Name: Analiza śledzenia nanocząstek w celu ilościowego określenia i określenia wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj standaryzowaną metodę analizy śledzenia nanocząstek do ilościowego oznaczania i określania wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Protokół zwiększa rygorystyczność i powtarzalność badań nad EK.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Dziękujemy Jeffreyowi Bodycombowi, Ph.D. z HORIBA Instruments Incorporated za pomoc w kalibracji instrumentu.

<ol><li>Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li>
<li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.+Association+of+plasma+membrane+activities+with+released+vesicles+%28exosomes%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).</a> The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).</li>
<li>Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).</li>
<li>Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+shuffling+intercellular+messages%3A+for+good+or+for+bad%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li>
<li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2, 1800021(2018).</li>
<li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methods+of+choice+for+extracellular+vesicles+%28EVs%29+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li>
<li>Erdbrügger, U., Lannigan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+challenges+of+extracellular+vesicle+detection%3A+A+comparison+of+different+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Extracellular+Vesicles%3A+General+Methodologies+and+Latest+Trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).</li>
<li>Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, San Diego, California. 3-10 (2015).</li>
<li>Desdín-Micó, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion & Migration. 11, 127-134 (2017).</li>
<li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+extract+induced+exosome+release+is+mediated+by+depletion+of+exofacial+thiols+and+can+be+inhibited+by+thiol-antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants.</a> Free Radical Biology & Medicine. 108, 334-344 (2017).</li>
<li>Saeed-Zidane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+exosome+mediated+molecular+defense+mechanism+in+bovine+granulosa+cells+exposed+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress.</a> PloS One. 12, 0187569(2017).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress-dependent+autophagy+component+release+via+extracellular+nanovesicles+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells.</a> ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).</li>
<li>King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+enhancement+of+exosome+release+by+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 421(2012).</li>
<li>Bonzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+particulate+matter+exposure+induces+extracellular+vesicle+release+in+overweight+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+Research%22%5BJournal%5D)">Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects.</a> Environment Research. 155, 228-234 (2017).</li>
<li>Neri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particulate+matter+induces+prothrombotic+microparticle+shedding+by+human+mononuclear+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells.</a> Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).</li>
<li>Flaherty, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li>
<li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li>
<li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li>
<li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li>
<li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 525-534 (2012).</li>
<li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+%28NTA%29+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li>
<li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016(2019).</li>
<li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li>
<li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li>
<li>Maguire, C. M., Rösslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li>
<li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBohren%2C+CF+%22Absorption+and+Scattering+of+Light+by+Small+Particles%22">Absorption and Scattering of Light by Small Particles</a>. , John Wiley & Sons. (1983).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy zadeklarowali, że nie ma konfliktu interesów.

W niniejszej pracy prezentujemy protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w celu jednoczesnego pomiaru rozkładu wielkości szerokiego zakresu rozmiarów cząstek oraz pomiaru całkowitego stężenia EV w próbce polidyspersyjnej. W badaniu tym jako źródło EV wykorzystano tkankę tłuszczową okołojadrową myszy oraz ludzką osocze. Niemniej jednak do analizy NTA można wykorzystać również EV wyizolowane z innych tkanek lub płynów biologicznych, takich jak surowica, mocz, ślina, mleko kobiece, p...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to małe (0,03-2 µm) pęcherzyki otoczone błoną, wydzielane przez niemal wszystkie typy komórek1. W zależności od mechanizmu uwalniania i wielkości są one często nazywane „egzosomami”, „mikropęcherzykami” lub „ciałkami apoptotycznymi”2. Choć początkowo sądzono, że EVs stanowią jedynie sposób usuwania odpadów z komórki w celu utrzymania homeostazy3, obecnie wiadomo, że mogą one również uczestniczyć w komunikacji międzykomórkowej poprzez transport materiału molekularnego – w tym DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipidów i białek4,5 – oraz że są ważnymi regulatorami prawidłowej fizjologii, jak również procesów patologicznych1,5,6,7,8.
Istnieje wiele różnych metod izolacji i ilościowego oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), które opisano w innych opracowaniach9,10,11,12. Zastosowany protokół izolacji, jak również źródło EV, mogą mieć ogromny wpływ na wydajność i czystość otrzymanych pęcherzyków. Nawet wirowanie różnicowe, długo uważane za „złoty standard” izolacji egzosomów, może charakteryzować się znaczną zmiennością, co wpływa na uzyskaną populację EV i analizy następcze13. W związku z tym różnorodność metodologii izolacji i oznaczania EV utrudnia porównywanie, reprodukowanie i interpretowanie wyników eksperymentów opisanych w literaturze14. Co więcej, wydzielanie EV może być regulowane przez warunki komórkowe lub różne czynniki zewnętrzne. Sugerowano, że EV odgrywają rolę w utrzymaniu homeostazy komórkowej, chroniąc komórki przed stresem wewnątrzkomórkowym15, ponieważ kilka badań wykazało, że stres komórkowy stymuluje sekrecję EV. Na przykład zwiększone wydzielanie EV raportowano po poddaniu komórek działaniu hipoksji, stresu retikulum endoplazmatycznego, stresu oksydacyjnego, stresu mechanicznego, ekstraktu z dymu papierosowego oraz zanieczyszczeń powietrza pyłami zawieszonymi16,17,18,19,20,21,22. Wykazano również, że wydzielanie EV ulega modyfikacjom in vivo; myszy poddane diecie wysokotłuszczowej lub szesnastogodzinnemu postowi wydzielały więcej EV pochodzących z adipocytów23. Aby zbadać, czy konkretna terapia lub warunki zmieniają wydzielanie EV, należy dokładnie określić liczbę pęcherzyków. Ocena rozkładu wielkości EV może również wskazywać na dominujące podkomórkowe pochodzenie EV (np. fuzja późnych endosomów/ciał wielopęcherzykowych z błoną plazmatyczną w przeciwieństwie do pączkowania błony plazmatycznej)24. Istnieje zatem potrzeba zastosowania wiarygodnych metod do dokładnego pomiaru całkowitego stężenia i rozkładu wielkości badanego preparatu EV.
Szybką i wysoce czułą metodą wizualizacji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) w roztworze jest analiza śledzenia nanocząsteczek (NTA). Szczegółowe wyjaśnienie zasad tej metody oraz porównanie z alternatywnymi metodami oceny wielkości i stężenia EVs zostało opisane wcześniej25,26,27,28. W skrócie, podczas pomiaru NTA, EVs są wizualizowane dzięki światłu rozproszonemu w momencie ich naświetlania wiązką lasera. Rozproszone światło jest skupiane przez mikroskop na kamerze, która rejestruje ruch cząsteczek. Oprogramowanie NTA śledzi przypadkowy ruch termiczny każdej cząsteczki, znany jako ruchy Browna, aby wyznaczyć współczynnik dyfuzji, który służy do obliczenia wielkości każdej cząsteczki przy użyciu równania Stokesa-Einsteina. NTA zostało po raz pierwszy zastosowane do pomiaru EVs w próbce biologicznej w 2011 roku25. Do niedawna istniały tylko dwie główne firmy oferujące komercyjne instrumenty NTA29, aż do wprowadzenia urządzenia ViewSizer 3000 (w dalszej części tekstu zwanego instrumentem do śledzenia cząsteczek), które wykorzystuje kombinację nowatorskich rozwiązań sprzętowych i programistycznych w celu przełamania istotnych ograniczeń innych technik NTA.
Przyrząd do śledzenia cząstek charakteryzuje nanocząstki w próbkach ciekłych poprzez analizę ich ruchu Browna oraz charakteryzuje większe cząstki o rozmiarach mikronowych poprzez analizę sedymentacji grawitacyjnej. Unikalny system optyczny tego przyrządu, obejmujący iluminację wielospektralną z trzema laserowymi źródłami światła (o długościach fal 450 nm, 520 nm i 635 nm), pozwala badaczom na jednoczesną analizę szerokiego zakresu rozmiarów cząstek (np. egzosomów, mikropęcherzyków). Schemat budowy przyrządu przedstawiono na Rysunku 1.
W niniejszej pracy demonstrujemy, jak przeprowadzić pomiary rozkładu wielkości i stężenia wyizolowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) myszy i ludzi przy użyciu nowoczesnego urządzenia do analizy śledzenia nanocząstek (NTA).
<img alt="Schemat układu optycznego dla mikroskopii wielokolorowej z długościami fal 450-635 nm do przechwytywania obrazu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: System optyczny urządzenia do śledzenia cząstek. Urządzenie NTA oświetla cząstki za pomocą trzech laserów o następujących długościach fal: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Nagrywanie wideo rozproszonego światła z poszczególnych cząstek jest wykrywane i śledzone przez cyfrową kamerę wideo zorientowaną pod kątem 90° względem kuwety. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>1X dPBS</td><td>VWR</td><td>02-0119-1000</td><td>Do rozcieńczania próbek</td></tr><tr><td>100 nm standard kulki</td><td>Thermo Scientific</td><td>3100A</td><td>Do testowania kalibracji ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>standard koralików 400 nm</td><td>Thermo Scientific</td><td>3400A</td><td>Do testowania kalibracji ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy</td><td>Amicon</td><td>UFC901024</td><td>Do filtrowania rozcieńczalnika PBS</td></tr><tr><td>Probówki zbiorcze, 2 ml</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td>Do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ludzkiego osocza</td></tr><tr><td>Miotełka do kurzu sprężonego powietrza</td><td>DustOff</td><td>DPSJB-12</td><td>Do czyszczenia kuwet</td></tr><tr><td>Wkładka kuwetowa</td><td>HORIBA</td><td></td> <td>Scientific-Dostarczana przy zakupie przyrządu do kuwety ViewSizer 3000</td></tr><tr><td></td><td>HORIBA</td> <td>Scientific-Do</td> <td>wyrównywania mieszadła magnetycznego podczas umieszczania wkładek wewnątrz kuwety; Dostarczane przy zakupie ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td><td>VWR</td><td>02-0201-1000</td><td>Do czyszczenia kuwet</td></tr><tr><td>Komputer stacjonarny z monitorem, klawiaturą, myszą i wszystkimi niezbędnymi</td><td>Dostarczany przez firmę Dell</td><td></td> <td>przy zakupie ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Etanol (70-100%)</td><td>Millipore Sigma-Do</td><td></td> <td>czyszczenia kuwet</td></tr><tr><td>ExoQuick ULTRA</td><td>System Biosciences</td><td>EQULTRA-20A-1</td><td>Do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ludzkiego osocza</td></tr><tr><td>Szklane fiolki scyntylacyjne z pokrywkami</td><td>Thermo Scientific</td><td>B780020</td><td>Do czyszczenia kuwet</td></tr><tr><td>"Haczyk" Narzędzie</td><td>Excelta-Dostarczane</td><td></td> <td>przy zakupie ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>Niestrzępiąca się ściereczka z mikrofibry</td><td>Texwipe</td><td>TX629</td><td>Do czyszczenia kuwet i pokrywania powierzchni roboczej</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363344</td><td>Do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ludzkiego osocza</td></tr><tr><td>Mieszadło</td><td>Sp Scienceware</td><td>F37119-0005</td><td></td></tr><tr><td>Suprasil Kuweta kwarcowa z nasadką</td><td>Agilent Technologies</td><td>AG1000-0544</td><td>Początkowo dostarczana z zakupem ViewSizer 3000</td></tr><tr><td>ViewSizer 3000</td><td>HORIBA Naukowy</td><td></td> <td>instrument do śledzenia nanocząstek</td></tr></tbody></table>

analiza śledzenia nanocząstek w celu ilościowego określenia i określenia wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Fizjologiczne i patofizjologiczne role pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) stają się coraz bardziej rozpoznawalne, co sprawia, że pole EV jest szybko rozwijającym się obszarem badań. Istnieje wiele różnych metod izolacji pojazdów elektrycznych, z których każda ma odrębne zalety i wady, które wpływają na wydajność i czystość pojazdów elektrycznych. W związku z tym scharakteryzowanie przygotowania EV wyizolowanego z danego źródła za pomocą wybranej metody jest ważne dla interpretacji dalszych wyników i porównania wyników między laboratoriami. Istnieją różne metody określania wielkości i ilości EV, które mogą być zmieniane w zależności od stanu chorobowego lub w odpowiedzi na warunki zewnętrzne. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) jest jedną z najważniejszych technologii stosowanych do wysokoprzepustowej analizy poszczególnych pojazdów elektrycznych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół kwantyfikacji i określania wielkości EV wyizolowanych z mysiej tkanki tłuszczowej okołogonadalnej i ludzkiego osocza przy użyciu przełomowej technologii NTA, stanowiącej duży postęp w tej dziedzinie. Wyniki pokazują, że metoda ta może dostarczyć powtarzalnych i ważnych danych dotyczących całkowitego stężenia cząstek i rozkładu wielkości dla pojazdów elektrycznych wyizolowanych z różnych źródeł przy użyciu różnych metod, co zostało potwierdzone za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Dostosowanie tego instrumentu do NTA zaspokoi potrzebę standaryzacji metod NTA w celu zwiększenia rygoru i odtwarzalności w badaniach nad pojazdami elektrycznymi.

Przed niniejszą demonstracją przeprowadzono test kalibracji instrumentu w celu zapewnienia poprawności uzyskanych danych, mierząc rozkład wielkości standardowych kulek polistyrenowych. Przebadano rozkład wielkości kulek o średnicy 100 nm i 400 nm, korzystając z domyślnych parametrów rejestracji oraz ustawień przetwarzania zalecanych w niniejszym protokole (Rysunek 8).
Dla standardu kulek polistyrenowych 100 nm zmierzono stężenie 4,205 x 107 cząsteczek/m...

Pokazujemy, jak używać nowatorskiego instrumentu do analizy śledzenia nanocząstek, aby oszacować rozkład wielkości i całkowite stężenie cząstek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyizolowanych z mysiej tkanki tłuszczowej okołokomórkowej i ludzkiego osocza.

Analiza śledzenia nanocząstek w celu ilościowego określenia i określenia wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Wyniki NTA są bardzo podatne na stronniczość operatora. Protokół ten pokazuje wpływ zmienionych parametrów NTA na uzyskane wyniki. Ustandaryzowana metoda pomoże zwiększyć rygor i powtarzalność analizy NTA.Analiza próbki w kuwecie pozwala na uchwycenie statystycznie losowej próbki w każdym filmie. Skutkuje to bardziej powtarzalnymi danymi i wizualizacją cząstek w szerokim zakresie rozmiarów. Ponieważ uzyskanie próbki w zalecanym zakresie stężeń cząstek może być trudne, należy wykonać rozcieńczanie seryjne w celu określenia idealnego współczynnika rozcieńczenia.Procedurę zademonstruje Kungheng Cai, doktorant z laboratorium Anthony'ego Ferrante. Aby przygotować kuwetę do analizy śledzenia nanocząstek, przykryj przestrzeń roboczą niestrzępiącym się materiałem, aby zapobiec przedostawaniu się włókien do kuwet. Zakładając rękawiczki, umieść kuwetę zawierającą mieszadło na magnetycznym przyrządzie do kuwety.Za pomocą narzędzia hakowego umieść wkładkę w kuwecie tak, aby wycięcie wkładki było widoczne z przodu kuwety. Za pomocą pipety powoli dodaj od 400 do 500 mikrolitrów oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do kuwety przez otwór we wkładce i wymieszaj próbkę, delikatnie pipetując bez wprowadzania pęcherzyków powietrza, a następnie zakryj kuwetę, w razie potrzeby wystukując pęcherzyki i użyj niestrzępiącej się szmatki do wytarcia zewnętrznej powierzchni kuwety. Aby przeanalizować stężenie cząstek w rozcieńczalniku lub próbce, włącz komputerową stację roboczą i przyrząd, a następnie uruchom program do analizy śledzenia cząstek.Po wyświetleniu monitu kliknij NTA i otwórz kartę nagrywania. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby wypełnić wszystkie niezbędne informacje o próbce. W przypadku analizy śledzenia EV należy ustawić rozcieńczalnik na PBS.Zasolenie automatycznie wypełni się do 9%Aby uzyskać stężenie rozcieńczalnika lub cząstek próbki, otwórz pokrywę instrumentu i zdejmij nasadkę ochronną zakrywającą miejsce, w którym zostanie umieszczona kuweta. Załaduj kuwetę do instrumentu we właściwej orientacji, tak aby wycięcie wkładki było skierowane w stronę aparatu i załóż nasadkę i pokrywę instrumentu. Kliknij strzałkę przesyłania strumieniowego, aby włączyć kamerę, a następnie kliknij strzałkę w strzałkę w strzałkę, aby rozwinąć ustawienia nagrywania.Dostosuj ostrość, aż stosunkowo małe cząstki będą wyraźnie widoczne. Aby ustawić analizę dla małej kwantyfikacji EV, ustaw liczbę klatek na sekundę na 30 klatek na sekundę, ekspozycję na 15 milisekund, czas mieszania na pięć sekund, czas oczekiwania na trzy sekundy, moc niebieskiego, zielonego i czerwonego lasera odpowiednio na 210, 12 i 8 miliwatów, klatki na film na 300, a wzmocnienie na 30 decybeli. Dostosuj ostrość, aż stosunkowo małe cząstki będą wyraźnie widoczne.Zwiększenie powiększenia i/lub wzmocnienia może pomóc w skupieniu cząstek. Ale jeśli zwiększysz wzmocnienie, pamiętaj, aby ustawić je na 30 decybeli przed nagrywaniem. Gdy cząsteczki są ostre, ustaw powiększenie na 0.5X, aby zaoszczędzić przepustowość i zapobiec utracie klatek, a następnie kliknij nagrywanie, aby rozpocząć nagrywanie wideo.Gdy pojawi się monit informujący, że filmy zostały nagrane, kliknij OK, aby zakończyć nagrywanie i wybierz kartę procesu. Jeśli podczas nagrywania w dowolnym filmie widoczne były bardzo duże cząsteczki, przejdź do katalogu nagranych filmów i usuń wszelkie problematyczne filmy przed przetworzeniem. Zaznacz pole wyboru wyłącz zastępowanie wykrywania dźwięku i ustaw średnicę elementu na 30.Kliknij przycisk Proces, aby rozpocząć przetwarzanie wideo i wyświetlić wykres dystrybucji na żywo. Po zakończeniu przetwarzania kliknij przycisk OK i wybierz kartę wykresu. W przypadku pojazdów elektrycznych wyświetl wykres główny jako krzemionkę w pojemniku na kłody.Inne funkcje wykresu, takie jak zmiana osi x w celu ustawienia obszaru integracji utworzonej figury, można dostosować. Aby utworzyć raport z wynikami w formacie PDF, kliknij przycisk raportu. Wyświetlana będzie średnia, mediana, wielkość trybu i stężenie dostosowane do współczynnika rozcieńczenia i szerokości rozkładu.NTA rozcieńczalnika należy wykonać przed każdą próbką, tak aby można było odjąć stężenie tej próby ślepej od stężenia cząstek próbki EV. Aby wyczyścić kuwety po analizie, opróżnij kuwetę i całkowicie napełnij kuwety 10 do 15 razy wodą dejonizowaną, a trzy razy 70 do 100% etanolem, aby usunąć pozostałą próbkę. Osusz zewnętrzną część kuwet niestrzępiącą się ściereczką z mikrofibry i osusz wnętrze miotełką do kurzu na sprężone powietrze.Aby oczyścić wkładki i mieszadła, umieść materiały w szklanej fiolce scyntylacyjnej zawierającej od 70 do 100% etanolu i energicznie potrząśnij fiolką. Następnie opłucz wkładki i kostki mieszania w wodzie dejonizowanej, wstrząsając, jak pokazano, i wysusz je za pomocą niestrzępiących się szmatek. Po wysuszeniu należy natychmiast umieścić wszystkie czyste składniki w magazynie do czasu następnej analizy.Przed wykonaniem analizy kalibracja przyrządu została przetestowana przy użyciu kulek polistyrenowych, aby zapewnić poprawność pozyskanych danych. Jak zaobserwowano, instrument do śledzenia cząstek dokładnie podał rozmiar 100-nanometrowych kulek manodyspersyjnych, ale tylko dokładnie podał rozmiar 400-nanometrowych kulek. W związku z tym ustawienia instrumentu dla tego protokołu były dokładniejsze dla mniejszych cząstek, bliższych 100 nanometrów.Korzystając z tych ustawień, zgłoszone stężenie cząstek skaluje się odpowiednio ze współczynnikiem rozcieńczenia, co pokazuje, że przyrząd może dokładnie wykryć stężenie cząstek w różnych rozcieńczeniach z niewielką zmiennością między replikantami technicznymi. Optymalne rozcieńczenie dla 4,41 razy 10 do 10 cząstek na mililitr próbki EV pochodzącej z tkanki myszy określono na zakres od 1 000 do 3 000. W tej analizie zwiększenie wzmocnienia zwiększyło czułość kamery, co pozwoliło na zwiększenie wizualizacji większej liczby mniejszych cząstek.Zwiększenie mocy niebieskiego lasera z 70 do 210 miliwatów przy jednoczesnym utrzymaniu stałej mocy zielonego i czerwonego lasera przesunęło zgłoszoną średnią wielkość cząstek ze 122 do 105 nanometrów i zwiększyło zgłoszone całkowite stężenie cząstek z 1,1 razy 10 do ósmego, do 1,7 razy 10 do ósmego. Zwiększenie mocy czerwonego lasera zwiększyło zgłaszaną średnią wielkość cząstek ze 175 do 246 nanometrów i zmniejszyło zgłaszane całkowite stężenie cząstek. Zwiększenie mocy zielonego lasera skutkowało spadkiem zgłaszanej średniej wielkości cząstek i wzrostem raportowanego całkowitego stężenia cząstek.Znalezienie odpowiedniego rozcieńczenia, aby umieścić próbkę w optymalnym zakresie wykrywania, może wymagać kilku prób dla każdej próbki. Czyszczenie kuwety wymaga również bardzo ostrożnego obchodzenia się z nią. Zalecamy stosowanie więcej niż jednej metody ortogonalnej do pomiarów wielkości cząstek i stężenia EV.W celu scharakteryzowania EV można również przeprowadzić dynamiczne rozpraszanie światła, rezystancyjne wykrywanie impulsów, transmisyjną mikroskopię elektronową i interferometryczne obrazowanie odbicia pojedynczych cząstek.

nanoparticle-tracking-analysis-for-quantification-size-determination

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym artykule przedstawiono metodę izolacji egzosomów z krwi pełnej i dalszej analizy za pomocą śledzenia nanocząstek za pomocą półautomatycznego instrumentu. Prezentowana technologia zapewnia niezwykle czułą metodę wizualizacji i analizy cząstek w ciekłej zawiesinie.

Innowacyjna metoda kwantyfikacji egzosomów i pomiaru wielkości

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe odgrywają ważną rolę w procesach fizjologicznych i patologicznych, w tym w krzepnięciu, reakcjach immunologicznych i raku, lub jako potencjalne środki terapeutyczne w dostarczaniu leków lub medycynie regeneracyjnej. Protokół ten przedstawia metody kwantyfikacji i charakterystyki wielkości izolowanych i nieizolowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w różnych płynach przy użyciu przestrajalnego rezystancyjnego wykrywania impulsów.

Kwantyfikacja i profilowanie wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą przestrajalnego rezystancyjnego wykrywania impulsów

W tym protokole opisujemy kompletny proces szybkiej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od ludzkiej krwi pełnej i charakteryzacji specyficznych markerów za pomocą analizy nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności i mogą być dostosowane do supernatantów z hodowli komórkowych.

Szybka charakterystyka oparta na fluorescencji pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkiej krwi z analizą śledzenia nanocząstek

Protokół opisuje powtarzalną metodę przeznaczoną do użycia z supernatantami do hodowli komórkowych do wykrywania epitopów powierzchniowych na małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV). Wykorzystuje specyficzną immunoprecypitację EV za pomocą kulek sprzężonych z przeciwciałami, które rozpoznają antygen powierzchniowy CD9, CD63 i CD81. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) jest powszechnie stosowaną metodą do charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. W artykule przedstawiono parametry eksperymentalne i kontrolne NTA oraz jednolitą metodę analizy i charakterystyki próbek i rozcieńczalników niezbędną do uzupełnienia wytycznych zaproponowanych przez MISEV2018 i EV-TRACK w zakresie odtwarzalności między laboratoriami.

Poprawa odtwarzalności w celu uzyskania minimalnych informacji do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Wytyczne z 2018 r. dotyczące analizy śledzenia nanocząstek

Najnowsza generacja narzędzi do charakteryzacji EV jest w stanie przeprowadzić pojedynczą analizę EV dla wielu parametrów jednocześnie. Cytometria nanoprzepływowa mierzy wszystkie cząstki biologiczne większe niż 45 nm bez znakowania i identyfikuje specyficzne cechy subpopulacji za pomocą różnych technik znakowania fluorescencyjnego.

Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ten protokół zapewnia szybką i dostosowaną do wielkości metodę izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez optymalizację wielkości dyszy rozpylającej powietrze, ciśnienia płynu w osłonie, ciśnienia przepływu próbki, napięcia, wzmocnienia i parametrów progu wyzwalania.

Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ten artykuł opisuje metodologię izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkiego osocza (EV) i przedstawia przebieg pracy do bezznacznikowej analizy proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Poznaj standaryzowaną metodę analizy śledzenia nanocząstek do ilościowego oznaczania i określania wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Protokół zwiększa rygorystyczność i powtarzalność badań nad EK.

Analiza śledzenia nanocząstek w celu ilościowego określenia i określenia wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów