Wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego określenia egzosomów pochodzących z guza

Rozpraszanie wzmocnione nanoplazmonem (nPES) jest prostą i nieinwazyjną alternatywą dla biopsji chirurgicznej, która może pominąć czasochłonne i pracochłonne etapy oczyszczania egzosomów, rozszerzając zastosowanie analizy egzosomów na warunki kliniczne. Ten test nPES jest szybką procedurą analizy określonych biomarkerów na zewnętrznej błonie egzosomów, która nie wymaga oddzielnych etapów izolacji i oczyszczania. Do tego testu potrzebujemy tylko bardzo małej próbki klinicznej.

Dlatego ta metoda może rozszerzyć zastosowanie nPES na badanie genetycznie modyfikowanych modeli myszy lub PDX. W tym protokole jest kilka kroków, które mogą wydawać się zniechęcające. Jednak po kilku biegach treningowych każdy, kto ma podstawowe umiejętności w laboratorium mokrym, może nauczyć się skutecznie wykonywać nPES.

Aby rozpocząć procedurę, połącz 40 mikrolitrów zawiesiny nanoprętów złota funkcjonalizowanego NeutrAwidin z 200 mikrolitrami zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem o pH 7. Odwirować mieszaninę w temperaturze 8500 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut i usunąć supernatant. Powtórz ten proces prania jeszcze dwa razy, a następnie ponownie zawieś nanopręty w 40 mikrolitrach zimnego PBS.

Następnie do zawiesiny dodać 150 mikrolitrów zimnego PBS i 10 mikrolitrów roztworu 0,5 miligrama na mililitr odpowiednich biotynylowanych przeciwciał. Mieszaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby uzyskać złote pręty sprzężone z przeciwciałami. Umyj nanopręty trzykrotnie przez odwirowanie w 200-mikrolitrowych porcjach zimnego PBS w ilości 6500 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut każda.

Następnie ponownie zawieś umyte nanopręty sprzężone z przeciwciałami w 200 mikrolitrach zimnego PBS i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do 24 godzin. Aby rozpocząć przygotowanie szkiełka, rozcieńczyć pożądane przeciwciała wychwytujące egzosomy do 025 miligramów na mililitr w PBS. Odpipetować jeden mikrolitr tego roztworu do każdej studzienki szkiełka podstawowego poddanego działaniu białka A / G, pokrytego szkłem klasy optycznej.

Następnie przenieś szkiełko do pudełka nawilżającego, aby upewnić się, że studzienki nie wyschną podczas inkubacji. Inkubować szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby unieruchomić przeciwciała wychwytujące. Następnie odessać pozostały roztwór, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.

Umyj studzienki, dodając i zasysając trzykrotnie jeden mikrolitr PBS. Następnie szybko załaduj każdą studzienkę jednym mikrolitrem bufora blokującego na bazie PBS i inkubuj szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. W przypadku około 15 próbek musimy użyć pipety jednokanałowej, aby załadować bufor blokujący do 120 dołków w czasie krótszym niż pięć minut, aby uniknąć odparowania środka blokującego.

Rozpocznij przygotowywanie roztworu złotych nanoprętów sprzężonych z przeciwciałami podczas blokowania szkiełka. Na około 30 minut przed zakończeniem blokowania należy szybko rozmrozić próbki osocza lub surowicy w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Rozmrożone próbki należy mieszać wirowo przez 30 sekund, aby upewnić się, że zawiesiny są jednorodne.

Następnie odwirować próbki w temperaturze 500 razy g przez 15 minut, aby wytrącić agregaty białkowe i inne zanieczyszczenia. Przenieść 10-mikrolitrowe porcje supernatantu do świeżych probówek i rozcieńczyć jeden do jednego za pomocą PBS. Rozcieńczone próbki należy wymieszać przez delikatne wirowanie lub odwrócenie, w zależności od przypadku.

Po zakończeniu blokowania szkiełka należy zassać bufor blokujący i trzykrotnie przemyć studzienki porcjami PBS o pojemności jednego mikrolitra. Natychmiast załadować próbki do studzienek po jednym mikrolitrze na studzienkę i ośmiu powtórzeniach na próbkę. W ten sam sposób załaduj wzorce egzosomów do odpowiednich studzienek.

Inkubować szkiełko przez 12 do 18 godzin w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odessać studzienki i umyć każdą studzienkę raz jednym mikrolitrem PBS. Załaduj jeden mikrolitr zawiesiny złotego nanopręta sprzężonej z przeciwciałami do każdej studzienki i inkubuj szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Następnie odessać zawiesinę nanoprętów i myć szkiełko w PBS uzupełnionym 1%polisorbatem 20 przez 10 minut za pomocą mieszalnika. Następnie zassać studzienki i umyć szkiełko w wodzie dejonizowanej przez 10 minut na obrotowym mikserze. Usuń wodę i pozwól szkiełku wyschnąć na powietrzu na czystej szalce Petriego przed umieszczeniem szkiełka w mikroskopie ciemnego pola.

Ustaw odwrócony mikroskop wyposażony w kondensor zanurzeniowy w oleju w ciemnym polu, obiektyw 4x i zmotoryzowany stolik. Podłącz mikroskop do komputera za pomocą aparatu cyfrowego i otwórz oprogramowanie do obrazowania. Następnie umieść szkiełko z próbką do góry nogami na stoliku mikroskopu i nałóż niewielką kroplę olejku immersyjnego w miejscu, w którym soczewka skraplacza styka się ze szkiełkiem.

Wyświetl widok przez mikroskop w oprogramowaniu do obrazowania. Dobrze dostosuj czas ekspozycji do wzorca o wysokim stężeniu, aby upewnić się, że obraz nie będzie nasycony. Następnie otwórz narzędzie do skanowania dużych obrazów i ustaw powiększenie obiektywu na 10x.

Wybierz, aby zamknąć aktywną migawkę podczas ruchu stołu montażowego i odczekać 20 milisekund przed każdym zrobieniem zdjęcia. Ustaw nakładanie się ściegów na 20% i wybierz zszywanie za pomocą optymalnej ścieżki. Wybierz, aby utworzyć duży obraz ze skanu.

Ustaw aparat tak, aby ustawiał ostrość ręcznie na początku skanowania i włącz automatyczne ustawianie ostrości krok po kroku co 20 pól. Następnie wybierz ustawienie lewego, prawego, górnego i dolnego limitu dla docelowego pola skanowania i zdefiniuj obszar skanowania, przesuwając stolik mikroskopu do każdego z żądanych limitów. Następnie dostosuj ostrość, kondensor i oświetlenie obszaru, aby uzyskać wyraźny, dobrze oświetlony obraz.

Nazwij plik obrazu, który ma zostać utworzony, i rozpocznij skanowanie. Po zakończeniu otwórz obraz i zapisz go w skali 1/8. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu.

Następnie otwórz menu Wtyczki, kliknij DSM Scan, zdefiniuj liczbę kolumn i wierszy, ustaw procent zmiany rozmiaru na 25, ustaw średnicę plamki w pikselach na 190 do 200, ustaw zakres średnic na 32 i ustaw średnicę przyrostu w pikselach na osiem. Ustaw dolne i górne limity DSM na zero i 62, sąsiednią odległość na 100, a odchylenie odejmowania na zero. Uruchom algorytm DSM i zapisz dane wynikowe.

Technika analizy DSM wykazała dobrą odtwarzalność w seryjnie rozcieńczonych próbkach egzosomów PANC-1 w zakresie od 0,24 do 1,2 mikrograma na mikrolitr. Zaobserwowano silną korelację liniową między reakcją rozpraszania z nanoprętów złota a stężeniem białka egzosomu. Istotną różnicę w liczebności egzosomów surowicy wyrażających biomarker EphA2 związany z rakiem zaobserwowano między pacjentami z rakiem trzustki a pacjentami zdrowymi.

Począwszy od dodania środka blokującego, szybkie i dokładne pipetowanie ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia parowania próbek, zanieczyszczenia krzyżowego i zarysowania powierzchni szkiełka. Zgodnie z tą procedurą przeprowadzamy analizę statystyczną w celu zbadania korelacji między ekspresją interesującego nas biomarkera egzosomalnego a innym stadium badanej choroby. Po opracowaniu tej technologii jesteśmy w stanie znaleźć egzosomalne biomarkery dla wczesnego stadium raka trzustki.

Obecnie rozszerzamy to odkrycie na inne rodzaje nowotworów i chorób zakaźnych. Zazwyczaj próbki obsługiwane w tym teście to albo próbki pacjentów, albo oczyszczone próbki egzosomów z linii komórek rakowych, które wymagają specjalnego szkolenia w zakresie bezpieczeństwa.