Wizualizacja dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii ciemnego pola pojedynczych nanocząstek

Nasz protokół wykorzystuje analizę sprawdzania pojedynczych cząstek do monitorowania dynamiki, lokalizacji i orientacji oraz charakteryzuje dyfuzję złotych nanoprętów na błonach komórkowych. Za pomocą tej metody można uzyskać zarówno dynamikę translacyjną, jak i rotacyjną złotych nanoprętów, a także kompleksowo przeanalizować i zaprezentować dynamikę. Protokół ten może być potencjalnie wykorzystany do badania innych typów złożonych systemów biologicznych.

Zacznij od spalenia szkiełka nakrywkowego zanurzonego w etanolu na płomieniu i umieszczenia szkiełka nakrywkowego w naczyniu do hodowli komórkowych o wymiarach 35 na 10 milimetrów zawierającym dwa mililitry pożywki do hodowli komórkowych bez czerwieni fenolowej. Dodaj 50 mikrolitrów interesującej nas zawiesiny komórek na szkiełko nakrywkowe i delikatnie potrząsaj naczyniem w przód iw tył oraz w lewo i w prawo, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Umieść naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych na około 12 godzin, aż komórki osiągną 20 do 40% zbiegu przed dodaniem do naczynia 20 mikrolitrów złotych prętów pokrytych CTAB.

Po delikatnym potrząśnięciu w celu równomiernego rozprowadzenia nanoprętów na naczyniu, umieść naczynie w wilgotnej atmosferze na pięć minut. Pod koniec inkubacji powoli przenieś 100 mikrolitrów supernatantu z naczynia do rowka szkiełka podstawowego i ostrożnie umieść komórkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na rowku szkiełka, a następnie uszczelnij krawędź szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i pozwól lakierowi do paznokci wyschnąć przed umieszczeniem szkiełka na stoliku mikroskopu ciemnego pola. W celu śledzenia pojedynczych cząstek za pomocą mikroskopii ciemnego pola, umieść kroplę oleju na skraplaczu ciemnego pola zanurzonego w oleju i przekręć pokrętło, aż kondensator zetknie się ze szklanym szkiełkiem.

Umieść kroplę oleju na górnej części szkła nakrywkowego i obracaj pokrętłem ostrości, aż obiektyw zanurzeniowy 60X dotknie oleju. Włącz źródło światła i lekko przekręć pokrętło ostrości, aby ustawić ostrość płaszczyzny obrazowania. Następnie kliknij ikonę kamery w oprogramowaniu mikroskopu, aby nagrać próbkę obrazu rozpraszania światła w szeregach czasowych za pomocą kolorowej kamery CMOS i zapisać obraz w formacie TIFF.

Aby wyodrębnić pojedynczą długoterminową trajektorię, otwórz obraz w ImageJ i kliknij obraz, wpisz i 8-bitowy, aby przekonwertować obraz z trybu RGB na tryb 8-bitowy. Aby dostosować kontrast, kliknij obraz, dostosuj, kontrast jasności i ustaw parametry. Wybierz cząstkę docelową i użyj Control X, aby odciąć tło szeregów czasowych.

Kliknij wtyczki, klasyczny moduł śledzenia cząstek i moduł śledzenia cząstek, aby otworzyć okno wykrywania cząstek i łączenia cząstek, a następnie ustaw promień na sześć, punkt odcięcia na zero, a percentyl na 0,01%Ustaw zakres łącza na 10, a przemieszczenie na 10, a następnie kliknij przycisk OK, aby otworzyć okno wyników śledzenia cząstek, aby wyświetlić wyniki. Kliknij opcję Wizualizuj wszystkie trajektorie, aby sprawdzić wygenerowane trajektorie. Jeśli trajektoria wygenerowana przez oprogramowanie i trajektoria ruchu nanoprętów złota są zgodne, kliknij przycisk Zapisz pełny raport, aby zapisać wyniki.

Jeśli trajektoria wygenerowana przez oprogramowanie nie jest zgodna z trajektorią ruchu nanoprętów złota, kliknij przycisk połącz ponownie cząstki, aby ponownie połączyć wykryte cząstki o różnych parametrach zakresu połączeń i percentyla. Aby znaleźć środkową współrzędną piksela złotego nanopręta w każdej klatce zgodnie ze współrzędną XY, użyj współrzędnej xy. m, funkcja.

Aby wyznaczyć macierz trzy na trzy piksele, wyodrębnij dziewięć wartości intensywności rozpraszania kanałów czerwonego lub zielonego i oblicz wartość średnią, użyj funkcji rgextraction. m. Następnie użyj kąta biegunowego.

Funkcja m do obliczania kątów biegunowych przy użyciu dwukanałowej metody różnicowej. Aby obliczyć parametry dynamiczne przy użyciu formuł w tabeli, uruchom dwa skrypty analizy. Aby przeprowadzić wizualną analizę trajektorii, ustaw współrzędną X jako X, współrzędną Y jako Y, a czas jako Y, a następnie kliknij pozycję Wykres, punkt punktowy i mapa kolorów, ustaw parametry wykresu i dodaj kolorowy pasek.

Aby wygenerować wartości przedziału czasowego przemieszczenia średniokwadratowego, ustaw przedział czasu jako X, a przemieszczenie średnie kwadratowe jako Y.Kliknij wykres, punkt, analizę, dopasowanie, dopasowanie krzywej nieliniowej i otwarte okno dialogowe i ustaw parametry wykresu. W przypadku wielocząstkowej analizy statystycznej ustaw interesujące Cię parametry dynamiczne jako Y i kliknij wykres i histogram. Kliknij dwukrotnie histogram, aby ustawić rozmiar podziału lub liczbę podziałów, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.

Następnie dodaj kolumnę i ustaw parametry wykresu. W przypadku analizy szeregów czasowych ustaw czas jako X, a parametry szeregów czasowych jako Y.Kliknij wykres, wiele paneli i stos. W wyskakującym okienku wybierz linię i OK. Następnie ustaw parametry wykresu.

Podłużne maksimum plazmoniczne 40 na 85 nanometrów złotych prętów pokrytych CTAB wynosi około 650 nanometrów, a rezonans poprzeczny wynosi 520 nanometrów. Intensywność rozpraszania złotych nanoprętów pokrytych CTAB na błonach komórkowych U87 wykazuje typowy rozkład Gaussa o wąskiej szerokości zgodnej z szerokością złotych prętów pokrytych CTAB na szkle, co wskazuje, że złote nanopręty pokryte CTAB śledzone w tym eksperymencie są dobrze zdyspergowane. Jak pokazano, ponad 500 trajektorii złotych nanoprętów pokrytych CTAB można śledzić za pomocą mikroskopii ciemnego pola i można je podzielić na trajektorie dyfuzji dalekiego zasięgu i trajektorie dyfuzji ograniczonej.

Promień bezwładności wszystkich 500 trajektorii w tej reprezentatywnej analizie wykazał mały rozkład wartości ze średnim promieniem bezwładności wynoszącym 0,5 mikrometra, a maksymalne przemieszczenie było bardziej rozłożone przy małych wartościach. Jak wykazano w tej zespołowej analizie średniego kwadratowego przemieszczenia, złote pręty pokryte CTAB zwykle dyfundują z alfą około jednego. Rozkład gęstości współczynnika dyfuzji i alfa uzyskanego ze wszystkich trajektorii ujawnia jednak, że dynamika złotych nanoprętów wykazuje niejednorodny rozkład z ruchami superdyfuzji, Browna i subdyfuzji.

Ponadto analiza statystyczna pojedynczych cząstek i analiza parametrów szeregów czasowych mogą być wykorzystane do scharakteryzowania dwóch reprezentatywnych długoterminowych trajektorii ograniczonych i ruchomych. Konieczne jest podsumowanie i wyodrębnienie pojedynczej, nowatorskiej interpretacji danych z odczytu analizy śledzenia pojedynczej cząstki, ponieważ zazwyczaj istnieją pewne trudne kompromisy do podjęcia.