Analiza śledzenia nanocząstek w celu ilościowego określenia i określenia wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Wyniki NTA są bardzo podatne na stronniczość operatora. Protokół ten pokazuje wpływ zmienionych parametrów NTA na uzyskane wyniki. Ustandaryzowana metoda pomoże zwiększyć rygor i powtarzalność analizy NTA.

Analiza próbki w kuwecie pozwala na uchwycenie statystycznie losowej próbki w każdym filmie. Skutkuje to bardziej powtarzalnymi danymi i wizualizacją cząstek w szerokim zakresie rozmiarów. Ponieważ uzyskanie próbki w zalecanym zakresie stężeń cząstek może być trudne, należy wykonać rozcieńczanie seryjne w celu określenia idealnego współczynnika rozcieńczenia.

Procedurę zademonstruje Kungheng Cai, doktorant z laboratorium Anthony'ego Ferrante. Aby przygotować kuwetę do analizy śledzenia nanocząstek, przykryj przestrzeń roboczą niestrzępiącym się materiałem, aby zapobiec przedostawaniu się włókien do kuwet. Zakładając rękawiczki, umieść kuwetę zawierającą mieszadło na magnetycznym przyrządzie do kuwety.

Za pomocą narzędzia hakowego umieść wkładkę w kuwecie tak, aby wycięcie wkładki było widoczne z przodu kuwety. Za pomocą pipety powoli dodaj od 400 do 500 mikrolitrów oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do kuwety przez otwór we wkładce i wymieszaj próbkę, delikatnie pipetując bez wprowadzania pęcherzyków powietrza, a następnie zakryj kuwetę, w razie potrzeby wystukując pęcherzyki i użyj niestrzępiącej się szmatki do wytarcia zewnętrznej powierzchni kuwety. Aby przeanalizować stężenie cząstek w rozcieńczalniku lub próbce, włącz komputerową stację roboczą i przyrząd, a następnie uruchom program do analizy śledzenia cząstek.

Po wyświetleniu monitu kliknij NTA i otwórz kartę nagrywania. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby wypełnić wszystkie niezbędne informacje o próbce. W przypadku analizy śledzenia EV należy ustawić rozcieńczalnik na PBS.

Zasolenie automatycznie wypełni się do 9%Aby uzyskać stężenie rozcieńczalnika lub cząstek próbki, otwórz pokrywę instrumentu i zdejmij nasadkę ochronną zakrywającą miejsce, w którym zostanie umieszczona kuweta. Załaduj kuwetę do instrumentu we właściwej orientacji, tak aby wycięcie wkładki było skierowane w stronę aparatu i załóż nasadkę i pokrywę instrumentu. Kliknij strzałkę przesyłania strumieniowego, aby włączyć kamerę, a następnie kliknij strzałkę w strzałkę w strzałkę, aby rozwinąć ustawienia nagrywania.

Dostosuj ostrość, aż stosunkowo małe cząstki będą wyraźnie widoczne. Aby ustawić analizę dla małej kwantyfikacji EV, ustaw liczbę klatek na sekundę na 30 klatek na sekundę, ekspozycję na 15 milisekund, czas mieszania na pięć sekund, czas oczekiwania na trzy sekundy, moc niebieskiego, zielonego i czerwonego lasera odpowiednio na 210, 12 i 8 miliwatów, klatki na film na 300, a wzmocnienie na 30 decybeli. Dostosuj ostrość, aż stosunkowo małe cząstki będą wyraźnie widoczne.

Zwiększenie powiększenia i/lub wzmocnienia może pomóc w skupieniu cząstek. Ale jeśli zwiększysz wzmocnienie, pamiętaj, aby ustawić je na 30 decybeli przed nagrywaniem. Gdy cząsteczki są ostre, ustaw powiększenie na 0.5X, aby zaoszczędzić przepustowość i zapobiec utracie klatek, a następnie kliknij nagrywanie, aby rozpocząć nagrywanie wideo.

Gdy pojawi się monit informujący, że filmy zostały nagrane, kliknij OK, aby zakończyć nagrywanie i wybierz kartę procesu. Jeśli podczas nagrywania w dowolnym filmie widoczne były bardzo duże cząsteczki, przejdź do katalogu nagranych filmów i usuń wszelkie problematyczne filmy przed przetworzeniem. Zaznacz pole wyboru wyłącz zastępowanie wykrywania dźwięku i ustaw średnicę elementu na 30.

Kliknij przycisk Proces, aby rozpocząć przetwarzanie wideo i wyświetlić wykres dystrybucji na żywo. Po zakończeniu przetwarzania kliknij przycisk OK i wybierz kartę wykresu. W przypadku pojazdów elektrycznych wyświetl wykres główny jako krzemionkę w pojemniku na kłody.

Inne funkcje wykresu, takie jak zmiana osi x w celu ustawienia obszaru integracji utworzonej figury, można dostosować. Aby utworzyć raport z wynikami w formacie PDF, kliknij przycisk raportu. Wyświetlana będzie średnia, mediana, wielkość trybu i stężenie dostosowane do współczynnika rozcieńczenia i szerokości rozkładu.

NTA rozcieńczalnika należy wykonać przed każdą próbką, tak aby można było odjąć stężenie tej próby ślepej od stężenia cząstek próbki EV. Aby wyczyścić kuwety po analizie, opróżnij kuwetę i całkowicie napełnij kuwety 10 do 15 razy wodą dejonizowaną, a trzy razy 70 do 100% etanolem, aby usunąć pozostałą próbkę. Osusz zewnętrzną część kuwet niestrzępiącą się ściereczką z mikrofibry i osusz wnętrze miotełką do kurzu na sprężone powietrze.

Aby oczyścić wkładki i mieszadła, umieść materiały w szklanej fiolce scyntylacyjnej zawierającej od 70 do 100% etanolu i energicznie potrząśnij fiolką. Następnie opłucz wkładki i kostki mieszania w wodzie dejonizowanej, wstrząsając, jak pokazano, i wysusz je za pomocą niestrzępiących się szmatek. Po wysuszeniu należy natychmiast umieścić wszystkie czyste składniki w magazynie do czasu następnej analizy.

Przed wykonaniem analizy kalibracja przyrządu została przetestowana przy użyciu kulek polistyrenowych, aby zapewnić poprawność pozyskanych danych. Jak zaobserwowano, instrument do śledzenia cząstek dokładnie podał rozmiar 100-nanometrowych kulek manodyspersyjnych, ale tylko dokładnie podał rozmiar 400-nanometrowych kulek. W związku z tym ustawienia instrumentu dla tego protokołu były dokładniejsze dla mniejszych cząstek, bliższych 100 nanometrów.

Korzystając z tych ustawień, zgłoszone stężenie cząstek skaluje się odpowiednio ze współczynnikiem rozcieńczenia, co pokazuje, że przyrząd może dokładnie wykryć stężenie cząstek w różnych rozcieńczeniach z niewielką zmiennością między replikantami technicznymi. Optymalne rozcieńczenie dla 4,41 razy 10 do 10 cząstek na mililitr próbki EV pochodzącej z tkanki myszy określono na zakres od 1 000 do 3 000. W tej analizie zwiększenie wzmocnienia zwiększyło czułość kamery, co pozwoliło na zwiększenie wizualizacji większej liczby mniejszych cząstek.

Zwiększenie mocy niebieskiego lasera z 70 do 210 miliwatów przy jednoczesnym utrzymaniu stałej mocy zielonego i czerwonego lasera przesunęło zgłoszoną średnią wielkość cząstek ze 122 do 105 nanometrów i zwiększyło zgłoszone całkowite stężenie cząstek z 1,1 razy 10 do ósmego, do 1,7 razy 10 do ósmego. Zwiększenie mocy czerwonego lasera zwiększyło zgłaszaną średnią wielkość cząstek ze 175 do 246 nanometrów i zmniejszyło zgłaszane całkowite stężenie cząstek. Zwiększenie mocy zielonego lasera skutkowało spadkiem zgłaszanej średniej wielkości cząstek i wzrostem raportowanego całkowitego stężenia cząstek.

Znalezienie odpowiedniego rozcieńczenia, aby umieścić próbkę w optymalnym zakresie wykrywania, może wymagać kilku prób dla każdej próbki. Czyszczenie kuwety wymaga również bardzo ostrożnego obchodzenia się z nią. Zalecamy stosowanie więcej niż jednej metody ortogonalnej do pomiarów wielkości cząstek i stężenia EV.

W celu scharakteryzowania EV można również przeprowadzić dynamiczne rozpraszanie światła, rezystancyjne wykrywanie impulsów, transmisyjną mikroskopię elektronową i interferometryczne obrazowanie odbicia pojedynczych cząstek.