Charakterystyka tkanek po nowej metodzie dezagregacji do generowania mikroprzeszczepów skóry

Ogólnym celem tego wynalazku chirurgicznego jest wytwarzanie autologicznych mikroprzeszczepów skóry gotowych do natychmiastowego zastosowania podczas tej samej operacji w celu gojenia ran. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej skóry, dotyczące m.in. gojenia ran przewlekłych, oparzeń oraz owrzodzeń potraumatycznych. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że jest ona bardzo łatwa w obsłudze dla lekarza bez specjalistycznego przeszkolenia, a jednocześnie szybka i przystępna cenowo.

W celu rozpoczęcia, należy użyć puncha do biopsji, aby pobrać próbki skóry od pacjenta. Następnie należy usunąć i odrzucić warstwę nabłonka. Każdą próbkę tkanki należy połączyć z 1 mililitrem roztworu soli fizjologicznej, aby przygotować autologiczne mikroprzeszczepy.

Aby przygotować biokompleksy do zastosowania klinicznego, przenieś 1 mililitr roztworu mikroprzeszczepu na gąbki kolagenowe. Natychmiast nanieś biokompleks na uszkodzony obszar pacjenta. W celu przeprowadzenia badań in vitro, sprawdź żywotność biokompleksu.

Po trzech dniach hodowli wlej 0,3% formalinę bezpośrednio na biokompleksy i utrwalaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą mikrotomu wykonaj przekroje o grubości 5 micrometers i zamocuj je bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym. Następnie umieść przekroje w 15 do 20 milliliters ksylenu na trzy minuty.

Następnie zanurz plastry w roztworach etanolu o malejących stężeniach na jedną godzinę w każdym stopniu, a następnie umieść je w wodzie dejonizowanej, aby odparafinizować i rehydratować preparaty. Następnie użyj 1 do 2 ml hematoksyliny o stężeniu 1 g/l przez jedną do dwóch minut w celu zabarwienia preparatów. Na koniec przenieś je do wody, aby wypłukać barwnik.

Następnie, używając od 1 do 2 mililitrów 1% Eosin Y w 70% etanolu rozcieńczonego w wodzie, barwi się skrawki przez cztery do pięciu minut. Następnie laminki płucze się pod bieżącą wodą z kranu. Skrawki zanurza się w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu na jedną godzinę każdy, a następnie inkubuje przez jedną godzinę w ksylenie.

Na koniec, przed nałożeniem szkiełka nakrywnego, nanieś na próbki medium montażowe na bazie wody. Następnie obserwuj je pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 100x. Za pomocą dermatomu pobierz próbki warstwy brodawkowatej o grubości 0,6 mm, tkanki martwej o grubości 1 mm lub skóry właściwej o grubości 0,2 mm z obszarów tułowia czterech dawców wielotkankowych w wieku od 40 do 55 lat, zgodnie z krajowymi zasadami pobierania tkanek.

Umieść próbki w 0,9% NaCl i pozostaw na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut, aby delikatnie wypłukać tkankę. Za pomocą wycinaka do biopsji o średnicy 5 mm pobierz z tkanki skóry, naskórka lub skóry właściwej próbki o jednolitej średnicy, a następnie zważ wszystkie preparaty tkankowe. Następnie wprowadź do homogenizatora tkankowego odpowiednio osiem, trzy lub cztery jednolitych próbek tkanki skóry, naskórka lub skóry właściwej i dodaj 1,5 ml roztworu soli fizjologicznej w celu dysagregacji.

Przeprowadzić dysagregację wszystkich próbek tkanek zgodnie z tymi wskazówkami w tabeli. Jako kontrole wykorzystać odpowiednią liczbę biopsji wycinanych pochodzących z nienaruszonych próbek tkanek. Po dysagregacji mechanicznej odessać roztwór soli fizjologicznej zawierający mikroprzeszczepy i umieścić każdą próbkę oddzielnie w pojedynczym dołku płytki 12-dołkowej.

Do każdej próbki dodać 1 mililitra pożywki RPMI-1640 uzupełnionej o 10% FBS i antybiotyki. Aby ocenić żywotność komórek, do każdego dołka dodać 1 mililitra pożywki zawierającej 0,5 miligrama na mililitr roztworu MTT i inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez trzy godziny. Po inkubacji usunąć pożywkę z MTT i zastąpić ją 1 mililitrem DMSO.

Po 10 minutach inkubacji przenieś każdą próbkę w DMSO do kuwety i za pomocą spektrofotometru zmierz gęstość optyczną przy 570 nanometrach. Oblicz żywotność komórek jako stosunek absorbancji przy 570 nanometrach do masy w gramach tkanki użytej przed dysagregacją. Następnie, po odessaniu roztworu soli fizjologicznej z tkanki skóry, próbek naskórka i skóry właściwej od jednego dawcy, umieść każdą próbkę osobno w dołku płytki 12-dołkowej do testu żywotności komórek lub w kolbie hodowlanej do analizy morfologicznej.

Dodaj 1 ml pożywki RPMI-1640 z 10% FBS i antybiotykami do płytki 12-dołkowej lub 5 ml do kolby hodowlanej i inkubuj w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide przez odpowiednio 24 godziny lub siedem dni. Po 24 godzinach przeprowadź analizę morfologiczną za pomocą mikroskopii świetlnej, oceniając obecność zawiesiny komórkowej. Powtórz procedurę siódmego dnia.

Za pomocą analizy FACS przeanalizowano próbki skóry właściwej pod kątem markerów komórek mezenchymalnych i hematopoetycznych, takich jak CD146, CD34 i CD45. Do rozdzielonych komórek dodano pożywkę, a następnie inkubowano je w temperaturze 37°C przez trzy dni. Sterylność tkanki oceniono, przeprowadzając analizę mikrobiologiczną zgodnie z wcześniejszym opisem.

Jak pokazano tutaj, ludzkie autologiczne mikroprzeszczepy natychmiastowo osadzone na nośniku kolagenowym zostały zaimplantowane w zmianę chorobową nogi. Po 30 dniach zaobserwowano pełną reepitelializację powiązaną z naprawą tkanki. Co więcej, obserwacje kliniczne wykazały dobrą strukturę i miękkość uszkodzonego obszaru po pięciu miesiącach.

Zgodnie z zestawieniem w tej tabeli, ustalono progi ośmiu, czterech i trzech biopsji, które mogą zostać przetworzone w jednym kroku, a tkanki dysagregowano w czterech różnych odstępach czasu, aby zidentyfikować optymalne warunki dysagregacji pozwalające na zachowanie dobrej żywotności komórek. Mechaniczna dysagregacja zaprezentowana w tym filmie pozwala na utrzymanie średniej żywotności komórek na poziomie 30% we wszystkich próbkach skóry, naskórka i skóry właściwej, przy ocenie w różnych odstępach czasu w stosunku do tkanki nienaruszonej. Wykres ten pokazuje, że po 24 godzinach lub siedmiu dniach hodowli nie zaobserwowano istotnych różnic w żywotności komórek w próbkach tkanki skóry w momencie homogenizacji w hodowli w porównaniu z czasem początkowym.

Zaobserwowano jednak zmniejszoną żywotność martwych próbek po 24 godzinach hodowli w porównaniu do czasu początkowego. Żywotność komórek została jednak przywrócona po siedmiu dniach hodowli. Podobne wyniki odnotowano w przypadku skóry właściwej.

Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje pięć minut. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o usunięciu warstwy nabłonkowej ze skóry. Po zastosowaniu tej metody można przeprowadzić inne procedury, takie jak dezagregacja tkanki kostnej, w celu udzielenia odpowiedzi na inne pytania, na przykład dotyczące mechanizmu gojenia kości.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej do badania gojenia tkanek u pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania tej procedury mikroprzeszczepu. Należy pamiętać, że praca z tkanką może być niezwykle niebezpieczna.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie okularów ochronnych.