Pobieranie próbek mikroekstrakcji do fazy stałej: technika ekstrakcji próbki z tkanek przeszczepu oparta na sondzie

Długotrwałe przechowywanie przeszczepu narządu wpływa na jego profil metaboliczny, który jest wskaźnikiem funkcji narządu i odrzucenia narządu we wczesnym stadium.

Aby wyizolować te metabolity, należy rozpocząć od pobrania cienkiej mikroekstrakcji do fazy stałej lub sondy SPME pokrytej biokompatybilnym sorbentem. Zanurz sondę w wodno-alkoholowym roztworze czyszczącym, aby nawodnić powlekany sorbent i poluzować wszelkie związane zanieczyszczenia.

Poruszyć sondę, aby usunąć zanieczyszczenia. Następnie umieść sondę w roztworze aktywacyjnym i ponownie zamieszaj. Substancje chemiczne zawarte w roztworze aktywacyjnym modyfikują powierzchnię sondy, zwiększając jej potencjał adsorpcyjny. Opłucz sondę wodą i wysterylizuj ją w celu usunięcia zanieczyszczeń mikrobiologicznych.

Teraz włóż sterylną i aktywowaną sondę do przeszczepu narządu tak, aby macierz tkankowa pokryła całą powierzchnię sorbentu. Materiał sorbentowy przyciąga z przeszczepu wolne metabolity polarne i niepolarne, umożliwiając adsorpcję na jego powierzchni. Schowaj sondę i spłucz ją wodą, aby usunąć wszelkie resztki tkanki.

Następnie umieść sondę w roztworze desorpcyjnym, który oddziałuje z zaadsorbowanymi metabolitami. Wstrząsnąć sondą, aby oddzielić i rozpuścić wychwycone metabolity w roztworze desorpcyjnym. Na koniec wyjmij sondę i przetwórz powstałą mieszaninę metabolitów do późniejszej analizy.

Zacznij od przygotowania mieszanki kondycjonującej składającej się z 1 do 1 metanolu i wody. Odpipetować 1 mililitr roztworu do każdej szklanej fiolki o pojemności 2 mililitrów i umieścić jedną sondę w każdej fiolce. Mieszać fiolki na mieszadle wirowym z prędkością 1 200 obr./min przez 1 godzinę. Następnie przepłucz sondy wodą klasy LC-MS i wysterylizuj je zgodnie ze standardowym protokołem sterylizacji chirurgicznej lub w dziale sterylnego przetwarzania.

Gdy próbka będzie gotowa do ekstrakcji, otwórz sterylne opakowanie i włóż dwie sondy bezpośrednio do kory nerkowej na 10 minut na punkt czasowy, upewniając się, że cała długość powłoki jest pokryta macierzą tkankową. Upewnij się, że śledzisz czas próbkowania dla każdej sondy. Wycofaj sondę, wyciągając ją z tkanki i natychmiast spłucz powłokę wodą klasy LC-MS, aby usunąć pozostałą krew, upewniając się, że spłukano ją z pola operacyjnego.

Aby przetransportować sondy, umieść je w oddzielnych fiolkach i zamknij. Następnie umieścić fiolki w pudełku wypełnionym suchym lodem lub ciekłym azotem. Próbki należy przechowywać w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza lub natychmiast przystąpić do desorpcji.

Przygotować roztwór desorpcyjny złożony z acetonitrylu i wody do analizy metabolomicznej oraz roztwór składający się z izopropanolu i metanolu do analizy lipidomicznej. Dodać 100 mikrolitrów roztworu do wkładek w 2-mililitrowych oznaczonych fiolkach i umieścić jedną sondę w każdej fiolce. Mieszać fiolki z prędkością 1 200 obr./min przez 2 godziny. Następnie wyjmij sondy z fiolek i przystąp do analizy LC-MS.