Name: Charakterystyka tkanek po nowej metodzie dezagregacji do generowania mikroprzeszczepów skóry (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj nową metodę dezagregacji tkanek do tworzenia autologicznych mikroprzeszczepów skóry na potrzeby leczenia ran. Technika ta jest szybka, przystępna cenowo i gotowa do natychmiastowego użycia w chirurgii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr Federice Zanzottera za wkład w badanie przeprowadzające analizę cytometrii przepływowej.

Oświadczenie etyczne: ponieważ kliniczne zastosowanie protokołu wymaga użycia autologicznej tkanki skórnej pacjenta, jego charakterystyka in vitro została przeprowadzona przed klinicznym użyciem na homologicznej tkance skórnej w Regionalnym Banku Skóry Emilia-Romania zgodnie z wytycznymi Krajowych Przepisów dotyczących pobierania, przetwarzania i dystrybucji tkanek do przeszczepu (CNT 2013).
1. Budynek biokompleksu do zastosowań klinicznych
UWAGA: Ten protokół jest klinicznie oparty na użyciu Rigeneracons (substantora tkankowego) i Rigenera Machine (systemu zaburzającego tkanki) (Rysunek 1A). Zaburzacz tkankowy to biologiczny medyczny zaburzacz tkanek ludzkich, zdolny do rozbijania małych fragmentów tkanek za pomocą siatki dostarczanej przez sześciokątne ostrza oraz komórki filtrujące i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej z odcięciem około 50 mikronów.
<ol>
	<li>Pobrać próbki skóry pacjenta za pomocą stempla biopsyjnego (ryc. 1B) i rozdrobnić, dodając 1 ml roztworu soli fizjologicznej na każdy fragment, aby uzyskać autologiczne mikroprzeszczepy 6,7,9 (lub patrz krok 2.1).</li>
	<li>Umieść 1 ml mikroprzeszczepów na gąbkach kolagenowych (ryc. 1C), aby utworzyć biokompleksy do wykorzystania do zastosowania klinicznego.</li>
	<li>Hodowla kolejnych 1 ml mikroprzeszczepów na gąbkach kolagenowych w obecności 6 ml pożywki DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 .</li>
	<li>Po 3 dniach hodowli utrwalić biokompleksy 0,3% paraformaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wlać parafinę za pomocą specjalnego dozownika bezpośrednio na próbkę. Uzyskać plastry za pomocą mikromu o grubości 5 μm i umieścić bezpośrednio w szkiełku podstawowym.</li>
	<li>Plastry parafiny o wielkości 5 μm zanurzyć w szklance do analiz histologicznych, zawierającej 15 - 20 ml ksylenu (dostępny w handlu - mieszanina m-ksylenu (40 - 65%), p-ksylenu (20%), o-ksylenu (20%) i etylobenzenu (6 - 20%) oraz śladowe ilości toluenu, trimetylobenzenu, fenolu, tiofenu, pirydyny i siarkowodoru) na 3 minuty każdy.</li>
	<li>Zanurz plastry w malejących gatunkach (100% do 70%) etanolu (100% etanolu przez 1 godzinę, 95% etanolu przez 1 godzinę, 80% etanolu przez 1 godzinę, 70% etanolu przez 1 godzinę), a następnie w wodzie dejonizowanej w celu odparafinowania i ponownego uwodnienia sekcji.</li>
	<li>Zabarwić skrawki 1-2 ml 1g/l ematoksyliny przez 1-2 minuty, a następnie spłukać w wodzie, aby usunąć nadmiar ematoksyliny.</li>
	<li>Skrawki barwić przez 4 - 5 minut roztworem alkoholowym Eozyny Y o stężeniu 1% zmieszanym z etanolem 70% i rozcieńczonym w wodzie.</li>
	<li>Użyj 1 - 2 ml Eozyny Y na każdą sekcję szkiełka i spłucz pod bieżącą wodą z kranu.</li>
	<li>Zanurz skrawki w rosnących gatunkach etanolu (patrz krok 1.6), a na koniec, po przejściu w ksylenie przez 1 godzinę, nakryj szkiełko z podłożem montażowym na bazie i obserwuj pod mikroskopem świetlnym przy 100-krotnym powiększeniu (rysunek 1D).</li>
</ol>
2. Zbieranie, dezagregacja i analiza in vitro tkanek
<ol>
	<li>Za pomocą dermatomu należy pobrać niezależną tkankę skórną, brodawkowatą skórę właściwą pozbawioną naskórka (Ded) lub siatkowatą skórę właściwą (Dermis) o grubości odpowiednio 0,6 mm, 1 mm lub 2 mm z obszaru tułowia od 4 różnych dawców wielonarządowych i/lub wielotkankowych w wieku od 40 do 55 lat, zgodnie z krajowymi przepisami dotyczącymi pobierania, przetwarzania i dystrybucji tkanek do przeszczepu (CNT 2013).
	<ol>
		<li>Delikatnie przepłucz wszystkie próbki w 0,9% roztworze NaCl, umieszczając je w naczyniu na wytrząsarce orbitalnej na 5 minut.</li>
		<li>Za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy 5 mm utwórz próbki o jednolitej średnicy z tkanki skórnej, Ded i skóry właściwej i zważ wszystkie próbki tkanek przed dezagregacją.</li>
		<li>Wprowadzić osiem, trzy lub cztery jednolite próbki tkanki skórnej, odpowiednio Ded lub Skóra właściwa, do substancji zaburzającej funkcjonowanie tkanek, dodając 1,5 ml roztworu soli fizjologicznej w celu dezagregacji.</li>
		<li>Przeprowadzić różne czasy dezagregacji dla wszystkich próbek tkanek, jak wskazano w tabeli 1.</li>
		<li>Jako kontrolę należy użyć odpowiedniej liczby biopsji stempla pochodzących z nienaruszonych próbek tkanek.</li>
		<li>Po dezagregacji mechanicznej odessać roztwór soli fizjologicznej zawierający mikroprzeszczepy i umieścić oddzielnie każdą próbkę w jednym dołku na płytce 12-dołkowej. Wykonaj ten sam protokół dla nienaruszonych biopsji stempla kontrolnego.</li>
		<li>Do każdej próbki dodać 1 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykami.</li>
		<li>Natychmiast oceń żywotność komórki. Do każdej studzienki zawierającej mikroprzeszczep (otrzymany przez jednoczesną dezagregację ośmiu, trzech lub czterech jednolitych próbek tkanki skórnej, odpowiednio Ded lub Skóra właściwa) dodać 1 ml pożywki zawierającej 0,5 mg/ml roztworu MTT (bromek 3-[4,5-dimetylotiazol-2-ylo]-2,5 difenylotetrazolu) i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 na powietrze. Wykonaj ten sam protokół dla nienaruszonych biopsji stempla kontrolnego.</li>
		<li>Po inkubacji usunąć całą pożywkę zawierającą MTT i dodać do każdej próbki 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) na 10 minut.</li>
		<li>Przenieść każdą próbkę i DMSO do kuwety i odczytać z gęstością optyczną (OD) przy długości fali 570 nm za pomocą spektrofotometru. Obliczyć żywotność komórek jako stosunek absorbancji przy długości fali 570 nm do masy w gramach (gr) tkanki użytej przed dezagregacją. Wykonaj ten sam protokół dla nienaruszonych biopsji stempla kontrolnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po mechanicznej dezagregacji odessać roztwór soli fizjologicznej zawierający mikroprzeszczep pochodzący z tkanki skórnej, próbek Ded i Skóry właściwej od jednego dawcy.
	<ol>
		<li>Umieścić oddzielnie każdą próbkę w pojedynczym dołku na płytce 12-dołkowej lub w kolbie hodowlanej w celu przeprowadzenia odpowiednio badania żywotności komórek i analizy morfologicznej.</li>
		<li>Mikroprzeszczepy hodowlane dodać 1 ml (płytka 12-dołkowa) lub 5 ml (kolba hodowlana) pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS i antybiotykami w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2/powietrze przez 24 godziny lub 7 dni.</li>
		<li>Oceń żywotność komórek po 24 godzinach lub 7 dniach (powtórz kroki 2.1.8-2.1.10).</li>
		<li>Przeprowadzić analizę morfologiczną oceniającą obecność zawiesiny komórkowej za pomocą mikroskopii świetlnej po 24 godzinach i 7 dniach hodowli w kolbie.</li>
		<li>Przeanalizuj próbki skóry właściwej pod kątem dodatniego wyniku dla markerów komórek mezenchymalnych i krwiotwórczych, w tym antygenów CD146, CD34 i CD45 za pomocą analizy FACS 6.</li>
		<li>Pod kapturem z przepływem laminarnym wysiewa się każdy mikroprzeszczep (otrzymany przez jednoczesną dezagregację ośmiu, trzech lub czterech jednolitych próbek tkanki skórnej, odpowiednio Ded lub Dermis) i odpowiadający mu mały fragment każdej próbki tkanki, która nie jest całkowicie zdezagregowana (>50 mikronów wielkości po procesie dezagregacji) na płytce agarowej Columbia zawierającej 5% bulionu z krwi owczej 100 μl.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez trzy dni i przeprowadzić analizę mikrobiologiczną na płytce z agarem Columbia w celu oceny sterylności11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+wounds%3A+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).</li>
<li>Ellis, E. III, Sinn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+homologous+bone+grafts+in+maxillofacial+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Maxillofac+Surg%22%5BJournal%5D)">Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery.</a> J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).</li>
<li>Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+survival+of+autologous+adipose+tissue+taken+and+transplanted+by+different+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Sur%22%5BJournal%5D)">Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques.</a> Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).</li>
<li>Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+Autologous+Fat+Transplantation+With+Platelet+Rich+Plasma%5BTitle%5D)+AND+%22AJCS%22%5BJournal%5D)">Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma.</a> AJCS. 18 (2), 59-70 (2001).</li>
<li>Trovato, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Medical+Device+Rigeneracons+Allows+to+Obtain+Viable+Micro-Grafts+from+Mechanical+Disaggregation+of+Human+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues.</a> J Cell Physiol. , (2015).</li>
<li>Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Derived+Stem+Cells+and+Growth+Factors+Applied+on+Hair+Transplantation+Follow-Up+of+Clinical+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22JCDSA%22%5BJournal%5D)">Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome.</a> JCDSA. 4 (4), 268-274 (2014).</li>
<li>Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Medical+Device%2C+Based+on+Rigenera+Protocol+in+the+Management+of+Complex+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Stem+Cells+Res%2C+Rev+%26+Rep%22%5BJournal%5D)">A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds.</a> J Stem Cells Res, Rev & Rep. 1 (3), 3(2014).</li>
<li>Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+dental+pulp+stem+cells+in+periodontal+regeneration%3A+a+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 34 (3), s27-s33 (2014).</li>
<li>Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+tissue+generation+using+autologous+dental+ligament+micro-grafts%3A+case+report+with+6+months+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22AOMS%22%5BJournal%5D)">Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up.</a> AOMS. 1 (2), 20(2013).</li>
<li>Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinus+lift+tissue+engineering+using+autologous+pulp+micro-grafts%3A+A+case+report+of+bone+density+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Indian+Soc+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation.</a> J Indian Soc Periodontol. 17 (5), 644-647 (2013).</li>
<li>Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+culture+medium+for+medical+bacteriology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">A new culture medium for medical bacteriology.</a> Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).</li>
</ol>

Autor Antonio Graziano jest dyrektorem naukowym firmy Human Brain Wave s.r.l., która produkuje i sprzedaje system Rigenera. Autorka, Letizia Trovato, jest współpracowniczką Działu Naukowego Human Brain Wave s.r.l.

To wstępne badanie wykazało, że mikroprzeszczepy uzyskane za pomocą tego protokołu można łączyć z gąbkami kolagenowymi, jak już opisano w innych zastosowaniach klinicznych, w celu optymalizacji skuteczności implantów mikroprzeszczepów9, 10. W szczególności w badaniu tym wykazano zdolność biokompleksów, składających się z mikroprzeszczepów i gąbek kolagenowych, do wspomagania gojenia się ran po zmianie nogi po 30 dniach od zastosowania klinicznego. Co więcej, wyniki in vitro dostarczają dowodów na skut...

W ostatnich latach opracowano kilka nowych metod w dziedzinie biotechnologii, aby uzyskać autologiczne zawiesiny komórkowe podczas operacji, aby zapewnić jednoetapowe leczenie ostrych i przewlekłych zmian skórnych. Co więcej, leczenie ostrych, ale głównie przewlekłych ran powstałych w wyniku urazu, cukrzycy, infekcji i innych przyczyn pozostaje wyzwaniem. Istnieje coraz więcej dowodów na to, że rany przewlekłe stały się poważnym globalnym problemem zdrowotnym, powodując ogromne obciążenie finansowe dla systemów opieki zdrowotnej na całym świecie1.

Aby zwiększyć wskaźnik sukcesu w leczeniu zmian skórnych, niezbędny jest brak rozległej manipulacji (w tym wzmacnianie komórek) i utrzymanie sterylnych warunków, aby stworzyć zawiesinę komórkową, która może być natychmiast nałożona na uszkodzony obszar pacjentów, unikając w ten sposób dłuższego przetwarzania w czystych pomieszczeniach, takich jak fabryki komórek. Począwszy od małych biopsji skóry, mielenie, wirowanie i inne metody separacji (np. enzymatyczne lub mechaniczne) są często stosowane w celu uzyskania zawiesiny komórkowej, którą można hodować w pożywce wzrostowej. Wszystkie te metody na ogół wymagają długiego czasu wykonania, obciążając struktury komórkowe i prowadząc do zmniejszenia żywotności komórek. Kolejnym istotnym aspektem jest uzyskanie autologicznej zawiesiny komórkowej gotowej do użycia przez klinicystów, na przykład do naprawy uszkodzonych obszarów. Ponadto dobrze wiadomo, że autologiczne przeszczepy tkankowe przeżywają procedury transferu, aby ostatecznie przetrwać w miejscu biorczym zgodnie z zasadami indukcji i przewodzenia 2, 3. Idealna tkanka przeszczepu powinna być łatwo dostępna i mieć niską antygenowość oraz zachorowalność w miejscu dawczym 4.

Na podstawie tych dowodów, pierwszym celem tego badania było stworzenie autologicznych bio-kompleksów nadających się do klinicznego zastosowania w naprawie tkanek. W tym celu opisujemy nową metodę uzyskiwania autologicznych mikroprzeszczepów, zaczynając od tkanek skóry, które zostały zdezagregowane za pomocą tego protokołu. W niniejszym dokumencie opisano również przypadek jako kliniczne zastosowanie autologicznych mikroprzeszczepów uzyskanych za pomocą tego protokołu w połączeniu z gąbkami kolagenowymi. Podejście to zostało już uznane za skuteczne w mechanicznej dezagregacji tkanek ludzkich5 i było stosowane klinicznie do przeszczepów i regeneracji tkanek skóry właściwej 6,7, a także do terapii regeneracyjnych tkanek łącznych w chirurgii jamy ustnej i szczękowo-twarzowej 8-10.

Ponadto, drugim celem tego badania była biologiczna charakterystyka tkanek skórnych po ich dezagregacji za pomocą tego protokołu. W tym celu w Regionalnym Banku Skóry Emilia-Romania przetworzono różne homologiczne próbki tkanki skórnej pochodzące z obszaru tułowia różnych dawców wielonarządowych i/lub wielotkankowych zgodnie z krajowymi przepisami dotyczącymi pobierania, przetwarzania i dystrybucji tkanek do przeszczepów (CNT 2013).
PREZENTACJA PRZYPADKU: 
35-letnia pacjentka wykazująca skomplikowany uraz spowodowany wypadkiem samochodowym została przyjęta na Oddział Intensywnej Terapii Szpitala w Ankonie. Pacjent wykazywał infekcję na nodze z powodu otwartej rany i złamania złożonego stabilizowanego zewnętrzną stabilizacją. Wykonano dwa radykalne oczyszczenia, a gdy rana stała się czysta po terapii podciśnieniowej (terapia V.A.C.), a okostna wydawała się zdrowa, zastosowaliśmy protokół po dwóch miesiącach od wyzdrowienia. Po dezagregacji za pomocą tego systemu, uzyskane mikroprzeszczepy wykorzystano do stworzenia biokompleksów z gąbką kolagenową, które następnie wszczepiono w celu zbadania ich skuteczności w naprawie zmiany.

<table><tbody><tr><td>Rigenera Machine</td><td>Human Brain Wave</td><td>79210R</td><td></td></tr><tr><td>Rigeneracons</td><td>Ludzka fala mózgowa</td><td>79450S</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Roche Diagnostic GmbH</td><td>11465007001</td><td></td></tr><tr><td>Medium RPMI</td><td>PBI International</td><td>733-2292</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>PBI International</td><td>F 0415</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td>biologiczne Branże PBI</td><td>03-038-1 &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała do analizy FACS</td><td>eBiosciences</td><td>kod 12-1469 dla CD146-P; kod 17-0349&nbsp; dla CD34-APC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agar Columbia</td><td>BioMerieux Company</td><td>43041</td><td></td></tr><tr><td>Condress&reg;</td><td>Gąbka kolagenowa</td> <td>Abiogen Pharma</td><td></td> stosowana do biokompleksów</tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>roztwór NaCl</td><td>Fresenius Kabi, Bad Homburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylen&nbsp;</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka tkanek po nowej metodzie dezagregacji do generowania mikroprzeszczepów skóry

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

W dziedzinie biotechnologii opracowano kilka nowych metod uzyskiwania autologicznych zawiesin komórkowych podczas operacji, aby zapewnić jednoetapowe leczenie ostrych i przewlekłych zmian skórnych. Ponadto leczenie przewlekłych, ale także ostrych ran powstałych w wyniku urazów, cukrzycy, infekcji i innych przyczyn pozostaje wyzwaniem. W niniejszej pracy opisano nową metodę tworzenia autologicznych mikroprzeszczepów z tkanki skórnej pojedynczego pacjenta oraz ich zastosowanie kliniczne. Ponadto przeprowadzono również biologiczną charakterystykę in vitro tkanki skórnej pochodzącej ze skóry, skóry właściwej pozbawionej naskórka (Ded) oraz skóry właściwej dawców wielonarządowych i/lub wielotkankowych. Wszystkie tkanki zostały zdezagregowane za pomocą tego nowego protokołu, co pozwoliło nam uzyskać żywotne mikroprzeszczepy. W szczególności informowaliśmy, że ten innowacyjny protokół jest w stanie tworzyć biokompleksy złożone z autologicznych mikroprzeszczepów i gąbek kolagenowych gotowych do zastosowania na zmiany skórne. Opisano również kliniczne zastosowanie autologicznych biokompleksów na zmianę nogi, wykazując poprawę zarówno procesu reepitalizacji, jak i miękkości zmiany. Ponadto nasz model in vitro wykazał, że żywotność komórek po mechanicznej dezagregacji za pomocą tego systemu utrzymuje się w czasie przez okres do siedmiu (7) dni hodowli. Za pomocą analizy cytometrii przepływowej zaobserwowaliśmy również, że pula komórek uzyskanych w wyniku dezagregacji składa się z kilku typów komórek, w tym mezenchymalnych komórek macierzystych, które odgrywają kluczową rolę w procesach regeneracji i naprawy tkanek, ze względu na ich wysoki potencjał regeneracyjny. Wreszcie, wykazaliśmy in vitro, że ta procedura utrzymuje sterylność mikroprzeszczepów podczas hodowli na szalkach agarowych. Podsumowując, dochodzimy do wniosku, że to nowe podejście regeneracyjne może być obiecującym narzędziem dla klinicystów do uzyskania w jednym kroku żywotnych, sterylnych i gotowych do użycia mikroprzeszczepów, które można stosować samodzielnie lub w połączeniu z najpopularniejszymi rusztowaniami biologicznymi.

W tym wstępnym badaniu pierwszym celem było zbadanie zdolności autologicznych mikroprzeszczepów ludzkich w połączeniu z nośnikiem biologicznym, takim jak kolagen, do tworzenia gotowych do użycia biokompleksów. Biokompleksy te wszczepiono pacjentowi z raną nogi powstałą w wyniku wypadku samochodowego (Rycina 2A), a po 30 dniach zaobserwowano całkowitą reepitelializację powiązaną z naprawą tkanek (Rycina 2B)). Ponadto obser...

Protokół opisuje nową metodę dezagregacji tkanek ludzkich i tworzenia autologicznych mikro-przeszczepów, które w połączeniu z gąbkami kolagenowymi dają początek ludzkim bio-kompleksom gotowym do użycia w leczeniu zmian skórnych. Co więcej, system ten zachowuje żywotność mikroprzeszczepów w różnym czasie po mechanicznej dezagregacji.

Charakterystyka tkanek po nowej metodzie dezagregacji do generowania mikroprzeszczepów skóry

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Ogólnym celem tego wynalazku chirurgicznego jest wytwarzanie autologicznych mikroprzeszczepów skóry gotowych do natychmiastowego zastosowania podczas tej samej operacji w celu gojenia ran. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej skóry, dotyczące m.in. gojenia ran przewlekłych, oparzeń oraz owrzodzeń potraumatycznych. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że jest ona bardzo łatwa w obsłudze dla lekarza bez specjalistycznego przeszkolenia, a jednocześnie szybka i przystępna cenowo.W celu rozpoczęcia, należy użyć puncha do biopsji, aby pobrać próbki skóry od pacjenta. Następnie należy usunąć i odrzucić warstwę nabłonka. Każdą próbkę tkanki należy połączyć z 1 mililitrem roztworu soli fizjologicznej, aby przygotować autologiczne mikroprzeszczepy.Aby przygotować biokompleksy do zastosowania klinicznego, przenieś 1 mililitr roztworu mikroprzeszczepu na gąbki kolagenowe. Natychmiast nanieś biokompleks na uszkodzony obszar pacjenta. W celu przeprowadzenia badań in vitro, sprawdź żywotność biokompleksu.Po trzech dniach hodowli wlej 0,3% formalinę bezpośrednio na biokompleksy i utrwalaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą mikrotomu wykonaj przekroje o grubości 5 micrometers i zamocuj je bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym. Następnie umieść przekroje w 15 do 20 milliliters ksylenu na trzy minuty.Następnie zanurz plastry w roztworach etanolu o malejących stężeniach na jedną godzinę w każdym stopniu, a następnie umieść je w wodzie dejonizowanej, aby odparafinizować i rehydratować preparaty. Następnie użyj 1 do 2 ml hematoksyliny o stężeniu 1 g/l przez jedną do dwóch minut w celu zabarwienia preparatów. Na koniec przenieś je do wody, aby wypłukać barwnik.Następnie, używając od 1 do 2 mililitrów 1% Eosin Y w 70% etanolu rozcieńczonego w wodzie, barwi się skrawki przez cztery do pięciu minut. Następnie laminki płucze się pod bieżącą wodą z kranu. Skrawki zanurza się w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu na jedną godzinę każdy, a następnie inkubuje przez jedną godzinę w ksylenie.Na koniec, przed nałożeniem szkiełka nakrywnego, nanieś na próbki medium montażowe na bazie wody. Następnie obserwuj je pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 100x. Za pomocą dermatomu pobierz próbki warstwy brodawkowatej o grubości 0,6 mm, tkanki martwej o grubości 1 mm lub skóry właściwej o grubości 0,2 mm z obszarów tułowia czterech dawców wielotkankowych w wieku od 40 do 55 lat, zgodnie z krajowymi zasadami pobierania tkanek.Umieść próbki w 0,9% NaCl i pozostaw na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut, aby delikatnie wypłukać tkankę. Za pomocą wycinaka do biopsji o średnicy 5 mm pobierz z tkanki skóry, naskórka lub skóry właściwej próbki o jednolitej średnicy, a następnie zważ wszystkie preparaty tkankowe. Następnie wprowadź do homogenizatora tkankowego odpowiednio osiem, trzy lub cztery jednolitych próbek tkanki skóry, naskórka lub skóry właściwej i dodaj 1,5 ml roztworu soli fizjologicznej w celu dysagregacji.Przeprowadzić dysagregację wszystkich próbek tkanek zgodnie z tymi wskazówkami w tabeli. Jako kontrole wykorzystać odpowiednią liczbę biopsji wycinanych pochodzących z nienaruszonych próbek tkanek. Po dysagregacji mechanicznej odessać roztwór soli fizjologicznej zawierający mikroprzeszczepy i umieścić każdą próbkę oddzielnie w pojedynczym dołku płytki 12-dołkowej.Do każdej próbki dodać 1 mililitra pożywki RPMI-1640 uzupełnionej o 10% FBS i antybiotyki. Aby ocenić żywotność komórek, do każdego dołka dodać 1 mililitra pożywki zawierającej 0,5 miligrama na mililitr roztworu MTT i inkubować w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez trzy godziny. Po inkubacji usunąć pożywkę z MTT i zastąpić ją 1 mililitrem DMSO.Po 10 minutach inkubacji przenieś każdą próbkę w DMSO do kuwety i za pomocą spektrofotometru zmierz gęstość optyczną przy 570 nanometrach. Oblicz żywotność komórek jako stosunek absorbancji przy 570 nanometrach do masy w gramach tkanki użytej przed dysagregacją. Następnie, po odessaniu roztworu soli fizjologicznej z tkanki skóry, próbek naskórka i skóry właściwej od jednego dawcy, umieść każdą próbkę osobno w dołku płytki 12-dołkowej do testu żywotności komórek lub w kolbie hodowlanej do analizy morfologicznej.Dodaj 1 ml pożywki RPMI-1640 z 10% FBS i antybiotykami do płytki 12-dołkowej lub 5 ml do kolby hodowlanej i inkubuj w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide przez odpowiednio 24 godziny lub siedem dni. Po 24 godzinach przeprowadź analizę morfologiczną za pomocą mikroskopii świetlnej, oceniając obecność zawiesiny komórkowej. Powtórz procedurę siódmego dnia.Za pomocą analizy FACS przeanalizowano próbki skóry właściwej pod kątem markerów komórek mezenchymalnych i hematopoetycznych, takich jak CD146, CD34 i CD45. Do rozdzielonych komórek dodano pożywkę, a następnie inkubowano je w temperaturze 37°C przez trzy dni. Sterylność tkanki oceniono, przeprowadzając analizę mikrobiologiczną zgodnie z wcześniejszym opisem.Jak pokazano tutaj, ludzkie autologiczne mikroprzeszczepy natychmiastowo osadzone na nośniku kolagenowym zostały zaimplantowane w zmianę chorobową nogi. Po 30 dniach zaobserwowano pełną reepitelializację powiązaną z naprawą tkanki. Co więcej, obserwacje kliniczne wykazały dobrą strukturę i miękkość uszkodzonego obszaru po pięciu miesiącach.Zgodnie z zestawieniem w tej tabeli, ustalono progi ośmiu, czterech i trzech biopsji, które mogą zostać przetworzone w jednym kroku, a tkanki dysagregowano w czterech różnych odstępach czasu, aby zidentyfikować optymalne warunki dysagregacji pozwalające na zachowanie dobrej żywotności komórek. Mechaniczna dysagregacja zaprezentowana w tym filmie pozwala na utrzymanie średniej żywotności komórek na poziomie 30% we wszystkich próbkach skóry, naskórka i skóry właściwej, przy ocenie w różnych odstępach czasu w stosunku do tkanki nienaruszonej. Wykres ten pokazuje, że po 24 godzinach lub siedmiu dniach hodowli nie zaobserwowano istotnych różnic w żywotności komórek w próbkach tkanki skóry w momencie homogenizacji w hodowli w porównaniu z czasem początkowym.Zaobserwowano jednak zmniejszoną żywotność martwych próbek po 24 godzinach hodowli w porównaniu do czasu początkowego. Żywotność komórek została jednak przywrócona po siedmiu dniach hodowli. Podobne wyniki odnotowano w przypadku skóry właściwej.Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje pięć minut. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o usunięciu warstwy nabłonkowej ze skóry. Po zastosowaniu tej metody można przeprowadzić inne procedury, takie jak dezagregacja tkanki kostnej, w celu udzielenia odpowiedzi na inne pytania, na przykład dotyczące mechanizmu gojenia kości.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej do badania gojenia tkanek u pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania tej procedury mikroprzeszczepu. Należy pamiętać, że praca z tkanką może być niezwykle niebezpieczna.Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie okularów ochronnych.

tissue-characterization-after-new-disaggregation-method-for-skin

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analiza specyficzna dla tkanki w modelu regeneracji mieszka włosowego z wykorzystaniem lentiwirusów do mediacji funkcji wzmocnionej (gain-of-function) lub utraconej (loss-of-function).

Szybka analiza genetyczna sygnalizacji nabłonkowo-mezenchymalnej podczas regeneracji włosa

Ten film opisuje szczegółowy protokół generowania organotypowych rekonstrukcji skóry in vitro 3D w celu zbadania progresji czerniaka. Ten model skóry naśladuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządów in vivo.

Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Inżynieria tkankowa często obejmuje ekspansję in vitro w celu stworzenia autoprzeszczepów do regeneracji tkanek. W tym badaniu opracowano metodę rozbudowy, regeneracji i rekonstrukcji tkanek in vivo w celu zminimalizowania przetwarzania komórek i materiałów biologicznych poza organizmem.

Tkanka mielona w skompresowanym kolagenie: bioprzeszczep zawierający komórki do jednoetapowej naprawy rekonstrukcyjnej

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego i szczegółowego protokołu generowania genetycznie zmodyfikowanej ludzkiej organotypowej skóry z keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Tutaj opisujemy protokół produkcji igieł do pobierania igieł, które mogą być używane do pobierania tkanki skórnej o pełnej grubości bez powodowania bliznowacenia miejsca dawczego. Igły można łączyć z prostym systemem zbierania, aby uzyskać zbiory na dużą skalę.

Aparatura do pobierania mikrokolumn tkankowych

Proponujemy protokół, który pokazuje, jak różnicować indukowane pluripotencjalne keratynocyty i fibroblasty pochodzące z komórek macierzystych oraz generować organoid skóry 3D, używając tych keratynocytów i fibroblastów. Protokół ten zawiera dodatkowy krok generowania humanizowanego modelu myszy. Przedstawiona tutaj technika usprawni badania dermatologiczne.

Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

Celem tego badania było opracowanie mysiego modelu gojenia się ran po oparzeniach. Oparzenie termiczne wywołano na skórze grzbietowej myszy za pomocą podgrzanego mosiężnego szablonu. Spaloną tkankę oczyszczono i pokryto przeszczepem skóry pobranym z ogona genetycznie podobnej myszy dawcy.

Mysi model rany oparzeniowej zrekonstruowany za pomocą allogenicznego przeszczepu skóry

Obecny protokół opisuje, jak przeszczepić ludzką skórę nieotyłym myszom z cukrzycą (NOD)-scid z receptorem łańcucha gamma interleukiny-2 (NSG). W raporcie zawarto szczegółowy opis przygotowania skóry ludzkiej do przeszczepu, przygotowania myszy do przeszczepu, przeszczepu skóry ludzkiej o podzielonej grubości oraz procedury rekonwalescencji po przeszczepie.

Model skóry ksenoprzeszczepu do manipulowania ludzkimi odpowiedziami immunologicznymi in vivo

Poznaj nową metodę dezagregacji tkanek do tworzenia autologicznych mikroprzeszczepów skóry na potrzeby leczenia ran. Technika ta jest szybka, przystępna cenowo i gotowa do natychmiastowego użycia w chirurgii.

Charakterystyka tkanek po nowej metodzie dezagregacji do generowania mikroprzeszczepów skóry

Przeglądaj więcej filmów