Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Ogólnym celem tego eksperymentu jest scharakteryzowanie trzech przedziałów mikrobiomu korzenia, gleby, ryzosfery i endosfery korzenia, przy użyciu profilowania społeczności genu 16S rybosomalnego RNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w ekologii drobnoustrojów, takie jak czynniki biotyczne i abiotyczne, które są istotnymi czynnikami wpływającymi na strukturę mikrobiomu. Główną zaletą tej techniki jest to, że standaryzuje ona każdy krok, od oddzielenia korzenia i ryzosfery, przez ekstrakcję DNA, po przygotowanie biblioteki sekwencjonowania.

Tę procedurę zademonstruje Tuesday Simmons, doktorantka w Coleman-Derr Laboratory. Aby rozpocząć protokół, zbierz masowe próbki gleby za pomocą sterylizowanego etanolem kolektora rdzenia glebowego, aby uzyskać glebę wolną od korzeni roślin. Zbierz rdzeń około 23 do 30 centymetrów od podstawy rośliny.

Następnie przenieś glebę do plastikowej torby, homogenizuj glebę, delikatnie potrząsając torbą, przenieś 600-miligramową porcję próbki gleby do jednej dwumililitrowej probówki i natychmiast umieść dwumililitrową probówkę na suchym lodzie do ekstrakcji DNA. Aby zebrać korzeń i ryzosferę, użyj łopaty wysterylizowanej etanolem, aby wykopać roślinę, uważając, aby uzyskać jak najwięcej korzenia. Delikatnie strząśnij nadmiar gleby z korzeni, aż do powierzchni korzeni przylgnie około dwóch milimetrów gleby.

W przypadku dużych roślin użyj sterylnych nożyczek, aby przeciąć reprezentatywny podfragment korzeni i umieść co najmniej 500 miligramów tkanki korzeniowej w stożkowej fiolce o pojemności 50 mililitrów. Dodaj wystarczającą ilość bufora do usuwania epifitów, aby przykryć korzenie, a następnie natychmiast umieść próbkę na suchym lodzie. Aby oddzielić ryzosferę od korzeni, rozmrozić próbkę korzenia na lodzie, a następnie poddać próbkę korzeni sonikacji.

Przenieś korzenie do schłodzonej, czystej 50-mililitrowej rurki za pomocą sterylnych kleszczy. Nie wyrzucaj oryginalnej probówki z buforem i ziemią. Zawiera frakcję ryzosfery.

Następnie odwirować probówkę zawierającą bufor i ryzosferę. Zdekantować supernatant i umieścić frakcję ryzosfery w suchym lodzie. Aby umyć korzenie, dodaj około 20 mililitrów sterylnej wody o czterech stopniach Celsjusza do frakcji korzeniowej.

Umyj korzeń, energicznie potrząsając przez 15 do 30 sekund, a następnie spuść wodę. Użyj sterylnej szpatułki, aby szybko przenieść 250 miligramów gleby i ryzosfery do oddzielnych probówek zbiorczych dostarczonych w komercyjnym zestawie do izolacji DNA do ekstrakcji gleby, a następnie postępuj zgodnie z protokołem dostawcy zestawu. Po elucji przechowuj DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będzie gotowe do przejścia do przygotowania biblioteki amplikonów, a następnie wyekstrahuj DNA z próbek korzeniowych.

Schłodzić wysterylizowany moździerz i tłuczek za pomocą ciekłego azotu. Odmierz od 600 do 700 miligramów tkanki korzeniowej, umieść tkankę w moździerzu i ostrożnie dodaj tyle ciekłego azotu, aby pokryć korzenie. Zmiel korzenie na małe kawałki.

Kontynuuj proces dodawania ciekłego azotu i mielenia co najmniej dwa razy, zachowując spójność między próbkami, aż korzenie staną się drobnym proszkiem. Szybko, zanim proszek korzeniowy zacznie się rozmrażać, użyj sterylnej szpatułki, aby przenieść proszek korzeniowy do wstępnie zważonych 1,5-mililitrowych probówek na lodzie. Zapisz wagę probówki i proszku.

Użyj sterylnej szpatułki, aby szybko przenieść 150 miligramów proszku korzeniowego do probówki pobranej dostarczonej w komercyjnym zestawie do izolacji DNA przeznaczonym do ekstrakcji z gleby, a następnie przystąp do izolacji DNA zgodnie z protokołem dostawcy zestawu. Przygotować wystarczającą ilość głównej mieszanki PCR do amplifikacji każdej próbki DNA w trzech egzemplarzach. Wlej mieszankę wzorcową do sterylnego, 25-mililitrowego wielokanałowego zbiornika na pipety i rozprowadź 66 mikrolitrów mieszanki głównej do każdej studzienki nowej 96-dołkowej płytki PCR.

Następnie dodaj sześć mikrolitrów po pięć nanogramów na mikrolitr DNA ze znormalizowanej płytki DNA do płytki mieszanki. Następnie dodaj do płytki głównej 1,5 mikrolitra 10-mikromolowego startera do przodu, tak aby każda kolumna miała inny kod kreskowy do przodu, oraz 1,5 mikrolitra 10-mikromolowego startera wstecznego, tak aby każdy rząd miał inny odwrotny kod kreskowy. Przykryj płytkę folią i krótko odkręć płytkę z prędkością 3 000 RCF.

Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie wymieszaj zawartość, a następnie podziel ją na trzy płytki z 25 mikrolitrami mieszaniny reakcyjnej i przykryj płytki folią PCR. Amplifikuj DNA w każdej płytce za pomocą termocyklera. Po amplifikacji połącz trzy powtórzone płytki w jedną 96-dołkową płytkę.

Korzystając z komputerowego arkusza kalkulacyjnego, oblicz objętość 100 nanogramów każdej próbki, a także średnią objętość dla wszystkich próbek. Dla każdego ślepego produktu PCR dodaj obliczoną średnią objętość do pojedynczej 1,5-mililitrowej probówki. W przypadku pomyślnie amplifikowanych próbek, połącz 100 nanogramów każdej próbki w tej samej probówce, a następnie zmierz stężenie połączonego produktu za pomocą fluorometru stacjonarnego i eluuj 600 nanogramów DNA w wodzie molekularnej do końcowej objętości 100 mikrolitrów w 1,5-mililitrowej probówce.

Przechowuj pozostały produkt w puli w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przed oczyszczeniem 600-nanogramowej podwielokrotności DNA należy przygotować 600 mikrolitrów świeżego 70% etanolu. Postępuj zgodnie z ustalonym procesem oczyszczania PCR za pomocą kulek paramagnetycznych.

Potrząśnij rurką z koralikami magnetycznymi, aby ponownie zawiesić koraliki, które osiadają na dnie. Dodać 1x objętość, 100 mikrolitrów, roztworu kulek do 600-nanogramowej porcji DNA. Dokładnie wymieszać roztwór i kulki, pipetując 10 razy.

Po dokładnym wymieszaniu inkubować mieszaninę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na dwie minuty lub do momentu, gdy roztwór będzie klarowny, aby oddzielić kulki od roztworu. Trzymaj probówkę w stojaku, ostrożnie zasysaj przezroczysty supernatant, nie dotykając kulek magnetycznych, i wyrzuć go.

Pozostaw probówkę w stojaku, dodaj do niej 300 mikrolitrów 70% etanolu i inkubuj kulki w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Odessać etanol i wyrzucić go. Powtórz ten proces i usuń cały etanol po drugim praniu.

Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i susz zawartość na powietrzu przez pięć minut. Dodaj 30 mikrolitrów wody molekularnej do wysuszonych kulek i wymieszaj, pipetując 10 razy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty.

Umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby oddzielić kulki od roztworu. Przenieść eluat do nowej probówki. Zmierz końcowe stężenie oczyszczonego, połączonego DNA za pomocą fluorometru laboratoryjnego.

Rozcieńczyć podwielokrotność do 10 nanomoli w końcowej objętości 30 mikrolitrów lub do stężenia i objętości preferowanych przez urządzenie do sekwencjonowania. Po etapie amplifikacji przeprowadzono sekwencjonowanie w celu określenia składu społeczności bakteryjnej w każdej próbce. Dopasowanie sekwencji PNA do każdego genu rybosomalnego RNA 16S z chloroplastów i mitochondriów dla badanego gospodarza rośliny nie powinno ujawnić żadnych niezgodności.

Pojedyncze niedopasowanie do sekwencji PNA składającej się z 13 par zasad może drastycznie zmniejszyć skuteczność, jak w przypadku dostarczonej sekwencji PNA chloroplastu i genu rybosomalnego RNA chloroplastu 16S Lactuca sativa lub sałaty. Ponieważ w każdej próbce zebrano równą ilość amplifikowanego DNA, po sekwencjonowaniu uzyskano parzystą liczbę odczytów, które pasują do taksonów bakteryjnych, na próbkę, posortowaną na podstawie ich indeksu kodu kreskowego. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać dla ośmiu roślin w ciągu około ośmiu godzin.

Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby zachować spójność między eksperymentami. Drobne szczegóły, takie jak zmiany w metodzie ekstrakcji DNA i głównej mieszance PCR, mogą wprowadzać stronniczość. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak metatranskryptomika, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, które drobnoustroje są aktywne i jakie geny wyrażają?

Nie zapominaj, że praca z ciekłym azotem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej.