &micro; L, ciemnoszary</td></tr><tr><td>Funkcjonalizowane złote nanopręty</td><td>Nanopartz</td><td>C12-25-650-TN-DIH-50-1</td><td>Funkcjonalizacja polimeru neutrawidyny in vitro</td></tr><tr><td>Mieszalnik próbek HulaMixer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15920D</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka 10L</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H1010</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop badawczy</td><td>Nikon</td><td>Ti-DH</td><td>Z kondensatorem ciemnego pola, kamerą DS-Ri2 i uniwersalnym uchwytem Ti-SH-U oraz zmotoryzowanym stolikiem</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania mikroskopem</td><td>NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1X)</td> <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30256.02</td><td>Hyclone</td></tr><tr><td>Protein A/G Glass Substrate Slides</td><td>Arrayit Corp.</td><td>AGMSM192BC</td><td>Wysokiej jakości podłoże mikromacierzy</td></tr><tr><td>Q500 Sonicator</td><td>Qsonica, LLC</td><td>Q500-110</td><td>Ze standardową sondą (#4220)</td></tr><tr><td>Bufor blokujący superblok</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego określenia egzosomów pochodzących z guza

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

Zakażone lub złośliwe komórki często wydzielają więcej egzosomów, co prowadzi do podwyższonego poziomu egzosomów związanych z chorobą w krążeniu. Te egzosomy mogą potencjalnie służyć jako biomarkery do diagnozowania chorób oraz monitorowania postępu choroby i odpowiedzi na leczenie. Jednak większość procedur analizy egzosomów wymaga etapów izolacji i oczyszczania egzosomów, które są zwykle czasochłonne i pracochłonne, a tym samym mają ograniczoną użyteczność w warunkach klinicznych. W niniejszym raporcie opisano szybką procedurę analizy określonych biomarkerów na zewnętrznej błonie egzosomów bez konieczności oddzielnych etapów izolacji i oczyszczania. W tej metodzie egzosomy są wychwytywane na powierzchni szkiełka przez przeciwciała specyficzne dla egzosomu, a następnie hybrydyzowane z sondami przeciwciał sprzężonymi z nanocząstkami specyficznymi dla choroby. Po hybrydyzacji liczebność docelowej populacji egzosomów określa się poprzez analizę obrazów związanych nanocząstek pod mikroskopem ciemnego pola o małym powiększeniu (LMDFM). Podejście to można łatwo zastosować w badaniach i zastosowaniach klinicznych do analizy biomarkerów egzosomów związanych z błoną związanych z chorobą.

Wielodołkowe szkiełka powlekane białkiem A/G (Rysunek 1A) funkcjonalizowano przeciwciałem anty-EphA2, a następnie wykorzystano je do specyficznego wychwytywania egzosomów dodatnich pod kątem EphA2 z próbek surowicy pacjentów z rakiem trzustki oraz osób zdrowych (1 µL/dołek), po czym inkubowano je z nanocząsteczkami złota w kształcie prętów skoniugowanymi z przeciwciałem anty-CD9 (Rysunek 1B). Obrazy DFM światła rozproszonego przez te nanocząsteczki analizowano za pomocą wtyczki DSM w oprogramowaniu ImageJ w celu ilościowego oznaczenia związanych egzosomów dodatnich pod kątem EphA-2 w każdym dołku. Algorytm DSM automatycznie definiuje granicę dołka z próbką, filtruje szum wynikający z artefaktów, oblicza sygnał rozproszenia z każdego dołka i generuje te informacje (Rysunek 2). Algorytm DSM silnie tłumi artefakty rozproszenia światła pochodzące z zarysowań lub zanieczyszczeń obecnych w próbce, co poprawia czułość i powtarzalność detekcji nanocząsteczek, a także umożliwia automatyczne przetwarzanie serii obrazów szkiełek do zastosowań wysokoprzepustowych. Algorytm ten wykorzystuje komendy ImageJ oraz parametry wprowadzone przez użytkownika w celu odjęcia tła obrazu, obliczenia sygnału rozproszenia z każdego dołka oraz wygenerowania pliku danych i obrazu (Rysunek 3). Obszary zainteresowania są definiowane przez granice dołków o wysokiej intensywności na obrazie wychwytu przy użyciu funkcji progu konturu (contour threshold) w programie makr ImageJ. Analizy obrazu wykorzystują zdefiniowany wcześniej próg konturu oraz parametry obrazu do obliczenia intensywności rozproszenia nanocząsteczek dla każdego dołka.
Jak opisano w naszej poprzedniej pracy (informacje uzupełniające Liang et al.6), egzosomy wyizolowane z kultur komórek PANC-1, scharakteryzowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej oraz Western blot, wykazały zakres wielkości, morfologię i ekspresję markerów białkowych zgodną z próbką egzosomów o wysokiej czystości. Egzosomy PANC-1, przygotowane zgodnie z procedurą opisaną w naszej poprzedniej pracy, zostały tutaj wykorzystane do walidacji testu nPES w celu ilościowego oznaczenia egzosomów. W teście tym zastosowano przeciwciało anty-EphA2 do wychwycenia znacznej populacji egzosomów z całkowitej populacji egzosomów oraz przeciwciało przeciwko ogólnemu białku egzosomów CD9 w celu detekcji wychwyconych egzosomów. Wyniki uzyskane przy użyciu seryjnie rozcieńczonych próbek egzosomów PANC-1, o stężeniach białka w zakresie od 0,24 do 1,2 µg/µL, wykazały dobrą powtarzalność w powtórzeniach (Rysunek 4A) oraz silną korelację liniową między odpowiedzią rozproszeniową a stężeniem białka egzosomów (Rysunek 4B).
Aby zademonstrować potencjalne zastosowanie tej metody, przeanalizowano próbki surowicy od pacjentów z rakiem trzustki oraz osób zdrowych w celu wykrycia zawartości egzosomów surowiczych wykazujących ekspresję biomarkera związanego z nowotworami EphA2, wykorzystując przeciwciało anty-EphA2 do bezpośredniego wychwytywania docelowych egzosomów z surowicy oraz nanocząsteczki sprzężone z przeciwciałem anty-CD9 do detekcji związanych egzosomów. Analiza ta wykazała, że próbki surowicy od pacjentów z rakiem trzustki zawierały znacznie wyższe poziomy egzosomów EphA2+ (Rysunek 5) niż próbki kontrolne.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Schemat ilościowego oznaczania egzosomów. (A) Schemat wielodołkowych szkiełek z białkiem A/G (192 dołki) wykorzystywanych w tym teście. (B) Docelowe egzosomy są bezpośrednio wychwytywane z próbek, w tym z surowicy i osocza, poprzez unieruchomienie powierzchniowe na przeciwciele wychwytującym (np. przeciwciało anty-EphA2) związanym ze szkiełkiem, a następnie inkubowane z nanoprętami złota sprzężonymi z przeciwciałem detekcyjnym (np. przeciwciało anty-CD9) przed analizą za pomocą analizy obrazu DFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Ilościowe oznaczenie egzosomów poprzez zastosowanie algorytmu DSM do obrazów LMDFM. Obrazy o niskim powiększeniu są przetwarzane za pomocą algorytmu DSM w celu wyeliminowania sygnału tła oraz artefaktów sygnału, które mogą wynikać z zarysowań, pustek po mieszaniu, zanieczyszczeń i nierównomiernego oświetlenia próbki, aby umożliwić wiarygodną detekcję sygnału złotych nanoprętów, który koreluje z stężeniem egzosomów. Rysunek został zaadaptowany za zgodą autorów: Sun, D. et al. Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images. Analytical Chemistry. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig3.jpg" /> 
Rycina 3: Schemat poleceń i wyników algorytmu DSM. Wskazane kroki wykorzystują natywne polecenia programu ImageJ, a wszystkie parametry wejściowe są dobierane zgodnie z wymaganiami eksperymentów za pomocą graficznego interfejsu użytkownika. Rycina została opracowana na podstawie publikacji Sun, D. et al. Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images. Analytical Chemistry. 88 (24), 12001-12005 (2016) za zgodą autorów. Copyright (2016) American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy nPES LMDFM oraz dane wyjściowe DSM. (A) Obraz LMDFM z analizy nPES gradientu stężeń egzosomów PANC-1 oraz (B) liniowa korelacja sygnału optycznego i stężenia egzosomów z tej płytki (od lewej do prawej: odpowiednio 0.24, 0.356, 0.53, 0.80, 1.20 µg/µL dla każdej kolumny). Dane przedstawiono jako średnia±SE, n=6, przy współczynniku korelacji Pearsona R2 = 0.99 i współczynniku zmienności dla powtórzeń każdego stężenia &#60; 0.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig5.jpg" /> 
Rycina 5: Sygnał LMDFM egzosomów EphA2+ różni się w surowicy pacjentów z rakiem trzustki i bez tego schorzenia. Próbki surowicy analizowane metodą nPES z użyciem przeciwciała wychwytującego anty-EphA2 (związanego z nowotworem) i przeciwciała detekcyjnego anty-CD9 (ogólnego markera egzosomów) wykazały istotną różnicę w stężeniu egzosomów EphA2+ w próbkach surowicy pacjentów z rakiem trzustki i bez tego schorzenia (N = 7/grupa). Wyniki przedstawiono jako średnia±błąd standardowy (Mean±SE). **p = 0,002 testem U Manna-Whitneya (dwustronnym). Rycina została zmodyfikowana na podstawie [Sun, D. et al. Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images. Analytical Chemistry. 88 (24), 12001-12005 (2016)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Kliniczne tłumaczenie biomarkerów pochodzących z egzosomów dla chorych i złośliwych komórek jest utrudnione przez brak szybkich i dokładnych metod kwantyfikacji. W niniejszym raporcie opisano wykorzystanie obrazów mikroskopowych ciemnego pola o małym powiększeniu do ilościowego oznaczania określonych podtypów egzosomów w próbkach surowicy lub osocza o małej objętości.

Wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego określenia egzosomów pochodzących z guza

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

Rozpraszanie wzmocnione nanoplazmonem (nPES) jest prostą i nieinwazyjną alternatywą dla biopsji chirurgicznej, która może pominąć czasochłonne i pracochłonne etapy oczyszczania egzosomów, rozszerzając zastosowanie analizy egzosomów na warunki kliniczne. Ten test nPES jest szybką procedurą analizy określonych biomarkerów na zewnętrznej błonie egzosomów, która nie wymaga oddzielnych etapów izolacji i oczyszczania. Do tego testu potrzebujemy tylko bardzo małej próbki klinicznej.Dlatego ta metoda może rozszerzyć zastosowanie nPES na badanie genetycznie modyfikowanych modeli myszy lub PDX. W tym protokole jest kilka kroków, które mogą wydawać się zniechęcające. Jednak po kilku biegach treningowych każdy, kto ma podstawowe umiejętności w laboratorium mokrym, może nauczyć się skutecznie wykonywać nPES.Aby rozpocząć procedurę, połącz 40 mikrolitrów zawiesiny nanoprętów złota funkcjonalizowanego NeutrAwidin z 200 mikrolitrami zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem o pH 7. Odwirować mieszaninę w temperaturze 8500 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut i usunąć supernatant. Powtórz ten proces prania jeszcze dwa razy, a następnie ponownie zawieś nanopręty w 40 mikrolitrach zimnego PBS.Następnie do zawiesiny dodać 150 mikrolitrów zimnego PBS i 10 mikrolitrów roztworu 0,5 miligrama na mililitr odpowiednich biotynylowanych przeciwciał. Mieszaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby uzyskać złote pręty sprzężone z przeciwciałami. Umyj nanopręty trzykrotnie przez odwirowanie w 200-mikrolitrowych porcjach zimnego PBS w ilości 6500 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut każda.Następnie ponownie zawieś umyte nanopręty sprzężone z przeciwciałami w 200 mikrolitrach zimnego PBS i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do 24 godzin. Aby rozpocząć przygotowanie szkiełka, rozcieńczyć pożądane przeciwciała wychwytujące egzosomy do 025 miligramów na mililitr w PBS. Odpipetować jeden mikrolitr tego roztworu do każdej studzienki szkiełka podstawowego poddanego działaniu białka A / G, pokrytego szkłem klasy optycznej.Następnie przenieś szkiełko do pudełka nawilżającego, aby upewnić się, że studzienki nie wyschną podczas inkubacji. Inkubować szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby unieruchomić przeciwciała wychwytujące. Następnie odessać pozostały roztwór, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.Umyj studzienki, dodając i zasysając trzykrotnie jeden mikrolitr PBS. Następnie szybko załaduj każdą studzienkę jednym mikrolitrem bufora blokującego na bazie PBS i inkubuj szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. W przypadku około 15 próbek musimy użyć pipety jednokanałowej, aby załadować bufor blokujący do 120 dołków w czasie krótszym niż pięć minut, aby uniknąć odparowania środka blokującego.Rozpocznij przygotowywanie roztworu złotych nanoprętów sprzężonych z przeciwciałami podczas blokowania szkiełka. Na około 30 minut przed zakończeniem blokowania należy szybko rozmrozić próbki osocza lub surowicy w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Rozmrożone próbki należy mieszać wirowo przez 30 sekund, aby upewnić się, że zawiesiny są jednorodne.Następnie odwirować próbki w temperaturze 500 razy g przez 15 minut, aby wytrącić agregaty białkowe i inne zanieczyszczenia. Przenieść 10-mikrolitrowe porcje supernatantu do świeżych probówek i rozcieńczyć jeden do jednego za pomocą PBS. Rozcieńczone próbki należy wymieszać przez delikatne wirowanie lub odwrócenie, w zależności od przypadku.Po zakończeniu blokowania szkiełka należy zassać bufor blokujący i trzykrotnie przemyć studzienki porcjami PBS o pojemności jednego mikrolitra. Natychmiast załadować próbki do studzienek po jednym mikrolitrze na studzienkę i ośmiu powtórzeniach na próbkę. W ten sam sposób załaduj wzorce egzosomów do odpowiednich studzienek.Inkubować szkiełko przez 12 do 18 godzin w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odessać studzienki i umyć każdą studzienkę raz jednym mikrolitrem PBS. Załaduj jeden mikrolitr zawiesiny złotego nanopręta sprzężonej z przeciwciałami do każdej studzienki i inkubuj szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Następnie odessać zawiesinę nanoprętów i myć szkiełko w PBS uzupełnionym 1%polisorbatem 20 przez 10 minut za pomocą mieszalnika. Następnie zassać studzienki i umyć szkiełko w wodzie dejonizowanej przez 10 minut na obrotowym mikserze. Usuń wodę i pozwól szkiełku wyschnąć na powietrzu na czystej szalce Petriego przed umieszczeniem szkiełka w mikroskopie ciemnego pola.Ustaw odwrócony mikroskop wyposażony w kondensor zanurzeniowy w oleju w ciemnym polu, obiektyw 4x i zmotoryzowany stolik. Podłącz mikroskop do komputera za pomocą aparatu cyfrowego i otwórz oprogramowanie do obrazowania. Następnie umieść szkiełko z próbką do góry nogami na stoliku mikroskopu i nałóż niewielką kroplę olejku immersyjnego w miejscu, w którym soczewka skraplacza styka się ze szkiełkiem.Wyświetl widok przez mikroskop w oprogramowaniu do obrazowania. Dobrze dostosuj czas ekspozycji do wzorca o wysokim stężeniu, aby upewnić się, że obraz nie będzie nasycony. Następnie otwórz narzędzie do skanowania dużych obrazów i ustaw powiększenie obiektywu na 10x.Wybierz, aby zamknąć aktywną migawkę podczas ruchu stołu montażowego i odczekać 20 milisekund przed każdym zrobieniem zdjęcia. Ustaw nakładanie się ściegów na 20% i wybierz zszywanie za pomocą optymalnej ścieżki. Wybierz, aby utworzyć duży obraz ze skanu.Ustaw aparat tak, aby ustawiał ostrość ręcznie na początku skanowania i włącz automatyczne ustawianie ostrości krok po kroku co 20 pól. Następnie wybierz ustawienie lewego, prawego, górnego i dolnego limitu dla docelowego pola skanowania i zdefiniuj obszar skanowania, przesuwając stolik mikroskopu do każdego z żądanych limitów. Następnie dostosuj ostrość, kondensor i oświetlenie obszaru, aby uzyskać wyraźny, dobrze oświetlony obraz.Nazwij plik obrazu, który ma zostać utworzony, i rozpocznij skanowanie. Po zakończeniu otwórz obraz i zapisz go w skali 1/8. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu.Następnie otwórz menu Wtyczki, kliknij DSM Scan, zdefiniuj liczbę kolumn i wierszy, ustaw procent zmiany rozmiaru na 25, ustaw średnicę plamki w pikselach na 190 do 200, ustaw zakres średnic na 32 i ustaw średnicę przyrostu w pikselach na osiem. Ustaw dolne i górne limity DSM na zero i 62, sąsiednią odległość na 100, a odchylenie odejmowania na zero. Uruchom algorytm DSM i zapisz dane wynikowe.Technika analizy DSM wykazała dobrą odtwarzalność w seryjnie rozcieńczonych próbkach egzosomów PANC-1 w zakresie od 0,24 do 1,2 mikrograma na mikrolitr. Zaobserwowano silną korelację liniową między reakcją rozpraszania z nanoprętów złota a stężeniem białka egzosomu. Istotną różnicę w liczebności egzosomów surowicy wyrażających biomarker EphA2 związany z rakiem zaobserwowano między pacjentami z rakiem trzustki a pacjentami zdrowymi.Począwszy od dodania środka blokującego, szybkie i dokładne pipetowanie ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia parowania próbek, zanieczyszczenia krzyżowego i zarysowania powierzchni szkiełka. Zgodnie z tą procedurą przeprowadzamy analizę statystyczną w celu zbadania korelacji między ekspresją interesującego nas biomarkera egzosomalnego a innym stadium badanej choroby. Po opracowaniu tej technologii jesteśmy w stanie znaleźć egzosomalne biomarkery dla wczesnego stadium raka trzustki.Obecnie rozszerzamy to odkrycie na inne rodzaje nowotworów i chorób zakaźnych. Zazwyczaj próbki obsługiwane w tym teście to albo próbki pacjentów, albo oczyszczone próbki egzosomów z linii komórek rakowych, które wymagają specjalnego szkolenia w zakresie bezpieczeństwa.

using-nanoplasmon-enhanced-scattering-low-magnification-microscope

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Egzosomy izolowane z plazmy mogą być używane jako nieinwazyjny i powtarzalny sposób wykrywania i śledzenia biomarkerów do wczesnego wykrywania i postępu choroby. Ten film opisuje protokół oddzielania egzosomów od próbek osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc, które można wykorzystać do ekstrakcji DNA i białek.

Izolacja egzosomów: technika oddzielania egzosomów od osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc

Ten film opisuje użycie mikroskopii ciemnego pola o małym powiększeniu do ilościowego oznaczania określonych egzosomów w próbkach biofluidycznych o małej objętości. Zidentyfikowane w ten sposób egzosomy mogą służyć jako potencjalne biomarkery raka.

Kwantyfikacja oparta na nanocząstkach sprzężonych z przeciwciałami przy użyciu mikroskopii ciemnego pola: procedura wychwytywania i ilościowego oznaczania określonych egzosomów z płynów ustrojowych

W tym artykule przedstawiono metodę izolacji egzosomów z krwi pełnej i dalszej analizy za pomocą śledzenia nanocząstek za pomocą półautomatycznego instrumentu. Prezentowana technologia zapewnia niezwykle czułą metodę wizualizacji i analizy cząstek w ciekłej zawiesinie.

Innowacyjna metoda kwantyfikacji egzosomów i pomiaru wielkości

Ten protokół opisuje możliwość przeprowadzenia profilowania miRNA w egzosomach, uwalnianych w osoczu pacjentów z NSCLC, za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji egzosomów z terapią proteinazą K i RNAza, w celu uniknięcia zanieczyszczenia krążącymi miRNA i oceny ich cech biomarkerów w NSCLC.

Egzosomalna analiza miRNA w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) za pomocą qPCR: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji

Ten protokół opisuje różne techniki niezbędne do transmisyjnej mikroskopii elektronowej, w tym barwienie ujemne, ultracienkie sekcje dla szczegółowej struktury i znakowanie immuno-złote w celu określenia pozycji określonych białek w egzosomach.

Przygotowanie próbek i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Rak jajnika tworzy przerzuty w całej jamie otrzewnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół tworzenia i stosowania nanosond rozpraszających Ramana z rezonansem wzmocnionym powierzchniowo, ukierunkowanych na receptor kwasu foliowego, które ujawniają te zmiany z wysoką swoistością za pomocą obrazowania ratiometrycznego. Nanosondy podaje się dootrzewnowo żywym myszom, a uzyskane obrazy dobrze korelują z histologią.

Nanosonda rezonansowa o zwiększonym rezonansie powierzchniowym i nanosonda rozpraszania Ramana do wykrywania mikroskopijnego raka jajnika poprzez celowanie w receptor kwasu foliowego

Egzosom to nowa generacja nośników leków. Opracowaliśmy protokół izolacji egzosomów o wysokiej wydajności i czystości dostarczania siRNA. Otorbiliśmy również znakowane fluorescencyjnie niespecyficzne siRNA do egzosomów i zbadaliśmy wychwyt komórkowy egzosomów obciążonych siRNA w komórkach nowotworowych.

Przygotowanie egzosomów do dostarczania siRNA do komórek nowotworowych

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tutaj opisujemy protokół dostarczania in vivo magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza przenoszących oligomery RNA do przerzutowego raka piersi w modelach zwierzęcych, zapewniając klinicznie realne podejście do terapeutycznego wyciszania onkogennych kwasów nukleinowych.

Monitorowanie akumulacji nanoleków w przerzutach mysiego raka piersi

Przedstawiamy tutaj protokół analizy pojedynczych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) za pomocą bezoznakowanego, powierzchniowego spektroskopii Ramana (SERS), umożliwiającej minimalnie inwazyjną diagnostykę chorób i ocenę sEV jako środków dostarczania terapii.

Badanie zastosowania powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania Ramana opartego na biosensowaniu poszczególnych sEV w diagnostyce chorób i terapii

Poznaj metodę nPES do szybkiej analizy biomarkerów egzosomów bez konieczności ich izolacji. Technika ta umożliwia ilościowe określenie egzosomów z małych próbek klinicznych, co znajduje zastosowanie w diagnostyce nowotworowej.

Wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego określenia egzosomów pochodzących z guza (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego określenia egzosomów pochodzących z guza

Przeglądaj więcej filmów