Innowacyjna metoda kwantyfikacji egzosomów i pomiaru wielkości

Celem tej procedury jest analiza egzosomów według ich wielkości i ilościowe określenie ich za pomocą analizy śledzenia nanocząstek lub instrumentu NTA metodą półautomatyczną. Osiąga się to poprzez zastosowanie etapów centrowania różnicowego w celu uzyskania osadu egzosomu z ludzkiej krwi. Egzosomy są ponownie zawieszane w stężeniu, które jest z góry określone dla ilości początkowej plazmy, aby uzyskać odpowiednią intensywność rozpraszania.

Podczas NTA zawiesina jest następnie filtrowana w celu oddzielenia egzosomów od większych cząstek. Następnie przeprowadzana jest kalibracja przyrządu NTA przy użyciu zawiesiny kontrolnej zawierającej cząstki polistyrenu o wielkości 200 nanometrów. Roztwór egzosomu jest następnie wstrzykiwany do instrumentu NTA, a idealne ustawienie NTA jest wybierane poprzez wykonanie testu wstępnego przed wykonaniem testu końcowego.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują kwantyfikację wszystkich mierzonych cząstek i uszeregowanie cząstek według ich rozmiarów. Demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ roztwór i ustawienie dla każdego przygotowanego roztworu egzosomu muszą być wykonywane indywidualnie, aby uzyskać najlepsze wyniki. Mierzone egzosomy powinny mieć stężenie I, tak aby tryb podglądu na żywo wyświetlał około 600 cząstek na ekran.

Należy również wykonać test wstępny, aby znaleźć optymalny zakres czułości dla pomiaru. Wysokie ustawienie czułości prowadzi do wizualizacji większej liczby małych cząstek, a także zwiększa problemy związane z szumami tła. Procedura zostanie zademonstrowana przez Anto Maya, doktoranta z naszego laboratorium Aby rozpocząć przygotowanie egzosomu, zbierz pełną krew w trzech probówkach z cytrynianem za pomocą nakłucia dożylnego, co daje w sumie dziewięć mililitrów.

Następnie wlej krew do 15-mililitrowej probówki Falcona, odwiruj próbkę w temperaturze 1500 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zainicjować oddzielanie komórek od osocza. Przenieś powstający S do nowej 15-mililitrowej rurki Falcon. Następnie ponownie odwirować próbkę w temperaturze 2,800 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć wszystkie komórki z osocza.

Przenieś bezkomórkowe osocze lub CFP do probówek ultrawirówek w ilości jednego mililitra na probówkę. Następnie odwiruj CFP przy 100 000 G przez 90 minut w czterech stopniach Celsjusza, aby zubożyć egzosomy. Usunąć 900 mikrolitrów supernatantu i ponownie zawiesić osad w pozostałych 100 mikrolitrach w probówce do ultrawirowania.

Po dodaniu 900 mikrolitrów wirówki PBS uzyskuje się 100 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Tak jak poprzednio, usunąć 900 mikrolitrów środka leżącego na wznakę i ponownie zawiesić granulki z pozostałymi 100 mikrolitrami. Przenieś od pięciu do 20 mikrolitrów zawiesiny Resus do 40 mililitrów wody destylowanej.

Przefiltruj zawiesinę przez filtr 450 nanometrów, aby oddzielić egzosomy od większych cząstek. Użyj tej końcowej zawiesiny do pomiaru cząstek, aby użyć przyrządu do śledzenia cząstek. Najpierw uruchom program, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania.

Kliknij różne zakładki oprogramowania, aby przełączać się między nimi w całym protokole. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Aby automatycznie wdrożyć procedurę uruchamiania, zaznacz pola wyboru zarówno dla kontroli jakości komórki, jak i automatycznego wyrównania.

Każdy z tych kroków można powtórzyć oddzielnie, jeśli to konieczne, naciskając przycisk A lub B na karcie sprawdzania komórek. Umieść zlewkę pod portem wylotowym, aby zebrać roztwór odpadowy i nie wstrzykiwać pęcherzyków powietrza do systemu. Otwórz port wlotowy i perspektywiczny analizatora śledzenia nanocząstek lub przyrządu NTA i wstrzyknij 10 mililitrów wody destylowanej za pomocą strzykawki do kanału komórkowego przez port wlotowy.

Zamknij port wlotowy i wylotowy natychmiast po wstrzyknięciu ostatniej ilości wody. Upewnij się, że cela pomiarowa jest wolna od pęcherzyków powietrza. Przeprowadź kontrolę jakości ogniw, klikając na. Porządku.

Oprogramowanie wyświetli wynik jakości ogniwa po kilku sekundach, jeśli jakiekolwiek cząstki są nadal wizualizowane na ekranie podglądu na żywo oprogramowania lub jeśli wynik kontroli jakości jest tylko dobry lub zły, powtórz dystalne wstrzykiwanie wody, aż pozostałe cząstki zostaną usunięte z celi pomiarowej L. Ponadto, Powtórz ten krok po każdym pomiarze, aby uniknąć gromadzenia się cząstek. Następnie należy przygotować zawiesinę kontrolną zawierającą jednolite cząstki polistyrenu o wielkości 200 nanometrów. Aby wyrównać ogniska lasera i mikroskopu, dodaj jedną kroplę koncentratu zawiesiny dostarczonego przez producenta przyrządu do 500 mililitrów wody destylowanej, co daje wymagane stężenie, tak aby na ekranie w podglądzie na żywo wyświetlanych było 600 plus minus 100 cząstek.

Wstrzyknąć zawiesinę wyrównującą do przyrządu NTA, tak jak to ma miejsce w przypadku prasy do wody destylowanej. W porządku, aby rozpocząć również wyrównywanie, które jest zautomatyzowaną procedurą, dzięki której system automatycznie znajdzie optymalną pozycję dwóch ognisk. Gdy pojawi się monit informujący, że system jest teraz gotowy do eksperymentów, kliknij OK, aby rozpocząć pomiar.

Od czasu do czasu czyść kanał komórkowy ręcznie między eksperymentami, przepłukując komórkę 30% roztworem etanolu. Wyczyść kanał za każdym razem, gdy oprogramowanie wyświetla automatyczny raport o błędach. Aby wykonać pomiar systemu.

Najpierw przepłucz kanał wodą destylowaną przed każdym pomiarem próbki. Następnie wstrzyknąć zawiesinę egzosomu do kanału. Następnym krokiem jest dostosowanie głównych parametrów w oprogramowaniu, aby dostosować czułość.

Znajdź optymalny zakres czułości, klikając liczbę cząstek w funkcji czułości, aby wyświetlić krzywą mierzonych cząstek na ekran dla różnych poziomów czułości. Wybierz poziom czułości przed maksymalnym nachyleniem krzywej. Wyższy poziom czułości pozwala na wizualizację większej liczby małych cząstek, ale także zwiększa problemy związane z szumem tła.

Aby dostosować minimalną jasność, wybierz początkową jasność 20 dla pomiaru egzosomu. Aby użyć tej funkcji jako filtra, wyreguluj ten parametr w górę, aby wygasić cząsteczki silnie rozpraszające światło. Zmniejsz go, aby wzmocnić artefakty rozpraszania tygodniowego, bardzo jasność zgodnie z potrzebami przez cały eksperyment.

Następnie ustaw filtr cyfrowy, aby wyeliminować szum pikseli i niechciane rozproszenie nadwymiarowych cząstek. Regulując minimalny i maksymalny rozmiar, użyj zakresu od 10 do 500 pikseli do pomiaru egzosomów. Dostosuj migawkę, zmieniając czas otwarcia aparatu, ustawiając migawkę na 300, co odpowiada 3,3 milisekundy.

Aby dostosować parametry odczytu na żywo, przełącz się między trybem widoku cyfrowego i analogowego w dowolnym momencie, klikając przycisk obrazu na żywo. Przez cały czas trwania eksperymentu. Monitoruj pasek intensywności rozpraszania, który wyświetla stan nasycenia próbki jako wskaźnik oznaczony kolorem.

Nie analizuj egzosomów, jeśli pasek rozpraszania jest czerwony. Aby rozpocząć pomiar, kliknij zakładkę pomiaru. Wybierz ustawienia w tablicy opcji uruchamiania.

Przed każdą akwizycją wybierz test ruchu kontrolnego, powtórzony test dryfu cząstek, wybierz liczbę eksperymentów i opóźnienie czasowe między nimi. W razie potrzeby należy przeprowadzić kontrolę próbki. Na koniec kliknij przycisk uruchamiania pobierania wideo.

W nowym oknie zdefiniuj liczbę cykli oraz liczbę pozycji pomiarowych. Potwierdź minimalny czas trwania. Cząstka jest śledzona w celu zliczenia jej jako jednej pojedynczej cząstki.

Ustawiając rozdzielczość wideo, niższa rozdzielczość powoduje krótszy czas trwania śledzenia. Na koniec wybierz nazwę pliku i kliknij OK, aby rozpocząć pomiar. Krzywa liczby cząstek w funkcji czułości wyświetla cząstki w jednej pozycji w jednym momencie.

Podczas automatycznego skanowania czułości wartość czułości jest wybierana przed maksymalnym nachyleniem wykresu. Artefakty nie są eliminowane w tym eksperymencie testowym i mogą mieć wpływ na wykres. Wizualizacja cząstek na ekranie podglądu na żywo jest pomocna Aby ustawić odpowiednią wartość czułości.

Zbyt niska wartość prowadzi do wykrycia kilku cząstek. Podczas gdy zbyt wysoka wartość pokazuje słaby obraz, cząstki wysokiej jakości wydają się pojedynczymi kropkami dobrze odizolowanymi od siebie na optymalnym poziomie czułości. Zakładka wyników po pomiarze umożliwia odczyt parametrów, w tym całkowitej liczby śledzonych cząstek, średniej liczby cząstek na pozycję i stężenia cząstek, a także liczbowego stosunku wielkości cząstek do procentowej liczby cząstek.

Wykres obliczony po pomiarze przedstawia rozkład cząstek według wielkości. Ikony w trybie wyświetlania mogą być używane do zmiany ustawień wykresu. Istnieją również różne sposoby analizy egzosomów.

Ta metoda pokazuje bardzo prostą i elegancką metodę przeprowadzenia podobnej analizy metody w szybkim procesie w celu wygenerowania wyników w krótkim czasie. W celu porównania wielu próbek zalecamy utrzymanie tego samego poziomu rozcieńczenia dla wszystkich próbek. Wszystkie ustawienia akceptują czułość, a rozdzielczość wideo można później zmienić za pomocą zestawu kilku programów analitycznych.

W ten sposób analiza porównawcza danych uzyskanych w różnych eksperymentach dotyczących ilości i wielkości egzosomów staje się dostępna w sposób półautomatyczny.