Name: Wizualizacja dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii ciemnego pola pojedynczych nanocząstek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metodę śledzenia pojedynczych nanocząstek do badania dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonach komórkowych przy użyciu mikroskopii ciemnego pola. Protokół umożliwia analizę zarówno translacyjnych, jak i rotacyjnych ruchów AuNRs.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin grantami o numerach 21425519, 91853105 i 21621003.

<ol><li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341(2019).</li>
<li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+of+nanoparticles%3A+journey+inside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li>
<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Particle+Tracking%3A+From+Theory+to+Biophysical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li>
<li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+connecting+the+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li>
<li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction%3A+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson%27s+fluid-mosaic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li>
<li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li>
<li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+of+membrane+organization%3A+composition%2C+regulation+and+roles+of+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li>
<li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li>
<li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914(2020).</li>
<li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li>
<li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387(2019).</li>
<li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177(2014).</li>
<li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+events%2C+one+quantum+dot+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li>
<li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li>
<li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li>
<li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie.+International+Ed.+in+English%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li>
<li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887(2017).</li>
<li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid%2Fsolid+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie.+International+Ed.+in+English%22%5BJournal%5D)">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li>
<li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li>
<li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion%3A+small+sample+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103(2015).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li>
<li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001(2018).</li>
<li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li>
<li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li>
<li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li>
<li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony protokół jest wykorzystywany do badania dynamiki AuNRs na błonie komórkowej. Protokół składa się z czterech części: obrazowania mikroskopowego, ekstrakcji danych, obliczania parametrów dynamicznych oraz metod analizy danych, przy czym każda z tych części jest elastyczna i uniwersalna. W związku z tym istnieje wiele możliwych zastosowań w przyszłości, na przykład badanie ruchu cząsteczek błonowych połączonych z NP na błonie, dynamika endocytozy receptorów znakowanych NP, dynamiczna analiza NP wewnątrzkomórko...

Dynamika nanocząsteczek (NPs) na membranie jest ściśle związana z procesem absorpcji komórkowej, co jest niezbędne do zrozumienia funkcji komórek, infekcji wirusowych lub bakteryjnych oraz rozwoju sztucznych nanomedycznych systemów dostarczania1,2. Technika śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) jest solidnym narzędziem do charakteryzowania heterogenicznych zachowań NPs3,4. Ogólnie rzecz biorąc, błona komórkowa jest płynna, co oznacza, że składniki, takie jak białka i lipidy, mogą poruszać się poprzecznie w płaszczyźnie błony plazmatycznej5,6,7. Czasoprzestrzenna złożoność organizacji i struktury błony może prowadzić do czasoprzestrzennej heterogeniczności interakcji między nanocząsteczkami a błoną. W związku z tym bezpośrednia wizualizacja ruchu nanocząstek na membranie wymaga zarówno wysokiej rozdzielczości przestrzennej, jak i czasowej.
Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząstek, która monitoruje lokalizację pojedynczych cząstek w żywych komórkach z rozdzielczością przestrzenną dziesiątek nanometrów i rozdzielczością czasową milisekund, została dobrze opracowana do badania dynamiki nanocząsteczek lub błon komórkowych8,9. Techniki obrazowania mikroskopowego oparte na fluorescencji stały się cennymi narzędziami do obserwacji nanocząsteczek w środowisku żywych komórek9,10,11,12. Na przykład mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem, która obrazuje cienkie warstwy (~100 nm) próbki na granicy substrat/roztwór z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, jest szeroko stosowana w badaniach dynamiki cząsteczek błonowych13,14. Jednak nieodłączne wady pojedynczych fluoroforów, takie jak niska intensywność i szybkie nieodwracalne fotowybielanie, zmniejszają dokładność i czas trwania śledzenia13. Dlatego niefluorescencyjne plazmoniczne nanocząsteczki, które zastępują sondy fluorescencyjne, przyciągają coraz większą uwagę w długoterminowych badaniach obrazowych ze względu na ich unikalne właściwości optyczne15. Opierając się na sygnałach rozpraszania plazmonicznych sond NP, do badania mechanizmu procesów biologicznych wykorzystano kilka rodzajów technologii obrazowania mikroskopem optycznym, takich jak mikroskopia ciemnego pola (DFM)16, mikroskopia rozpraszania interferometrycznego (iSCAT) class<="xref">17 i mikroskopia kontrastowa z interferencją różnicową (DICM)18. Ponadto dynamikę ruchu i obrotu AuNR można uzyskać za pomocą DFM i DICM18,19,20,21,22. Zazwyczaj w eksperymencie SPT ruch obiektu jest rejestrowany przez mikroskop optyczny, a następnie analizowany za pomocą metod analizy SPT3. Trajektorie czasowo-rozdzielcze i kąty orientacji generowane przez poszczególne nanocząstki są zwykle stochastyczne i niejednorodne, dlatego konieczne jest przedstawienie obfitych informacji dynamicznych za pomocą różnych metod analizy.
Tutaj udostępniamy zintegrowany protokół, który monitoruje dynamikę AuNR na błonie komórkowej za pomocą DFM, wyodrębnia lokalizację i orientację AuNR za pomocą ImageJ i MATLAB oraz charakteryzuje dyfuzję AuNR za pomocą metod analizy SPT. W ramach demonstracji pokazujemy tutaj, jak wykorzystać protokół SPT do wizualizacji dynamiki niezmodyfikowanych AuNR (CTAB-AuNRs, syntetyzowanych przez cząsteczkę bromku amonu cetyltrimetyloamoniowego jako środka ochronnego) na błonie komórkowej U87 MG. Wykazano, że CTAB-AuNR mogą adsorbować białka w środowisku biologicznym, przemieszczać się po błonie komórkowej, a następnie wchodzić do komórek2,20,22. Komórka U87 MG jest najczęstszym i najbardziej złośliwym nowotworem ośrodkowego układu nerwowego, a jego receptory błonowe są nieprawidłowo wyrażane. Receptory błonowe mogą wchodzić w interakcje z białkami na AuNR, które wpływają na dynamikę AuNR. Nasz protokół ma ogólne zastosowanie do innych eksperymentów SPT w dziedzinie biologii.

<table><tbody><tr><td>Złote nanopręty powlekane CTAB (CTAB-AuNRs)</td> <td>Nanoseedz</td><td>NR-40-650</td><td>85 nm * 40 nm</td></tr><tr><td>Kolorowa kamera CMOS</td><td>Olympus</td><td>DP74</td><td>Japonia</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Citoglas</td><td>z10212222C</td><td>22*22 mm</td></tr><tr><td>Mikroskopia ciemnego pola</td><td>Mikroskop pionowy</td><td>Nikon</td><td>80i</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi</td><td>National Institutes of Health</td><td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td><td>dystrybucja ImageJ</td></tr><tr><td>Rowkowana szklana prowadnica</td><td>Marka żagla</td><td>7103</td><td>Pojedyncza wklęsła</td></tr><tr><td>Obraz J</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.52 j</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2019b</td><td></td></tr><tr><td>Kod</td><td></td><td></td> MATLAB <td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td></tr><tr><td>Minimalna ilość pożywki niezbędnej (MEM)</td><td>Gibco</td><td>10-010-CVR</td><td>z czerwienią fenolową</td></tr><tr><td>Minimalna pożywka niezbędna (MEM)</td><td>Gibco</td><td>51200038</td><td>bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Pochodzenie</td><td>OriginLab</td><td>Origin Pro 2018C</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe naczynia do hodowli komórkowych</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa hodowla komórkowa naczynia</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35*10 mm</td></tr><tr><td>U87 MG</td><td>komórka American Type Culture Collection</td><td>ATCC HTB-14</td><td>ludzka pierwotna linia komórkowa glejaka</td></tr></tbody></table>

wizualizacja dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii ciemnego pola pojedynczych nanocząstek

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Analiza dynamiki dyfuzyjnej nanocząsteczek na błonie komórkowej odgrywa znaczącą rolę w lepszym zrozumieniu procesu absorpcji komórkowej i dostarcza teoretycznych podstaw do racjonalnego projektowania dostarczania nanoleków. Analiza śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) może zbadać położenie i orientację poszczególnych nanocząstek na błonie komórkowej oraz ujawnić ich stany translacyjne i rotacyjne. W tym artykule pokazujemy, jak wykorzystać tradycyjną mikroskopię ciemnego pola do monitorowania dynamiki nanoprętów złota (AuNR) na żywej błonie komórkowej. Pokazujemy również, jak wyodrębnić lokalizację i orientację AuNR za pomocą ImageJ i MATLAB oraz jak scharakteryzować stany dyfuzyjne AuNR. Analiza statystyczna setek cząstek pokazuje, że pojedyncze AuNR wykonują ruchy Browna na powierzchni błony komórkowej U87 MG. Jednak indywidualna analiza długiej trajektorii pokazuje, że AuNR mają dwa wyraźnie różne typy stanów ruchu na błonie, a mianowicie transport dalekiego zasięgu i uwięzienie na ograniczonym obszarze. Nasze metody SPT mogą być potencjalnie wykorzystane do badania powierzchniowej lub wewnątrzkomórkowej dyfuzji cząstek w różnych komórkach biologicznych i mogą stać się potężnym narzędziem do badania złożonych mechanizmów komórkowych.

W protokole zastosowano niemodyfikowane CTAB-AuNRs o wymiarach 40 x 85 nm. Jak pokazano na Rysunku 2B, ich podłużne maksimum plazmoniczne wynosi ~650 nm (obszar czerwony), a rezonans poprzeczny znajduje się przy 520 nm (obszar zielony). Wcześniejsze publikacje wykazały, że właściwości optyczne (takie jak intensywność LSPR) plazmonicznych AuNRs zmieniają się znacząco wraz z ich średnicą20,22. Na Rysunku 2C</strong...

Tutaj pokazujemy użycie tradycyjnej mikroskopii ciemnego pola do monitorowania dynamiki nanoprętów złota (AuNR) na błonie komórkowej. Lokalizacja i orientacja pojedynczych AuNR są wykrywane za pomocą ImageJ i MATLAB, a stany dyfuzyjne AuNR są charakteryzowane przez analizę śledzenia pojedynczych cząstek.

Wizualizacja dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii ciemnego pola pojedynczych nanocząstek

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Nasz protokół wykorzystuje analizę sprawdzania pojedynczych cząstek do monitorowania dynamiki, lokalizacji i orientacji oraz charakteryzuje dyfuzję złotych nanoprętów na błonach komórkowych. Za pomocą tej metody można uzyskać zarówno dynamikę translacyjną, jak i rotacyjną złotych nanoprętów, a także kompleksowo przeanalizować i zaprezentować dynamikę. Protokół ten może być potencjalnie wykorzystany do badania innych typów złożonych systemów biologicznych.Zacznij od spalenia szkiełka nakrywkowego zanurzonego w etanolu na płomieniu i umieszczenia szkiełka nakrywkowego w naczyniu do hodowli komórkowych o wymiarach 35 na 10 milimetrów zawierającym dwa mililitry pożywki do hodowli komórkowych bez czerwieni fenolowej. Dodaj 50 mikrolitrów interesującej nas zawiesiny komórek na szkiełko nakrywkowe i delikatnie potrząsaj naczyniem w przód iw tył oraz w lewo i w prawo, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Umieść naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych na około 12 godzin, aż komórki osiągną 20 do 40% zbiegu przed dodaniem do naczynia 20 mikrolitrów złotych prętów pokrytych CTAB.Po delikatnym potrząśnięciu w celu równomiernego rozprowadzenia nanoprętów na naczyniu, umieść naczynie w wilgotnej atmosferze na pięć minut. Pod koniec inkubacji powoli przenieś 100 mikrolitrów supernatantu z naczynia do rowka szkiełka podstawowego i ostrożnie umieść komórkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na rowku szkiełka, a następnie uszczelnij krawędź szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i pozwól lakierowi do paznokci wyschnąć przed umieszczeniem szkiełka na stoliku mikroskopu ciemnego pola. W celu śledzenia pojedynczych cząstek za pomocą mikroskopii ciemnego pola, umieść kroplę oleju na skraplaczu ciemnego pola zanurzonego w oleju i przekręć pokrętło, aż kondensator zetknie się ze szklanym szkiełkiem.Umieść kroplę oleju na górnej części szkła nakrywkowego i obracaj pokrętłem ostrości, aż obiektyw zanurzeniowy 60X dotknie oleju. Włącz źródło światła i lekko przekręć pokrętło ostrości, aby ustawić ostrość płaszczyzny obrazowania. Następnie kliknij ikonę kamery w oprogramowaniu mikroskopu, aby nagrać próbkę obrazu rozpraszania światła w szeregach czasowych za pomocą kolorowej kamery CMOS i zapisać obraz w formacie TIFF.Aby wyodrębnić pojedynczą długoterminową trajektorię, otwórz obraz w ImageJ i kliknij obraz, wpisz i 8-bitowy, aby przekonwertować obraz z trybu RGB na tryb 8-bitowy. Aby dostosować kontrast, kliknij obraz, dostosuj, kontrast jasności i ustaw parametry. Wybierz cząstkę docelową i użyj Control X, aby odciąć tło szeregów czasowych.Kliknij wtyczki, klasyczny moduł śledzenia cząstek i moduł śledzenia cząstek, aby otworzyć okno wykrywania cząstek i łączenia cząstek, a następnie ustaw promień na sześć, punkt odcięcia na zero, a percentyl na 0,01%Ustaw zakres łącza na 10, a przemieszczenie na 10, a następnie kliknij przycisk OK, aby otworzyć okno wyników śledzenia cząstek, aby wyświetlić wyniki. Kliknij opcję Wizualizuj wszystkie trajektorie, aby sprawdzić wygenerowane trajektorie. Jeśli trajektoria wygenerowana przez oprogramowanie i trajektoria ruchu nanoprętów złota są zgodne, kliknij przycisk Zapisz pełny raport, aby zapisać wyniki.Jeśli trajektoria wygenerowana przez oprogramowanie nie jest zgodna z trajektorią ruchu nanoprętów złota, kliknij przycisk połącz ponownie cząstki, aby ponownie połączyć wykryte cząstki o różnych parametrach zakresu połączeń i percentyla. Aby znaleźć środkową współrzędną piksela złotego nanopręta w każdej klatce zgodnie ze współrzędną XY, użyj współrzędnej xy. m, funkcja.Aby wyznaczyć macierz trzy na trzy piksele, wyodrębnij dziewięć wartości intensywności rozpraszania kanałów czerwonego lub zielonego i oblicz wartość średnią, użyj funkcji rgextraction. m. Następnie użyj kąta biegunowego.Funkcja m do obliczania kątów biegunowych przy użyciu dwukanałowej metody różnicowej. Aby obliczyć parametry dynamiczne przy użyciu formuł w tabeli, uruchom dwa skrypty analizy. Aby przeprowadzić wizualną analizę trajektorii, ustaw współrzędną X jako X, współrzędną Y jako Y, a czas jako Y, a następnie kliknij pozycję Wykres, punkt punktowy i mapa kolorów, ustaw parametry wykresu i dodaj kolorowy pasek.Aby wygenerować wartości przedziału czasowego przemieszczenia średniokwadratowego, ustaw przedział czasu jako X, a przemieszczenie średnie kwadratowe jako Y.Kliknij wykres, punkt, analizę, dopasowanie, dopasowanie krzywej nieliniowej i otwarte okno dialogowe i ustaw parametry wykresu. W przypadku wielocząstkowej analizy statystycznej ustaw interesujące Cię parametry dynamiczne jako Y i kliknij wykres i histogram. Kliknij dwukrotnie histogram, aby ustawić rozmiar podziału lub liczbę podziałów, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.Następnie dodaj kolumnę i ustaw parametry wykresu. W przypadku analizy szeregów czasowych ustaw czas jako X, a parametry szeregów czasowych jako Y.Kliknij wykres, wiele paneli i stos. W wyskakującym okienku wybierz linię i OK. Następnie ustaw parametry wykresu.Podłużne maksimum plazmoniczne 40 na 85 nanometrów złotych prętów pokrytych CTAB wynosi około 650 nanometrów, a rezonans poprzeczny wynosi 520 nanometrów. Intensywność rozpraszania złotych nanoprętów pokrytych CTAB na błonach komórkowych U87 wykazuje typowy rozkład Gaussa o wąskiej szerokości zgodnej z szerokością złotych prętów pokrytych CTAB na szkle, co wskazuje, że złote nanopręty pokryte CTAB śledzone w tym eksperymencie są dobrze zdyspergowane. Jak pokazano, ponad 500 trajektorii złotych nanoprętów pokrytych CTAB można śledzić za pomocą mikroskopii ciemnego pola i można je podzielić na trajektorie dyfuzji dalekiego zasięgu i trajektorie dyfuzji ograniczonej.Promień bezwładności wszystkich 500 trajektorii w tej reprezentatywnej analizie wykazał mały rozkład wartości ze średnim promieniem bezwładności wynoszącym 0,5 mikrometra, a maksymalne przemieszczenie było bardziej rozłożone przy małych wartościach. Jak wykazano w tej zespołowej analizie średniego kwadratowego przemieszczenia, złote pręty pokryte CTAB zwykle dyfundują z alfą około jednego. Rozkład gęstości współczynnika dyfuzji i alfa uzyskanego ze wszystkich trajektorii ujawnia jednak, że dynamika złotych nanoprętów wykazuje niejednorodny rozkład z ruchami superdyfuzji, Browna i subdyfuzji.Ponadto analiza statystyczna pojedynczych cząstek i analiza parametrów szeregów czasowych mogą być wykorzystane do scharakteryzowania dwóch reprezentatywnych długoterminowych trajektorii ograniczonych i ruchomych. Konieczne jest podsumowanie i wyodrębnienie pojedynczej, nowatorskiej interpretacji danych z odczytu analizy śledzenia pojedynczej cząstki, ponieważ zazwyczaj istnieją pewne trudne kompromisy do podjęcia.

visualizing-diffusional-dynamics-gold-nanorods-on-cell-membrane-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii ciemnego pola (DFM) połączoną z analizą śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) w celu monitorowania interakcji plazmonicznych nanoprętów złota z błoną komórkową określonej linii komórkowej. Połączona analiza DFM i SPT pozwala na wizualizację ruchu nanoprętów przez błonę komórkową z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Mikroskopia ciemnego pola do wizualizacji dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów na błonie komórkowej

Opisujemy techniki mikrotworzenia cienkich warstw nanoporowatego złota za pomocą druku szablonowego i fotolitografii, a także metody hodowli komórek na mikrofabrykowanych wzorach. Ponadto opisano metody analizy obrazu w celu scharakteryzowania morfologii materiału i hodowanych komórek przy użyciu technik skaningowej mikroskopii elektronowej i fluorescencyjnej.

Mikrofabrykacja nanoporowatych wzorów złota do badań interakcji komórka-materiał

Używamy optycznego śledzenia plazmonicznych nanocząstek do badania i charakteryzowania częstotliwości ruchów organizmów wodnych.

Analiza ruchu naupliusa 'Artemia salina' za pomocą optycznego śledzenia nanocząstek plazmonicznych

Drożdże, Saccharomyces cerevisiae, były kluczowym organizmem modelowym do identyfikacji i badania genów regulujących biogenezę i funkcje układu endosomalnego. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół specyficznego znakowania przedziałów endosomalnych do badań ultrastrukturalnych.

Znakowanie nanozłotem układu endosomalnego drożdży do analiz ultrastrukturalnych

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Ten protokół opisuje, jak wykorzystać przejściowe ogrzewanie związane z optyczną absorpcją nanoprętów złota do stymulowania różnicowania i wewnątrzkomórkowej aktywności wapnia w komórkach neuronalnych. Wyniki te potencjalnie otwierają nowe zastosowania w protezach neuronalnych i podstawowych badaniach w neurobiologii.

Stymulacja optyczna komórek neuronalnych wspomagana złotem nanoprętami

Pokazujemy przygotowanie i zajmujemy się wykonalnością nośników komórkowych zawierających złote nanopręty do fotoakustycznego obrazowania raka.

Przygotowanie i analiza fotoakustyczna nośników komórkowych zawierających nanopręty złota

Plazmoniczne nanopręty złota mogą być uwięzione w cieczach i obracane z częstotliwością kHz za pomocą pęsety optycznej o polaryzacji kołowej. Wprowadzenie narzędzi do analizy dynamiki Browna i spektroskopii rozpraszania światła prowadzi do powstania potężnego systemu do badań i zastosowań w wielu dziedzinach nauki.

Budowa i działanie napędzanego światłem układu silnika obrotowego Gold Nanorod

Analiza średniego kwadratu (iMSD) wyprowadzona z obrazowania jest stosowana do makropinosomów, aby podkreślić ich wewnętrzną, ewoluującą w czasie naturę pod względem właściwości strukturalnych i dynamicznych. Makropinosomy są następnie porównywane z granulkami wydzielniczymi insuliny (ISG) jako odniesienie dla struktur subkomórkowych o niezmiennych w czasie średnich właściwościach strukturalnych/dynamicznych.

Badanie właściwości strukturalnych i dynamicznych transportujących nanostruktur subkomórkowych za pomocą spektroskopii fluktuacji czasoprzestrzennej

Obecny protokół opisuje technologię znakowania za pomocą klonowalnego mikroskopu elektronowego do wykrywania białek znakowanych metalotioneiną w komórkach za pomocą nowatorskiej techniki syntezy nanocząstek złota opartej na mechanizmie tłumienia autonukleacji.

Bezpośrednia synteza widocznych dla EM-widocznych nanocząstek złota w komórkach do analizy lokalizacji białek z dobrze zachowaną ultrastrukturą

Plazmoniczne pęsety wykorzystują zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonów w nanostrukturach złota, aby uwięzić pojedyncze nanocząsteczki, w tym białka, w polu optycznym o skali nanometrowej. Zmiany w rozproszonym sygnale ujawniają obecność białka i dynamikę konformacyjną, umożliwiając monitorowanie bez modyfikacji fluoroforu lub wiązania powierzchni.

Monitorowanie dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek za pomocą plazmonicznej pęsety

Poznaj metodę śledzenia pojedynczych nanocząstek do badania dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonach komórkowych przy użyciu mikroskopii ciemnego pola. Protokół umożliwia analizę zarówno translacyjnych, jak i rotacyjnych ruchów AuNRs.

Wizualizacja dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii ciemnego pola pojedynczych nanocząstek (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów złota na błonie komórkowej przy użyciu mikroskopii ciemnego pola pojedynczych nanocząstek

Przeglądaj więcej filmów