Szybka charakterystyka oparta na fluorescencji pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkiej krwi z analizą śledzenia nanocząstek
January 7th, 2019
W tym protokole opisujemy kompletny proces szybkiej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od ludzkiej krwi pełnej i charakteryzacji specyficznych markerów za pomocą analizy nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności i mogą być dostosowane do supernatantów z hodowli komórkowych.
Metoda ta rozwiązuje powszechny problem w terenie i zapewnia kompletny przepływ pracy w celu szybkiej izolacji i charakterystyki pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z określonymi markerami będącymi przedmiotem zainteresowania. Analiza śledzenia nanocząstek jest metodą półautomatyczną. Wykorzystuje właściwości rozpraszania światła i ruchów Browna do analizy rozkładu wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.
Procedurę zademonstruje Vera Schmidt, doktorantka z naszego laboratorium. Aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, po zebraniu dwóch mililitrów ludzkiej krwi pełnej do probówek oddzielających surowicę, pozwól próbkom koagulować przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed oddzieleniem komórek od surowicy przez odwirowanie. Przenieś jeden mililitr surowicy z każdej próbki do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek reakcyjnych w celu odwirowania w celu usunięcia płytek krwi i przenieś 100 mikrolitrów osocza ubogiego w płytki krwi do nowych 1,5-mililitrowych probówek reakcyjnych.
Następnie dodaj 25 mikrolitrów roztworu wytrącającego egzosomy do plazmy i dokładnie zwiruj próbki. Po 30-minutowej inkubacji na lodzie zebrać pęcherzyki zewnątrzkomórkowe przez odwirowanie. Granulka pojawi się w kolorze beżowym lub białym.
Odessać supernatant i ponownie odwirować próbkę. Następnie usuń wszystkie transy płynu i ponownie zawieś granulat w 100 mikrolitrach PBS. Aby zabarwić błony komórkowe pęcherzyków, dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny EV do 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu barwnika etanolowego PKH67 i dokładnie wymieszaj.
Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej w ciemności rozcieńczyć 50 mikrolitrów barwionej zawiesiny pęcherzyków zewnątrzkomórkowych 2,5 mililitra wody destylowanej w 15-mililitrowej stożkowej probówce, dokładnie mieszając. Aby oznaczyć pęcherzyki przeciwciałami, rozcieńczyć od 10 do 20 mikrolitrów niebarwionej zawiesiny pęcherzyków zewnątrzkomórkowych 50 mikrolitrami wody destylowanej w 1,5 mililitrowej probówce reakcyjnej, dokładnie mieszając. Dodaj 2,5 do pięciu mikrolitrów interesującego przeciwciała do probówki reakcyjnej, dokładnie mieszając, na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej w ciemności.
Następnie przenieść 50 mikrolitrów oznakowanych pęcherzyków do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów, zawierającej odpowiednią eksperymentalną objętość wody destylowanej, z dokładnym wymieszaniem, jak wskazano w tabeli. Przed analizą barwionych lub znakowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych należy najpierw przesunąć filtr fluorescencyjny na ścieżkę optyczną mikroskopu i kamery, a następnie uruchomić program, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie w celu automatycznej implementacji. Na karcie Cell Check (Sprawdzanie komórek) wybierz właściwy numer komórki do pomiaru fluorescencji oraz pozycję odniesienia dla optyki, aby potwierdzić, że laser i mikroskop są w tym samym ognisku.
Za pomocą strzykawki przepłukać kanał komórkowy 10 mililitrami wody destylowanej, uważając, aby cela pomiarowa była wolna od pęcherzyków powietrza i aby pęcherzyki powietrza nie były wstrzykiwane do systemu. Następnie rozcieńczyć 10 mikrolitrów 200-nanometrowych cząstek polistyrenu znakowanych fluorescencyjnie w 990 mikrolitrach wody destylowanej i dodać 10 mikrolitrów tej zawiesiny cząstek do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów wody destylowanej. Następnie wstrzyknij 2,5 mililitra pierwszego rozcieńczonego roztworu cząstek do kanału komórkowego i kliknij Optymalizuj ostrość, aby dostosować kamerę.
Aby zmierzyć próbkę, należy kilkakrotnie przepłukać kanał komórkowy 10 mililitrami wody destylowanej i wstrzyknąć barwioną zawiesinę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Korzystając z pozycji referencyjnej, dostosuj odpowiednie parametry akwizycji na karcie Sprawdzanie komórek, jak wskazano w tabeli. Aby określić optymalny zakres czułości, kliknij opcję Liczba cząstek w funkcji
Czułość, aby wyświetlić krzywą mierzonych cząstek na ekran dla różnych poziomów czułości. Dla parametru Migawka dostosuj czas, przez jaki aparat przepuszcza światło w określonym interwale. W polu Parametry po akwizycji wybierz minimalną jasność 20, minimalny rozmiar 20 nanometrów i maksymalny rozmiar pomiaru 500 nanometrów.
Zwróć uwagę na liczbę wykrytych cząstek w polu view wyświetlacza. Pasek rozpraszania powinien znajdować się w zakresie od zielonego do pomarańczowego, od 50 do 300 cząstek. Kliknij opcję Sprawdź dryft cząstek przy zerowym wolcie i otwórz kartę Pomiar.
Kliknij opcję Uruchom pobieranie wideo i ustaw liczbę eksperymentów na trzy do pięciu, a opóźnienie między eksperymentami na zero minut. Ustaw liczbę poszczególnych pozycji podobjętości na 11, a liczbę cykli pomiarowych na 10 w każdej pozycji pomiarowej, w której cząstki mają być analizowane. Następnie wybierz folder, utwórz nową nazwę pliku i kliknij przycisk OK, aby rozpocząć pomiar.
Na końcu analizy otwórz kartę Analiza, aby przejrzeć wyniki. Następnie sprawdź średnią liczbę cząstek na pozycję, całkowitą liczbę śledzonych cząstek i stężenie cząstek, szerokość rozkładu cząstek, wartość średniej i odchylenie standardowe. Użycie koralików fluorescencyjnych do regulacji i kalibracji pomiaru zapewnia optymalną czułość ustawienia wynoszącą 85%Korzystając z tych ustawień, kamera wyświetla ostry obraz, a powtarzające się pomiary wykazują niskie odchylenie standardowe.
Barwienie za pomocą zestawu łącznika komórek, który zawiera fluorescencyjny łącznik komórek, który zawiera zielony barwnik fluorescencyjny z długimi, alifatycznymi ogonami do lipidowych obszarów błony komórkowej, ujawnia silną korelację między czułością a liczbą mierzonych cząstek. Przeciwciało barwiące pęcherzyki zewnątrzkomórkowe przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania wskazuje na rozkład cząstek od 220 do 1 145 nanometrów, z maksymalną wielkością piku wynoszącą 541 nanometrów. Po barwieniu przeciwciałami w wodzie wolnej od pęcherzyków kontrolnych nie wykrywa się pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, do czułości bliskiej 100%Jeśli pomiar rozpoczyna się, gdy dryft jest większy niż 5 mikrometrów na sekundę, poszczególne powtórzenia wykazują wyraźne odchylenia.
Ważne jest, aby pamiętać, że stosowanie izotiocyjanianu fluoresceiny jako fluorochromu powoduje niedokładne i niepowtarzalne pomiary, ponieważ ten fluorofor jest podatny na szybkie fotowybielanie. Protokół ten jest odpowiedzią na wiodące zapotrzebowanie wielu badaczy w tej dziedzinie na szybką charakterystykę pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu określonych markerów. Pomimo tego, że w ciągu ostatniej dekady metody znacznie się poprawiły, nie ma jeszcze ustandaryzowanego protokołu analizy pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.
Niezależnie od przyszłego postępu badań nad biologią pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, metoda ta zapewnia szybki i wiarygodny protokół charakterystyki pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu określonych markerów. Ponieważ nasze obecne protokoły nie obejmują długiego czasu przetwarzania ani pracochłonnych etapów, nadają się również do dużej przepustowości próbek.
Przegląd
Ten protokół opisuje pełen przepływ pracy do szybkiego izolowania i charakteryzacji zewnątrzkomórkowych wezykuł z ludzkiej pełnej krwi. Metoda wykorzystuje fluorescencyjną analizę nanocząstek do oceny określonych markerów, wykazując wysoką powtarzalność i przystosowność dla supernatantów kultur komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Zewnątrzkomórkowe wezykuły
Tło
- Zewnątrzkomórkowe wezykuły odgrywają kluczową rolę w komunikacji międzykomórkowej.
- Izolowanie i charakteryzowanie tych wezykuł jest istotne dla zrozumienia ich funkcji.
- Obecne metody mogą brakować efektywności i powtarzalności.
- Ten protokół ma na celu rozwiązanie tych wyzwań.
Cel badania
- Dostarczenie niezawodnej metody izolowania zewnątrzkomórkowych wezykuł z ludzkiej krwi.
- Charakteryzowanie tych wezykuł za pomocą technik fluorescencyjnych.
- Poprawa zrozumienia biologii zewnątrzkomórkowych wezykuł.
Stosowane metody
- Zbieranie próbek pełnej ludzkiej krwi.
- Centryfugacja do oddzielania komórek od surowicy.
- Zastosowanie roztworu do osadzania egzosomów do izolowania wezykuł.
- Fluorescencyjne barwienie i analiza nanocząstek do charakteryzacji.
Główne wyniki
- Skuteczne izolowanie zewnątrzkomórkowych wezykuł z widocznym osiadkiem.
- Charakteryzacja wezykuł wykazała zakres wielkości i obecność określonych markerów.
- Wysoka powtarzalność pomiarów w wielu eksperymentach.
- Wykazana korelacja między barwieniem a czułością wykrywania cząstek.
Wnioski
- Protokół zapewnia solidną metodę analizy zewnątrzkomórkowych wezykuł.
- Wyniki wskazują, że metoda może być przystosowana dla różnych rodzajów próbek.
- To podejście zwiększa potencjał dla przyszłych badań w dziedzinie biologii zewnątrzkomórkowych wezykuł.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid fluorescence-based characterization of single extracellular vesicles (EVs) from human blood addresses a critical bottleneck in biomarker discovery and target validation workflows. By enabling reproducible, marker-specific analysis of EVs in clinically relevant fluids, the method supports early-stage mechanistic de-risking and improves predictive confidence in liquid biopsy applications. This capability enhances portfolio triage by providing quantitative, standardized data for go/no-go decisions in preclinical target programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through specific surface marker detection (e.g., CD63, CD9, vimentin, LAMP-1) on single EVs from human serum.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating fluorescence staining with particle detection sensitivity, supporting functional target validation.
- Predictive Value: High reproducibility across experiments, confirmed by orthogonal methods like Western blotting, increases confidence in early target selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantitative outputs including particle concentration, size distribution (220–1,145 nm), and mean/standard deviation metrics for downstream compound screening.
- Scalability: Semi-automated nanoparticle-tracking analysis with optimized acquisition parameters (e.g., 85% sensitivity, 20 nm minimum brightness) enables high sample throughput and platform reuse.
- Reproducibility: Consistent results across multiple experiments and sample types (serum, plasma, cell culture supernatants) support assay standardization in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Characterization of EVs from human blood provides a disease-relevant system for bridging discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Reliable detection of specific markers (e.g., via antibody staining) enables biomarker-aligned decision-making in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Avoids unreliable fluorophores (e.g., FITC) prone to photobleaching, ensuring data integrity for target mechanism studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for liquid biopsy and biomarker-driven programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling specific marker profiling of EVs isolated from human whole blood.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative EV characterization data (size, concentration, marker presence) for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates traceable particle measurements, distribution width, and sensitivity curves that allow cross-condition comparison and hit validation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of human-derived EVs and disease-relevant markers like vimentin and LAMP-1.
- Enterprise Reuse: Semi-automated workflow and adaptability to plasma, serum, and cell culture supernatants position the method as a scalable, reusable capability across teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reproducible, marker-specific single EV analysis.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and reduced hands-on time via semi-automated nanoparticle-tracking analysis.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in biomarker programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative EV marker data from human blood samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence staining, nanoparticle-tracking analysis, and EV isolation techniques.
- Dependent on instrumentation capable of fluorescence detection, light-scattering measurement, and automated video acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols (e.g., PKH67, antibody dilution) and acquisition parameters (sensitivity, shutter, subvolume positions).
- Adaptation considerations include adjusting antibody concentration (10–20 μL) and incubation time (30 min) for different markers across model systems.
- Practical limitation: Avoid fluorescein isothiocyanate (FITC) due to rapid photobleaching, which compromises measurement accuracy and reproducibility.
