Charakterystyka tkanek po nowej metodzie dezagregacji do generowania mikroprzeszczepów skóry

Ogólnym celem tego wynalazku chirurgicznego jest wyprodukowanie autologicznych mikroprzeszczepów skóry gotowych do natychmiastowego użycia w tej samej operacji w celu gojenia ran. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkanki skóry dotyczące takich rzeczy, jak przewlekłe gojenie się ran, oparzenia i owrzodzenia pourazowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest bardzo łatwa w użyciu przez lekarza bez oczekiwanej techniki, a także jest równie szybka i niedroga.

Na początek użyj stempla biopsyjnego, aby pobrać próbki skóry od pacjenta. Następnie usuń i wyrzuć warstwę nabłonkową. Połącz każdą próbkę tkanki z 1 mililitrem roztworu soli fizjologicznej, aby wygenerować autologiczne mikroprzeszczepy.

Aby przygotować biokompleksy do zastosowania klinicznego, przenieś 1 mililitr roztworu mikroprzeszczepu na gąbki kolagenowe. Natychmiast nałóż biokompleks na zraniony obszar pacjenta. Aby przeprowadzić badania in vitro, należy przetestować żywotność biokompleksu.

Po trzech dniach hodowli wlej 0,3% formaliny bezpośrednio na biokompleksy i utrwal na 10 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą mikrotomu pokrój skrawki o grubości 5 mikrometrów i zamontuj bezpośrednio na szkiełku podstawowym. Następnie umieść skrawki w 15 do 20 mililitrach ksylenu na trzy minuty.

Następnie zanurz plastry w zmniejszających się stopniach etanolu na jedną godzinę każdy przed umieszczeniem w wodzie dejonizowanej w celu odparafinowania i ponownego nawodnienia sekcji. Następnie użyj 1 do 2 mililitrów 1 grama na litr hematoksyliny przez jedną do dwóch minut, aby zabarwić sekcje. I przenieś do wody, aby spłukać plamę.

Teraz za pomocą 1 do 2 mililitrów 1% eozyny Y i 70% etanolu i rozcieńcz go w wodzie, zabarwij skrawki przez cztery do pięciu minut. Następnie użyj bieżącej wody z kranu, aby spłukać szkiełka. Zanurzyć skrawki w rosnącym stężeniu etanolu na jedną godzinę przed jednogodzinną inkubacją w ksylenie.

Na koniec nałóż podłoże montażowe na próbki przed dodaniem szkiełka nakrywkowego. Następnie obserwuj pod mikroskopem świetlnym w 100-krotnym powiększeniu. Za pomocą dermatomu należy pobrać odpowiednio próbki brodawek o grubości 0,6 milimetra, 1 milimetra lub 0,2 milimetra lub skóry właściwej z obszarów tułowia czterech dawców wielotkankowych w wieku od 40 do 55 lat, zgodnie z krajowymi przepisami dotyczącymi pozyskiwania.

Umieść próbki w 0,9% NaCl i umieść na wytrząsarce orbitalnej na pięć minut, aby delikatnie spłukać tkankę. Za pomocą 5-milimetrowego stempla biopsyjnego utwórz próbki o jednolitej średnicy z tkanki skórnej, martwej i skóry właściwej, a następnie zważ wszystkie próbki tkanek. Następnie włóż osiem, trzy lub cztery jednolite próbki tkanki skórnej, odpowiednio martwej lub skóry właściwej, do substancji zaburzającej tkanki i dodaj 1,5 mililitra roztworu soli fizjologicznej w celu dezagregacji.

Przeprowadzić dezagregację dla wszystkich próbek tkanek zgodnie ze wskazaniami w tej tabeli. Jako kontrolę należy użyć odpowiedniej liczby biopsji stempla pochodzących z nienaruszonych próbek tkanek. Po mechanicznej dezagregacji odessać roztwór soli fizjologicznej zawierający mikroprzeszczepy i umieścić każdą próbkę oddzielnie w jednym dołku na płytce 12-dołkowej.

Do każdej próbki dodać 1 mililitr pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 10% FBS i antybiotykami. Aby ocenić żywotność komórek, do każdej studzienki dodaj 1 mililitr pożywki zawierającej 0,5 miligrama na mililitr roztworu MTT i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy godziny. Po inkubacji usuń pożywkę MTT i zastąp ją 1 mililitrem DMSO.

Po inkubacji przez 10 minut przenieś każdą próbkę w DMSO do kuwety i użyj spektrofotometru, aby odczytać gęstość optyczną przy 570 nanometrach. Obliczyć żywotność komórek jako stosunek absorbancji przy 570 nanometrach do masy i gramów tkanki użytej przed dezagregacją. Następnie, po odessaniu roztworu soli fizjologicznej z tkanki skórnej, próbek martwych i skóry właściwej od jednego dawcy, należy umieścić każdą próbkę oddzielnie w studzience na 12-dołkowej płytce w celu przeprowadzenia testu żywotności komórek lub kolby hodowlanej do analizy morfologicznej.

Dodaj 1 mililitr RPMI-1640 z 10% FBS i antybiotykami do płytki 12-dołkowej lub 5 mililitrów do kolby hodowlanej i kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla odpowiednio przez 24 godziny lub siedem dni. Po 24 godzinach użyj mikroskopii świetlnej, aby przeprowadzić analizę morfologiczną, oceniając obecność zawiesiny komórek. Powtórz w siódmym dniu.

W przypadku analizy FACS analiza próbek skóry właściwej z markerów komórek mezenchymalnych i krwiotwórczych, takich jak CD146, CD34 i CD45. Dodaj pożywkę do zdesegregowanych komórek, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy dni. I oceń sterylność tkanki, wykonując analizę mikrobiologiczną, jak opisano wcześniej.

Jak pokazano tutaj, ludzkie autologiczne mikroprzeszczepy natychmiast załadowane na podporę kolagenową zostały wszczepione w zmianę nogi. A całkowitą reepitelializację związaną z naprawą tkanek zaobserwowano po 30 dniach. Co więcej, obserwacja kliniczna wykazała dobrą teksturę i miękkość uszkodzonego obszaru po pięciu miesiącach.

Jak podano w tej tabeli, ustalono progi ośmiu, czterech i trzech biopsji, które można przetworzyć w jednym kroku, a tkanki zdezagregowano w czterech różnych momentach w celu określenia optymalnych warunków dezagregacji w celu utrzymania dobrej żywotności komórek. Dezagregacja mechaniczna pokazana na tym filmie utrzymuje średnią wartość 30% żywotności komórek we wszystkich próbkach skóry, martwej i właściwej, gdy są oceniane w różnym czasie w odniesieniu do nienaruszonej tkanki. Ten przeszczep pokazuje, że po 24 godzinach, czyli siedmiu dniach w hodowli, nie zaobserwowano znaczącej zmiany żywotności komórek w próbkach tkanki skóry do czasu homogenizacji w hodowli w porównaniu z czasem rozpoczęcia.

Zaobserwowano jednak zmniejszoną żywotność martwych próbek po 24 godzinach w hodowli w porównaniu z czasem rozpoczęcia. Ale żywotność komórek została przywrócona po siedmiu dniach w hodowli. Podobne wyniki zaobserwowano w przypadku skóry właściwej.

Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu pięciu minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o usunięciu warstwy nabłonkowej ze skóry. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak dezagregacja tkanki kostnej, aby odpowiedzieć na inne pytania, takie jak mechanizm gojenia kości.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej do badania procesu gojenia tkanek u pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać tę procedurę mikroprzeszczepu. Nie zapominaj, że praca z tkanką może być niezwykle niebezpieczna.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachowywać środki ostrożności, takie jak okulary ochronne.