Charakterystyka tkanek po nowej metodzie dezagregacji do generowania mikroprzeszczepów skóry
March 4th, 2016
Protokół opisuje nową metodę dezagregacji tkanek ludzkich i tworzenia autologicznych mikro-przeszczepów, które w połączeniu z gąbkami kolagenowymi dają początek ludzkim bio-kompleksom gotowym do użycia w leczeniu zmian skórnych. Co więcej, system ten zachowuje żywotność mikroprzeszczepów w różnym czasie po mechanicznej dezagregacji.
Ogólnym celem tego wynalazku chirurgicznego jest wyprodukowanie autologicznych mikroprzeszczepów skóry gotowych do natychmiastowego użycia w tej samej operacji w celu gojenia ran. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkanki skóry dotyczące takich rzeczy, jak przewlekłe gojenie się ran, oparzenia i owrzodzenia pourazowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest bardzo łatwa w użyciu przez lekarza bez oczekiwanej techniki, a także jest równie szybka i niedroga.
Na początek użyj stempla biopsyjnego, aby pobrać próbki skóry od pacjenta. Następnie usuń i wyrzuć warstwę nabłonkową. Połącz każdą próbkę tkanki z 1 mililitrem roztworu soli fizjologicznej, aby wygenerować autologiczne mikroprzeszczepy.
Aby przygotować biokompleksy do zastosowania klinicznego, przenieś 1 mililitr roztworu mikroprzeszczepu na gąbki kolagenowe. Natychmiast nałóż biokompleks na zraniony obszar pacjenta. Aby przeprowadzić badania in vitro, należy przetestować żywotność biokompleksu.
Po trzech dniach hodowli wlej 0,3% formaliny bezpośrednio na biokompleksy i utrwal na 10 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą mikrotomu pokrój skrawki o grubości 5 mikrometrów i zamontuj bezpośrednio na szkiełku podstawowym. Następnie umieść skrawki w 15 do 20 mililitrach ksylenu na trzy minuty.
Następnie zanurz plastry w zmniejszających się stopniach etanolu na jedną godzinę każdy przed umieszczeniem w wodzie dejonizowanej w celu odparafinowania i ponownego nawodnienia sekcji. Następnie użyj 1 do 2 mililitrów 1 grama na litr hematoksyliny przez jedną do dwóch minut, aby zabarwić sekcje. I przenieś do wody, aby spłukać plamę.
Teraz za pomocą 1 do 2 mililitrów 1% eozyny Y i 70% etanolu i rozcieńcz go w wodzie, zabarwij skrawki przez cztery do pięciu minut. Następnie użyj bieżącej wody z kranu, aby spłukać szkiełka. Zanurzyć skrawki w rosnącym stężeniu etanolu na jedną godzinę przed jednogodzinną inkubacją w ksylenie.
Na koniec nałóż podłoże montażowe na próbki przed dodaniem szkiełka nakrywkowego. Następnie obserwuj pod mikroskopem świetlnym w 100-krotnym powiększeniu. Za pomocą dermatomu należy pobrać odpowiednio próbki brodawek o grubości 0,6 milimetra, 1 milimetra lub 0,2 milimetra lub skóry właściwej z obszarów tułowia czterech dawców wielotkankowych w wieku od 40 do 55 lat, zgodnie z krajowymi przepisami dotyczącymi pozyskiwania.
Umieść próbki w 0,9% NaCl i umieść na wytrząsarce orbitalnej na pięć minut, aby delikatnie spłukać tkankę. Za pomocą 5-milimetrowego stempla biopsyjnego utwórz próbki o jednolitej średnicy z tkanki skórnej, martwej i skóry właściwej, a następnie zważ wszystkie próbki tkanek. Następnie włóż osiem, trzy lub cztery jednolite próbki tkanki skórnej, odpowiednio martwej lub skóry właściwej, do substancji zaburzającej tkanki i dodaj 1,5 mililitra roztworu soli fizjologicznej w celu dezagregacji.
Przeprowadzić dezagregację dla wszystkich próbek tkanek zgodnie ze wskazaniami w tej tabeli. Jako kontrolę należy użyć odpowiedniej liczby biopsji stempla pochodzących z nienaruszonych próbek tkanek. Po mechanicznej dezagregacji odessać roztwór soli fizjologicznej zawierający mikroprzeszczepy i umieścić każdą próbkę oddzielnie w jednym dołku na płytce 12-dołkowej.
Do każdej próbki dodać 1 mililitr pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 10% FBS i antybiotykami. Aby ocenić żywotność komórek, do każdej studzienki dodaj 1 mililitr pożywki zawierającej 0,5 miligrama na mililitr roztworu MTT i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy godziny. Po inkubacji usuń pożywkę MTT i zastąp ją 1 mililitrem DMSO.
Po inkubacji przez 10 minut przenieś każdą próbkę w DMSO do kuwety i użyj spektrofotometru, aby odczytać gęstość optyczną przy 570 nanometrach. Obliczyć żywotność komórek jako stosunek absorbancji przy 570 nanometrach do masy i gramów tkanki użytej przed dezagregacją. Następnie, po odessaniu roztworu soli fizjologicznej z tkanki skórnej, próbek martwych i skóry właściwej od jednego dawcy, należy umieścić każdą próbkę oddzielnie w studzience na 12-dołkowej płytce w celu przeprowadzenia testu żywotności komórek lub kolby hodowlanej do analizy morfologicznej.
Dodaj 1 mililitr RPMI-1640 z 10% FBS i antybiotykami do płytki 12-dołkowej lub 5 mililitrów do kolby hodowlanej i kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla odpowiednio przez 24 godziny lub siedem dni. Po 24 godzinach użyj mikroskopii świetlnej, aby przeprowadzić analizę morfologiczną, oceniając obecność zawiesiny komórek. Powtórz w siódmym dniu.
W przypadku analizy FACS analiza próbek skóry właściwej z markerów komórek mezenchymalnych i krwiotwórczych, takich jak CD146, CD34 i CD45. Dodaj pożywkę do zdesegregowanych komórek, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy dni. I oceń sterylność tkanki, wykonując analizę mikrobiologiczną, jak opisano wcześniej.
Jak pokazano tutaj, ludzkie autologiczne mikroprzeszczepy natychmiast załadowane na podporę kolagenową zostały wszczepione w zmianę nogi. A całkowitą reepitelializację związaną z naprawą tkanek zaobserwowano po 30 dniach. Co więcej, obserwacja kliniczna wykazała dobrą teksturę i miękkość uszkodzonego obszaru po pięciu miesiącach.
Jak podano w tej tabeli, ustalono progi ośmiu, czterech i trzech biopsji, które można przetworzyć w jednym kroku, a tkanki zdezagregowano w czterech różnych momentach w celu określenia optymalnych warunków dezagregacji w celu utrzymania dobrej żywotności komórek. Dezagregacja mechaniczna pokazana na tym filmie utrzymuje średnią wartość 30% żywotności komórek we wszystkich próbkach skóry, martwej i właściwej, gdy są oceniane w różnym czasie w odniesieniu do nienaruszonej tkanki. Ten przeszczep pokazuje, że po 24 godzinach, czyli siedmiu dniach w hodowli, nie zaobserwowano znaczącej zmiany żywotności komórek w próbkach tkanki skóry do czasu homogenizacji w hodowli w porównaniu z czasem rozpoczęcia.
Zaobserwowano jednak zmniejszoną żywotność martwych próbek po 24 godzinach w hodowli w porównaniu z czasem rozpoczęcia. Ale żywotność komórek została przywrócona po siedmiu dniach w hodowli. Podobne wyniki zaobserwowano w przypadku skóry właściwej.
Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu pięciu minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o usunięciu warstwy nabłonkowej ze skóry. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak dezagregacja tkanki kostnej, aby odpowiedzieć na inne pytania, takie jak mechanizm gojenia kości.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej do badania procesu gojenia tkanek u pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać tę procedurę mikroprzeszczepu. Nie zapominaj, że praca z tkanką może być niezwykle niebezpieczna.
Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachowywać środki ostrożności, takie jak okulary ochronne.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia nowatorską metodę chirurgiczną tworzenia autologousowych mikro-przeszczepów skóry, które mogą być natychmiastowo wykorzystane do gojenia ran. Technika podkreśla łatwość użycia i przystępność cenowo, czyniąc ją dostępną dla praktyków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Medycyna regeneracyjna
- Inżynieria tkanki skóry
Tło
- Gojenie przewlekłych ran
- Leczenie oparzeń
- Wrzody pourazowe
- Znaczenie żywotności komórek w przeszczepach
Cel badania
- Opracowanie metody natychmiastowego stosowania mikro-przeszczepów skóry
- Zgłębienie rozumienia regeneracji skóry
- Dostarczenie praktycznego rozwiązania dla gojenia ran
Zastosowane metody
- Biopsja dziurką do pobierania próbek skóry
- Usuwanie warstwy nabłonkowej
- Łączenie próbek tkankowych z roztworem fizjologicznym
- Tworzenie autologousowych mikro-przeszczepów
Główne wyniki
- Udane rozdrobnienie tkanek ludzkich
- Zachowanie żywotności komórek w mikro-przeszczepach
- Szybka przygotowanie przeszczepów do natychmiastowego użycia
- Potencjalne zastosowania w różnych scenariuszach gojenia ran
Wnioski
- Metoda jest efektywna i przyjazna dla lekarzy
- Oferuje obiecujące podejście do leczenia zmian skórnych
- Dalsze badania mogą poszerzyć jej zastosowania w medycynie regeneracyjnej
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, autologous micro-graft production for immediate clinical use in wound healing, addressing unmet needs in chronic lesion management. By preserving cell viability and sterility, it supports predictive confidence in regenerative applications. The approach offers a scalable, cost-effective solution for skin tissue engineering workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular composition in disaggregated skin tissue, including mesenchymal stem cell identification for therapeutic hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a standardized, rapid disaggregation protocol that reduces variability in primary cell isolation for target validation studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates viable, heterogeneous cell suspensions suitable for phenotypic screening and functional assays in dermal regeneration models.
- Operational Value: Produces standardized micro-grafts compatible with collagen scaffolds, enabling reproducible assay preparation for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains cell viability and sterility over seven days in culture, supporting longitudinal preclinical evaluation of graft integration and tissue repair mechanisms.
- Operational Value: Delivers ready-to-use autologous bio-complexes that bridge discovery and preclinical validation in wound healing models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid generation of characterized skin-derived cellular systems for mechanistic and translational studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell viability and multipotency in disaggregated skin tissue through flow cytometry and viability assays.
- Screening: Enables standardized preparation of micro-grafts for consistent compound evaluation in dermal regeneration assays.
- Analytics: Provides quantitative outputs including cell viability metrics (OD570 normalization) and sterility confirmation for data-driven decision-making.
- Translational Research: Maintains biological fidelity of human skin-derived cells over culture time, supporting preclinical continuity in wound healing models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable disaggregation workflow applicable to multiple tissue types (skin, dermis, de-epidermized dermis) for platform-based R&D.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through maintained cell viability and sterility, reducing mechanistic ambiguity in regenerative outcomes.
- Operational Value: Standardized, rapid (5-minute) disaggregation process with minimal technical expertise required, enhancing lab throughput.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in wound healing programs by delivering immediate-use grafts with characterized biological properties.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of regenerative candidates via reliable, scalable micro-graft production.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic tissue handling and epithelial layer removal to ensure sample integrity.
- Depends on access to tissue disruptor, centrifuge, spectrophotometer, and flow cytometry for viability and sterility assessment.
- Necessitates standardization of disaggregation time and biopsy volume across user sites to maintain consistent cell yields.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different tissue densities or donor sources.
- Limited by the need for immediate post-disaggregation processing to preserve viability, as delays may affect downstream assay consistency.
