Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych
21 czerwca 2019
Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami została opracowana do użytku w połączeniu z jednosondowym zestawem spektrometrii mas do analizy on-line pojedynczych komórek zawiesinowych w warunkach otoczenia.
Ponieważ ta metoda analizuje komórki z roztworu, może być używana do badania komórek w środowisku zbliżonym do natywnego. Obejmuje to analizę próbek komórek pobranych od pacjenta. Technika ta wymaga niewielkiego lub żadnego przygotowania próbki komórek.
Dzięki temu możemy analizować poszczególne komórki online w warunkach otoczenia, co pozwala nam badać niejednorodność komórkową. Technika ta może być stosowana do badania płynnych biopsji z różnych stanów chorobowych, ponieważ może analizować różne typy komórek bezpośrednio izolowanych z próbek pacjentów. Aby przekształcić szklaną rurkę z pojedynczym otworem w stożkową sondę z ostrą końcówką, najpierw umieść szklaną rurkę z pojedynczym otworem w zaciskach pionowego uchwytu na pipety, centrując szkło w stosunku do wężownicy grzewczej i dokręć, aby zabezpieczyć rurkę na miejscu.
Wężownica grzewcza składa się z drutu oporowego niklowo-chromowego o grubości 18 mm, nawiniętego wokół metalowego pręta 2,5 razy. Ustaw szklaną rurkę z programem temperatury 19.5. Ustawić tłok elektromagnesu na cztery.
Uruchom elektrozawór, aby pociągnąć szklaną rurkę. Ten krok tworzy dwie sondy połączone na końcówce. Użyj swetrów, aby odciąć około jednego milimetra od końcówki każdej sondy, tworząc otwór o średnicy około 10 mikronów na końcówce sondy.
Aby zgiąć szklaną sondę w celu łatwego sprzężenia z ICMP, skonfigurowano pojedynczą sondę SCMS. Najpierw umieść wyciągniętą szklaną sondę w mikrokuźni. Umieść górę około trzech milimetrów nad platynowym drutem grzejnym.
Następnie zwiększ temperaturę na platynowym przewodzie do 30% temperatury maksymalnej. Zegnij sondę o około 45 stopni od pierwotnej pozycji. Umieść mikrowstrzykiwacz z odwróconym mikroskopem w dwóch systemach manipulacji komórkami na zmotoryzowanym stole w celu łatwego sprzężenia ze spektrometrem masowym.
Aby skonfigurować urządzenie do wyboru szklanych komórek, włóż sondę wyboru szklanych komórek do metalowego uchwytu mikrowtryskiwacza, umieszczając długą prowadnicę w uchwycie kapilary i dokręcając, aby zamocować sondę na miejscu. Umieść końcówki sondy pod kątem równolegle do podgrzewanej płyty. Przymocuj metalowy uchwyt mikrowtryskiwacza do systemu manipulacji komórkami.
Następnie umieść końcówkę sondy w pobliżu środka odwróconego światła mikroskopu. Zamocuj szklaną szkiełko zawierającą pojedynczą sondę w ramieniu clamp systemu manipulacji komórkami. Podłącz rozpuszczalnik dostarczający kapilarę do złącza przewodzącego, umieszczając kapilar w tulei plastikowej tulejki i dokręcając palcami złączkę.
Podłączyć drugą stronę złączki przewodzącej do kapilary, która jest połączona ze strzykawką zawierającą rozpuszczalnik do pobierania próbek, umieszczając kapilar w tulei i dokręcając złączkę. W tych eksperymentach należy użyć acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym jako rozpuszczalnika do pobierania próbek. Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej na spektrometrze masowym.
Umieść jonizację nanoelektronizacyjną lub emiter nano ESI około jednego milimetra do otworu przedłużonej rurki do przenoszenia jonów. Użyj systemu manipulacji komórkami, aby kontrolować ruchy przestrzenne pojedynczej sondy i umieść emiter nano ESI centralnie przed przedłużoną rurką do przenoszenia jonów. Odpipetować komórki z kolby do hodowli komórkowej do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.
Obracaj komórki w temperaturze 400 razy G w 37 stopniach Celsjusza przez pięć minut i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w czterech mililitrach pożywki RPMI zawierającej związek leczniczy o pożądanym stężeniu terapeutycznym. Dostosuj parametry eksperymentalne spektrometru masowego.
Pod nagłówkiem trybu skanowania w oprogramowaniu urządzenia wybierz opcję zdefiniuj skanowanie. Użyj rozdzielczości 60 000 przy M powyżej Z 400, jeden mikroskop maksymalny czas wstrzykiwania 100 milisekund i włączona automatyczna kontrola wzmocnienia. Pod pompą strzykawkową wybierz natężenie przepływu 150 nanolitrów na minutę.
Wybierz źródło NSI i przyłóż napięcie około 4,5 kilowolta. Włącz odwrócony mikroskop z 40-krotnym powiększeniem wybranym zarówno dla górnej, jak i dolnej soczewki. Podłącz go do portu USB laptopa, aby przechwytywać kanały wideo na żywo.
Włącz podgrzewaną płytę i ustaw ją na 37 stopni Celsjusza. Na komputerze przejdź do zakładki pobierania danych i wybierz opcję Stale w obszarze Czas pozyskania. Aby przygotować próbkę do analizy, należy odpipetować dwie lub trzy próbki do pokrywki małej szalki Petriego.
Umieść próbkę w środku światła z odwróconego mikroskopu na górze podgrzewanej płytki. Przygotuj sondę wyboru szklanej komórki do analizy. Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć sondę tak, aby jej górna część była skupiona pod odwróconym mikrocsope w tej samej płaszczyźnie co komórki.
Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć końcówkę sondy wyboru komórek do docelowej komórki w celu analizy. Proces ten jest monitorowany za pomocą odwróconego mikroskopu. Delikatnie obróć uchwyt mikrowtryskiwacza, aby wyregulować położenie oleju mineralnego wewnątrz rurki.
Mikroiniektor zapewnia delikatne ssanie, aby przymocować docelową komórkę do końcówki sondy wyboru komórek. Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć komórkę na końcówce sondy wyboru komórki do pojedynczej końcówki sondy za pomocą mikroskopu cyfrowego skoncentrowanego na końcówce pojedynczej sondy w celu monitorowania tego procesu. Nieleczone komórki K-562 są używane do ustalenia metody eksperymentalnej.
W typowym eksperymencie SCMS można zaobserwować oczywiste zmiany widm masowych wynikające z przeniesienia komórki podczas wykrywania zawartości komórki i po zakończeniu pomiaru. Trzy typowe komórkowe piki lipidowe, w tym PC 34:4, PC 36:4 i PC 38:5, są monitorowane, aby upewnić się, że komórka została pomyślnie przeniesiona i wykryta została zawartość komórkowa. Tożsamość wielu PC w zakresie mas od 750 do 850 została potwierdzona za pomocą MSMS na próbkach lizatu komórkowego niepoddanych działaniu substancji.
Za pomocą pojedynczej sondy ICMP MS wykryto gemcytabinę, taksol i OSW1 po inkubacji z komórkami K-562. Wyniki te sugerują, że metoda ta może być stosowana do badania wewnątrzkomórkowych lipidów, leków i metabolitów na poziomie pojedynczej komórki z komórek w roztworze w środowisku zbliżonym do natywnego. Należy pamiętać o bezpiecznym umieszczeniu sondy do wyboru szklanej kuwety w uniwersalnym uchwycie na pipety, aby można było odpowiednio zastosować ssanie.
Metoda ta może być również stosowana do próbek pobranych od pacjentów w celu rozróżnienia różnic między metabolitami komórkowymi z różnych typów komórek, co pozwala nam lepiej zrozumieć te stany chorobowe. Po opracowaniu tej metody moglibyśmy potencjalnie wdrożyć kwantyfikację związków leczniczych na poziomie pojedynczej komórki. Podczas pracy z komórkami ważne jest, aby mieć odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny i rękawice.
Podczas pracy ze szkłem można stosować dodatkowe okulary.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zintegrowaną platformę łączącą spektrometrię mas pojedynczych komórek (SCMS) z wykorzystaniem pojedynczej sondy z systemem manipulacji komórkami, co umożliwia szybką i czułą analizę pojedynczych komórek zawieszonych bezpośrednio w roztworze. Metoda ta pozwala na minimalne przygotowanie próbek i zachowuje komórki w środowisku zbliżonym do natywnego, co ułatwia badanie heterogeniczności komórkowej oraz wykrywanie wewnątrzkomórkowych metabolitów, lipidów i leków na poziomie pojedynczej komórki. Podejście to jest stosowalne do próbek pochodzących od pacjentów, co wspiera potencjalne zastosowania w biologii chorób i medycynie personalizowanej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Chemia analityczna
- Analiza pojedynczych komórek
- Spektrometria mas
- Biologia komórki
Wstęp
- Tradycyjne techniki SCMS były ograniczone do unieruchomionych komórek, co zawężało typy komórek podlegających analizie.
- Analiza komórek w roztworze umożliwia badanie komórek w stanie bliższym naturalnemu, w tym tych pochodzących z próbek pacjentów.
- Heterogeniczność komórkowa jest istotna dla zrozumienia mechanizmów chorób i odpowiedzi na leki.
- Minimalizacja przygotowania próbek ogranicza potencjalne artefakty i pozwala zachować integralność komórkową.
Cel badania
- Opracowanie platformy do analizy SCMS pojedynczych komórek pływających w roztworze.
- Zintegrowanie systemu manipulacji komórkami w celu ukierunkowanej selekcji i przeniesienia komórek.
- Umożliwienie szybkiej analizy online składników komórkowych w warunkach otoczenia.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie stożkowych szklanych sond do pobierania próbek i selekcji komórek.
- Integracja systemu manipulacji komórkami (podobnego do stosowanych w IVF) z układem SCMS z pojedynczą sondą.
- Wykorzystanie mikroskopu odwróconego i mikroinjektora do precyzyjnego przechwytywania i przenoszenia komórek.
- Analiza za pomocą lizy online i spektrometrii mas pojedynczych komórek z wykorzystaniem nanoelektrosprayowej jonizacji.
- Zastosowanie metody do komórek K-562 oraz detekcja lipidów komórkowych i związków leków.
Główne wyniki
- Skuteczne wychwycenie i transfer pojedynczych komórek pływających do analizy SCMS.
- Wykrycie kluczowych pików lipidów komórkowych (np. PC 34:4, PC 36:4, PC 38:5), potwierdzające efektywną lizę komórek i analizę zawartości.
- Identyfikacja związków leków (Gemcitabine, Taxol, OSW1) w potraktowanych komórkach K-562 na poziomie pojedynczej komórki.
- Wykazanie, że metoda umożliwia analizę komórek z próbek pochodzących od pacjentów przy minimalnym przygotowaniu.
Wnioski
- Zintegrowana platforma umożliwia czułą i szybką analizę SCMS pojedynczych komórek w roztworze.
- Podejście to ułatwia badanie heterogeniczności komórkowej oraz odpowiedzi na leki w środowisku zbliżonym do naturalnego.
- Metoda ta rokuje zastosowania w biologii chorób, medycynie personalizowanej oraz analizie biopsji płynnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Integracja spektrometrii mas z pojedynczą sondą z platformą do manipulacji komórkami umożliwia bezpośrednią, ilościową analizę leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesiny pochodzących z próbek pacjentów. Podejście to pozwala rozwiązać problem badania heterogeniczności komórkowej oraz odpowiedzi na leki w środowisku zbliżonym do naturalnego, co zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania leków i w badaniach translacyjnych. Minimalne przygotowanie próbek na tej platformie oraz kompatybilność z płynnymi biopsjami sprawiają, że jest ona cennym narzędziem przy podejmowaniu decyzji portfelowych opartych na analizie ryzyka w biologii chorób i medycynie personalizowanej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych poziomów leku i metabolitów w pojedynczych komórkach.
- Wspiera redukcję ryzyka biologicznego poprzez ujawnianie heterogeniczności komórkowej oraz funkcjonalnego zaangażowania celu w próbkach pochodzących od pacjentów.
- Ułatwia budowanie pewności prognostycznej i selekcję celów na podstawie bezpośrednich odczytów molekularnych z komórek istotnych dla danej choroby.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy jednokomórkowe do późniejszego przesiewania związków i badań mechanistycznych.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki spektrometrii mas w celu standaryzacji i benchmarkingu testów.
- Umożliwia skalowalną, wysokotreściową analizę poboru i metabolizmu leków na poziomie pojedynczej komórki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami biomarkerów translacyjnych, umożliwiając analizę komórek izolowanych od pacjentów z płynów ustrojowych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez wsparcie płynnej biopsji i profilowanie stanu chorobowego.
- Minimalizuje ryzyko decyzji dotyczących dalszego rozwoju projektu, dostarczając bezpośrednich dowodów działania leku w klinicznie istotnych populacjach komórek.
Integracja potoków i przepływów pracy
Platforma ta łączy wczesne etapy odkryć, identyfikację wiodących związków oraz badania translacyjne, umożliwiając bezpośrednią, ilościową analizę pojedynczych komórek w zawiesinie z próbek klinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków metabolicznych poprzez profilowanie leków i metabolitów na poziomie pojedynczych komórek.
- Screening: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne systemy do oceny wpływu związków w heterogenicznych populacjach komórek.
- Analityka: Dostarcza wysokorozdzielcze, ilościowe dane z spektrometrii mas do analizy porównawczej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z preklinicznymi i klinicznymi strategiami biomarkerów z wykorzystaniem komórek pochodzących od pacjentów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia możliwość ponownego wykorzystania analitycznego w różnych modelach chorób i typach próbek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i walidację celów poprzez rozstrzygnięcie heterogeniczności komórkowej na poziomie molekularnym.
- Wartość operacyjna: Usprawnia procesy dzięki minimalnemu przygotowaniu próbek oraz solidnym i powtarzalnym wynikom.
- Wartość strategiczna: Poprawia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie praktycznych danych z próbek istotnych klinicznie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów w oparciu o bezpośrednie dowody z komórek pochodzących od pacjentów.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w manipulacji pojedynczymi komórkami, spektrometrii mas oraz interpretacji danych.
- Wymaga specjalistycznej aparatury, w tym mikroinjektorów, mikroskopów odwróconych i wysokorozdzielczych spektrometrów mas.
- Konieczna jest standaryzacja procedur przygotowania próbek i protokołów analitycznych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowana do różnych typów komórek i płynów ustrojowych, jednak może wymagać optymalizacji dla konkretnych modeli chorobowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują przepustowość oraz konieczność precyzyjnego wyboru i transferu komórek.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Glass Cell-Selection Probe Fabrication and Integrated Cell Manipulation Platform Assembly
2:32
Couple the ICMP with a Single-Probe Setup and Suspended Cell Sample Preparation
3:58
Perform SCMS Measurements Using the ICMP/Single-probe Setup
5:57
Results: Integrated Cell Manipulation Platform Testing of Single Suspension Cells
7:07
Conclusion
