Name: Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj zintegrowaną platformę do analizy pojedynczych komórek zawiesinowych metodą spektrometrii mas z pojedynczą sondą. Technika umożliwia szybkie wykrywanie lipidów, metabolitów i leków w komórkach pacjentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Naga Rama Kothapalli za jej pracę w opracowywaniu przygotowania próbek zarówno do eksperymentów z zawiesinami, jak i lizatami komórkowymi. Dodatkowo autorzy dziękują NIH (R01GM116116 i R21CA204706) za dofinansowanie.

1. Produkcja sondy do selekcji komórek szklanych
<ol>
	<li>Przekształć szklaną rurkę z pojedynczym otworem w stożkową sondę z ostrą końcówką.
	<ol>
		<li>Umieść szklaną rurkę z pojedynczym otworem (ID: 0.3 mm, OD: 1.1. mm) w clamps pionowego uchwytu na pipety, centrując szkło w stosunku do wężownicy grzewczej i dokręć, aby zabezpieczyć rurkę na miejscu. Wężownica grzewcza składa się z drutu oporowego niklowo-chromowego o średnicy 18 mm (o długości ~60 mm) nawiniętego wokół metalowego pręta (średnica = 3,90 mm) 2,5 razy.</li>
		<li>Ustaw szklaną rurkę z programem temperatury 19.5 (jednostka producenta). Ten parametr może być modyfikowany dla konkretnego instrumentu.</li>
		<li>Ustawić tłok elektromagnesu na 4 (jednostka producenta). Ten parametr może być modyfikowany dla konkretnego instrumentu.</li>
		<li>Uruchom elektrozawór, aby pociągnąć szklaną rurkę. Ten krok tworzy dwie sondy połączone na końcówce.</li>
		<li>Za pomocą pęsety odetnij ~1 mm od końcówki każdej sondy, tworząc otwór o średnicy ~10 μm na końcówce sondy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zegnij szklaną sondę, aby łatwo połączyć ją z konfiguracją ICMP/SCMS z pojedynczą sondą.
	<ol>
		<li>Umieść wyciągniętą szklaną sondę w mikrokuźni, umieszczając końcówkę ~3 mm nad platynowym drutem grzejnym.</li>
		<li>Zwiększ temperaturę na platynowym przewodzie do 30% temperatury maksymalnej.</li>
		<li>Zegnij sondę o ~45° od pierwotnej pozycji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zintegrowany zespół platformy do manipulacji komórkami
<ol>
	<li>Umieść odwrócony mikroskop, mikrowtryskiwacz i dwa systemy manipulacji komórkami na zmotoryzowanym stole, aby łatwo połączyć się ze spektrometrem masowym.
	<ol>
		<li>Zmodyfikuj jeden z systemów manipulacji komórkami, aby dostosować go do pojedynczej sondy, zastępując koniec zaciskiem ramienia.</li>
		<li>Za pomocą plastikowej strzykawki z igłą napełnić mikrowstrzykiwacz olejem mineralnym. Unikaj pęcherzyków w rurce, ponieważ wpłynie to na ssanie.</li>
		<li>Zastąp wkład stolika mikroskopu odwróconego podgrzewaną płytką. Ustawić podgrzewaną płytę w temperaturze 37 °C przed analizą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj urządzenie do wyboru szklanych komórek.
	<ol>
		<li>Włóż szklaną sondę wyboru komórek do metalowego uchwytu mikrowtryskiwacza, umieszczając dłuższą (niewygiętą) stronę w uchwycie kapilary i dokręcając, aby zamocować sondę na miejscu. Ustaw końcówkę sondy pod kątem równolegle do podgrzewanej płyty. 
		UWAGA: Szklana sonda jest bardzo ostra i delikatna i łatwo pęka. Chroń oczy i zachowaj szczególną ostrożność podczas wkładania sondy do mikrowtryskiwacza.</li>
		<li>Zamocuj metalowy uchwyt mikrowtryskiwacza w systemie manipulacji komórkami. Umieść końcówkę sondy w pobliżu środka odwróconego światła mikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Stwórz przedłużoną rurkę do transferu jonów dla wlotu spektrometru masowego
<ol>
	<li>Użyj noża do metalu, aby wyciąć kawałek rurki ze stali nierdzewnej (OD: 0.0625 (1/16) cala, ID: 0.021 cala) o długości ~250 mm.</li>
	<li>Zmierz 135 mm od końca i umieść metal dziki tak, aby ~135 mm było wystawione na działanie atmosfery, a ~115 mm znajdowało się wewnątrz spektrometru masowego. Zabezpiecz dzikusa za pomocą dwóch kluczy, aby go dokręcić.</li>
</ol>
4. Sprzężenie ICMP z konfiguracją z jedną sondą
<ol>
	<li>Zamocuj szklany suwak zawierający pojedynczą sondę w ramieniu clamp systemu manipulacji komórkami. 
	UWAGA: Pojedyncze sondy są wytwarzane zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem48 z dwiema drobnymi zmianami w obecnym badaniu: emiter nano-ESI jest wydłużony, aby ułatwić sprzężenie ze spektrometrem masowym, a pojedyncze sondy są przyklejone do szklanej strony po prawej stronie, aby uniknąć zakłócania ruchu przestrzennego urządzenia do selekcji szklanych komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Podłącz kapilarnę dostarczającą rozpuszczalnik do złącza przewodzącego, umieszczając kapilar w tulei (1/16 x 0,005 cala) plastikowej tulejki i dokręcając złączkę palcami.
	<ol>
		<li>Podłącz drugą stronę złączki przewodzącej do kapilary (ID: 40 μm, OD: 150 μm), która jest podłączona do strzykawki zawierającej rozpuszczalnik do pobierania próbek, umieszczając kapilar w tulei (1/32 x 0,007 cala) i dokręcając złączkę. W tych eksperymentach należy użyć acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym jako rozpuszczalnika do pobierania próbek. 
		UWAGA: Rozpuszczalnik do pobierania próbek jest elastyczny, ale powinien zawierać przede wszystkim acetonitryl (lub acetonitryl z kwasem mrówkowym dla lepszej jonizacji) w celu szybkiej lizy komórek w mikroskali.</li>
		<li>Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej na spektrometrze masowym.</li>
		<li>Umieść przewód napięcia jonizacji na drucie miedzianym przymocowanym do złącza przewodzącego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść emiter nano-ESI ~1 mm do otworu przedłużonej rurki przesyłowej jonów.
	<ol>
		<li>Użyj systemu manipulacji komórkami, aby kontrolować ruchy przestrzenne pojedynczej sondy i umieść emiter nano-ESI centralnie przed przedłużoną rurką do przesyłu jonów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie próbki z zawieszonych komórek
<ol>
	<li>Dzień przed analizą (~18-24 h) wysiać komórki do badania w kolbie do hodowli komórkowej (T25). Ludzkie komórki białaczki szpikowej K562 są używane jako modele w tym badaniu.
	<ol>
		<li>Podgrzewać 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i pożywkę Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnioną 10% syntetyczną płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną w temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
		<li>Nasiona ~ 1 x 106 komórek o łącznej objętości 10 ml poprzez połączenie komórek z ciepłym podłożem. Ogólnie rzecz biorąc, za pomocą pipety o pojemności 10 ml umieść 8 ml pożywki RPMI w kolbie do hodowli komórkowych. Następnie użyj pipety o pojemności 2 ml, aby umieścić 2 ml zlewających się komórek K562 na pożywce dla ~1 x 106 komórek.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do czasu analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj komórki do analizy.
	<ol>
		<li>Pipetować komórki z kolby do hodowli komórkowych do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Wirować komórki w temperaturze 400 x g i temperaturze 37 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 4 ml pożywki RPMI zawierającej związek leczniczy o pożądanym stężeniu poddanym działaniu substancji. 
		UWAGA: W celu analizy komórek kontrolnych ponownie zawieś komórki w 4 ml pożywki RPMI i przejdź do kroku 6.</li>
		<li>Inkubować komórki przez cały czas trwania zabiegu w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Obracać komórki w temperaturze 400 x g i temperaturze 37 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.</li>
		<li>Komórki zawiesza się ponownie w 10 ml PBS i wiruje w temperaturze 400 x g i temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok 3 razy, aby zminimalizować wykrywanie leku ze składników zewnątrzkomórkowych.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 4 ml PBS w celu analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Wykonuj pomiary SCMS za pomocą konfiguracji ICMP/pojedynczej sondy
<ol>
	<li>Dostosuj parametry spektrometru mas do eksperymentu.
	<ol>
		<li>Pod nagłówkiem Scan Mode (Tryb skanowania) oprogramowania instrumentu wybierz opcję Define Can (Definiuj skanowanie). Użyj rozdzielczości 60 000 m/∆ m przy m/z 400, 1 mikroskopu, maksymalnego czasu wtrysku 100 ms i włączonej automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC). Do eksperymentów wykorzystano zakres mas (m/z) 100-1000. Parametry mogą być modyfikowane w zależności od modelu urządzenia.</li>
		<li>W obszarze Pompa strzykawkowa wybierz natężenie przepływu 150 nL/min. Natężenie przepływu należy zoptymalizować dla każdego eksperymentu.</li>
		<li>Wybierz źródło NSI i przyłóż napięcie ~4,5 kV. Ten parametr należy również zoptymalizować dla każdego eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz odwrócony mikroskop (z 40-krotnym powiększeniem wybranym zarówno dla górnej, jak i dolnej soczewki) i podłącz go do portu USB laptopa, aby przechwytywać obraz na żywo. Włącz podgrzewaną płytę i ustaw ją na 37 °C.</li>
	<li>Na komputerze przejdź do karty Pobieranie danych i wybierz opcję Stale w obszarze Czas pobierania.</li>
	<li>Przygotować próbkę do analizy.
	<ol>
		<li>Pobrać pipetą 2-3 ml próbki do pokrywki małej szalki Petriego (35 mm x 12 mm).</li>
		<li>6.4.2 Umieścić próbkę w środku światła z odwróconego mikroskopu na górze podgrzewanej płytki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj sondę wyboru szklanej komórki do analizy. Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć sondę tak, aby jej końcówka była skupiona pod odwróconym mikroskopem w tej samej płaszczyźnie co komórki.</li>
	<li>Zaznacz pojedynczą komórkę do analizy.
	<ol>
		<li>Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć końcówkę sondy wyboru komórek do docelowej komórki. Proces ten jest monitorowany za pomocą odwróconego mikroskopu. 
		UWAGA: Jeśli końcówka sondy wyboru komórek nie może być zogniskowana w tej samej płaszczyźnie co komórki, możliwe, że wygięta część sondy nie jest odpowiednio ustawiona. Dostosuj położenie sondy wyboru komórek, aż obie końcówki sondy będą mogły zostać ustawione ostrość wraz z komórkami pod mikroskopem.</li>
		<li>Delikatnie obróć uchwyt mikrowtryskiwacza, aby wyregulować położenie oleju mineralnego wewnątrz rurki. Mikroiniektor zapewnia delikatne ssanie, aby przymocować docelową komórkę do końcówki sondy wyboru komórek. 
		UWAGA: Jeśli komórka nie może zostać przechwycona przez sondę wyboru komórek przez siłę ssania, sprawdź sondę wyboru komórek, aby upewnić się, że jest całkowicie włożona do uchwytu kapilary. Ponadto sprawdź poziom oleju mineralnego w mikrowtryskiwaczu i rurkach oraz usuń powietrze, jeśli takie jest.</li>
		<li>Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć komórkę na końcówce sondy wyboru komórek do końcówki pojedynczej sondy, używając mikroskopu cyfrowego skoncentrowanego na końcówce pojedynczej sondy w celu monitorowania tego procesu. Po dotknięciu, mała kropelka acetonitrylu na końcówce pojedynczej sondy indukuje szybką lizę komórki, a następnie lizat komórkowy jest natychmiast jonizowany do analizy on-line MS. 
		UWAGA: Ponieważ wybrana komórka jest przymocowana do końcówki sondy wyboru komórek poprzez delikatne zasysanie, ogniwo to może zostać potencjalnie odłączone podczas przesyłania do końcówki z pojedynczą sondą. Dlatego, jeśli sygnały jonowe typowych lipidów komórkowych (patrz reprezentatywne wyniki poniżej) nie zostaną zaobserwowane w ciągu 5 sekund, możliwe jest, że komórka została odczepiona i konieczne jest wybranie innej komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zintegrowana platforma do manipulacji i analizy komórek została skonstruowana w celu rozszerzenia wszechstronności metody MS z pojedynczą sondą, umożliwiając szybką analizę on-line komórek nieprzylegających w środowisku zbliżonym do natywnego. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymagane jest minimalne przygotowanie próbki, więc komórki są analizowane w warunkach naśladujących ich standardowy stan. W szczególności poszczególne komórki będące przedmiotem zainteresowania mogą być wizualnie identyfikowane i wybierane, minimalizując wpływ efektu matrycy na wydajność jonizacji MS przy jednoczesnym utrzymaniu komórek w ich naturalnym środowisku, dzięki czemu wyniki są bardziej reprezentatywne dla natywnego statusu komórek (ryc. S3). Technika ta może być potencjalnie wykorzystana do badania komórek pacjentów zawieszonych w płynach biologicznych w przyszłych badaniach. Kolejną zaletą tej techniki jest elastyczny dobór rozpuszczalnika do pobierania próbek. Ważne jest, aby uwzględnić acetonitryl jako główny rozpuszczalnik do pobierania próbek, aby liza w mikroskali mogła przebiegać szybko. Potencjalnie wewnętrzne wzorce (np. znakowane izotopowo związki lecznicze) mogą być dodawane do rozpuszczalnika do pobierania próbek w celu ilościowego określenia cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania (np. cząsteczek leków) z pojedynczych komórek, w tym tych, które mogą odegrać kluczową rolę w zrewolucjonizowaniu personalizacji leczenia lekami w przyszłości54.
Chociaż ten zintegrowany system może być wygodnie używany do analizy szerokiego zakresu komórek, ograniczeniem metody jest to, że ani sonda pojedyncza, ani sonda selekcyjna nie są dostępne na rynku; dyktowanie potrzeby optymalizacji wielu parametrów (np. natężenia przepływu, napięcia, długości między emiterem nano-ESI a rurką do przesyłu jonów itp.) przed każdym eksperymentem. Ponadto, ze względu na małą średnicę sondy pojedynczej sondy i sondy wyboru ogniw, zakłócenia środowiskowe (np. przepływ powietrza) mogą powodować trudności w ustaleniu połączenia między dwiema sondami. Krótkoterminowym rozwiązaniem jest zgięcie sondy selekcyjnej komórki blisko końca, aby zminimalizować długość zwężania. Przyszłe prace obejmują opracowanie obudowy, która otworzy krytyczne części instalacji w celu zminimalizowania wpływu na środowisko. Ze względu na ograniczoną ilość zawartości komórkowej i krótki czas pozyskiwania (~2-3 s) z komórki, analizę MS/MS można przeprowadzić tylko dla gatunków stosunkowo licznych. Inne czynniki wpływające na czułość detekcji to stłumiona skuteczność jonizacji spowodowana wprowadzeniem matrycy wraz z ogniwem oraz potencjalna utrata jonów przez przedłużoną rurkę transferu jonów.

Biologia człowieka, zwłaszcza biologia chorób, jest coraz częściej rozumiana jako wynik działań na poziomie pojedynczych komórek, ale tradycyjne metody analityczne, takie jak chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCMS), są zazwyczaj używane do analizy próbek przygotowanych z populacji komórek, podczas gdy uzyskane informacje molekularne nie mogą dokładnie reprezentować procesów chemicznych na poziomie pojedynczej komórki. Te standardowe, tradycyjne metody nie są w stanie dostrzec wpływu niejednorodności komórkowej na pomiar analityczny, a proces niszczenia i mieszania komórek w celu przygotowania lizatu potencjalnie prowadzi do zmiany lub utraty składników komórkowych1,2. Te ograniczenia tradycyjnych metod są szczególnie ważne w analizie komórek pacjentów, w których uzyskane próbki mogą zawierać złożoną mieszaninę wielu różnych typów komórek. Aby przezwyciężyć te braki, metody analizy molekularnej pojedynczych komórek, w tym metody spektrometrii mas pojedynczych komórek (SCMS), są coraz częściej opracowywane i stosowane w bioanalizie, zwłaszcza metabolitów komórkowych i biomolekuł o niskiej masie cząsteczkowej3,4.
Pierwsze opracowane techniki SCMS wykorzystywały techniki oparte na próżni do przeprowadzania analiz w warunkach niezwiązanych z otoczeniem2,5,6,7,8,9,10,11. Techniki SCMS bez otoczenia są w stanie analizować lipidy komórkowe i metabolity, ale wymagają wstępnej obróbki próbki w sztucznych warunkach, a zatem nie nadają się do analizy w czasie rzeczywistym. Proces przygotowania próbki do analizy poza otoczeniem obejmuje dodanie składników matrycy, a przygotowanie to może zmienić składniki komórkowe z ich naturalnego środowiska12. Dlatego techniki spektrometrii mas otoczenia (MS), które nie wymagają próżni w środowisku próbkowania, są wykorzystywane do analizy komórek w środowisku zbliżonym do natywnego. Brak środowiska próżniowego pozwala na wszechstronność w projekcie eksperymentalnym; Można dodać kamery w celu monitorowania procesu komórkowego, a bardziej miękkie techniki jonizacji można połączyć z technikami separacji, aby uzyskać lepsze informacje z każdego eksperymentu na pojedynczej komórce4,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41, 42.
Metoda SCMS z pojedynczą sondą to technika otoczenia, która analizuje żywe, rakowe linie komórkowe ssaków w środowisku zbliżonym do natywnego21,43,44,45,46. Ponadto urządzenie z pojedynczą sondą było używane do innych zastosowań spektrometrii mas, w tym do analizy cząsteczek zewnątrzkomórkowych w sferoidach wielokomórkowych i obrazowania MS tkanek47,48,49,50,51,52. Ponieważ jednak w tej metodzie wymagane jest unieruchomienie komórek na substratach, komórki zawiesinowe nie mogą być bezpośrednio analizowane przy użyciu tej techniki3,53. W związku z tym system SCMS z pojedynczą sondą nie mógł być bezpośrednio używany do pobierania próbek pojedynczych komórek, które nie przylegają, takich jak nieprzylegające linie komórkowe lub komórki zawiesinowe wyizolowane z krwi pacjenta lub innych płynów ustrojowych54. W tej pracy zintegrowana platforma manipulacji komórkami (ICMP) jest sprzężona z techniką SCMS z pojedynczą sondą do analizy żywych, zawieszonych komórek on-line przy minimalnym przygotowaniu próbki (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1) 46. ICMP składa się z odwróconego mikroskopu do monitorowania wyboru komórek, szklanej sondy selekcyjnej komórek, mikrowtryskiwacza do wychwytywania pojedynczych pływających komórek, podgrzewanej płytki do utrzymywania temperatury komórkowej, dwóch systemów manipulacji komórkami do kontrolowania ruchów przestrzennych zarówno szklanej sondy selekcyjnej, jak i pojedynczej sondy oraz mikroskopu cyfrowego do obserwacji transferu komórek z końcówki sondy selekcyjnej do końcówki pojedynczej sondy. Produkcja pojedynczej sondy jest szczegółowo opisana w poprzednich publikacjach i nie będzie omawiana tutaj21,48. System ICMP/pojedynczej sondy jest sprzężony ze spektrometrem mas o wysokiej rozdzielczości. Ta zintegrowana konfiguracja pozwala na pobieranie próbek zidentyfikowanych pojedynczych komórek ze złożonych próbek biologicznych przy minimalnym wpływie cząsteczek matrycy.

<table><tbody><tr><td>acetontryl</td><td>millipore Co.</td><td>AX0145-1</td><td>Rozpuszczalnik do pobierania próbek</td></tr><tr><td>CellTram Vario</td><td>Eppendorf</td><td>6221</td><td>ICMP</td></tr><tr><td>Drut miedziany</td><td>stores.ebay.com/jewelerheaven</td><td>Dead soft, okrągły, 20 gauge, 25 ft</td><td>Konfiguracja złączy przewodzących</td></tr><tr><td>Cyfrowy mikroskop stereoskopowy</td><td>Shenzhen D& F Co.</td><td>Supereyes T004</td><td>Analysis</td></tr><tr><td>Jednorazowa mikropipeta, 1-5 i mikro; L</td><td>Rochester Scientific</td><td>5065</td><td>Produkcja sondy selekcyjnej komórek</td></tr><tr><td>Rurki kwarcowe z podwójnym otworem, 1,120 "x0,005" x12 "</td><td>Friedrich & Dimmock, Inc.</td><td>MBT-005-020-2Q</td><td>Produkcja pojedynczej sondy</td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa</td><td>Devcon</td><td>Nr części 20945</td><td>Produkcja pojedynczej sondy</td></tr><tr><td>System manipulacji komórkami Eppendorf Eppendorf</td><td></td><td>Transferman NK517800397-U.R.</td><td>Icmp</td></tr><tr><td>Nakrętka zewnętrzna</td><td>VALCO*CHEMINERT</td><td>EN1</td><td>Produkcja rurki jonowej</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388-500ML</td><td>Rozpuszczalnik do pobierania próbek</td></tr><tr><td>Kapilara z topionej krzemionki, ID: 40 &micro; m, OD: 100 i mikro; m</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP040105</td><td>Produkcja z pojedynczą sondą, konfiguracja złączy przewodzących</td></tr><tr><td>Kapilara z topionej krzemionki, ID: 50 i mikro; m, OD: 150 i mikro; m</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150015</td><td>Konfiguracja złączy przewodzących</td></tr><tr><td>HyClone Syntetyczna płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Fischer Sci</td><td>SH3006603</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Mikrofiltr liniowy</td><td>IDEX Zdrowie i Science LLC</td><td>M-520</td><td>Konfiguracja złącza przewodzącego</td></tr><tr><td>Ściągacz laserowy Sutter</td><td>Instrument Co.</td><td>Model P-2000</td><td>Lampa UV LED z pojedynczą sondą</td></tr><tr><td></td><td>Foshan Liang Ya Dental Equipment</td><td>LY-C240</td><td>Produkcja pojedynczej sondy</td></tr><tr><td>LTQ Spektrometr masowy Orbitrap</td><td>Thermo Scientific</td><td>LTQ Orbitrap XL</td><td>Analysis</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige, Co.</td><td>MF-9</td><td>Produkcja sondy selekcyjnej</td></tr><tr><td>Microunion</td><td>IDEX Zdrowie i Science LLC</td><td>M-539</td><td>Przewodzące rurki</td></tr><tr><td>PEEK, 1/32x0,005x 5ft</td><td>IDEX Health & Science LLC</td><td>1576</td> Rurki PEEK z <td>kondukcją złącza</td></tr><tr><td>, 1/32x0,007x 5ft</td><td>IDEX Health & Science LLC</td><td>1577</td><td>Konfiguracja złącza przewodzącego</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr> szalka <tr><td>Petriego, 35x10 mm</td><td>VWR</td><td>25382-334</td><td>Przygotowanie próbki</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>VWR</td><td>0780-50L</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Drut platynowy</td><td>Narishige, Co.</td><td>Model PT-A</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>Nikon</td><td>PSM-2120</td><td>ICMP</td></tr><tr><td>RPMI, 1X z Corning glutagro</td><td>Corning</td><td>10-104-CV</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Rury jednootworowe</td><td>Boralex</td><td>5065</td><td>Produkcja sondy wyboru komórek</td></tr><tr><td>Tuleje ze stali nierdzewnej, do 1/16" OD</td><td>IDEX Zdrowie & Science LLC</td><td>VHP-200-01x</td><td>Produkcja rur do przenoszenia jonów</td></tr><tr><td>Rurki ze stali nierdzewnej, 1/32x 205 i mikro; m x30 cm</td><td>IDEX Zdrowie & Science LLC</td><td>U-1128</td> Strzykawka <td>do produkcji rurek do przenoszenia jonów</td></tr><tr><td>, 250 i mikro; L</td><td>Hamilton</td><td>1725LTN250UL</td><td>Strzykawka do pobierania próbek</td></tr><tr><td>Kolba T25</td><td>CellStar</td><td>690160</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Thermo LTQ XL kołnierz interfejsu źródła jonów</td><td>Nowy obiektyw</td><td>PB5500</td><td>Analiza</td></tr><tr><td>ThermoPlate</td><td>TokaiHit</td><td>55R30N</td><td>ICMP</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Obcinak do rur, do 1/16" stal nierdzewna</td><td>SUPELCO</td><td>58692-U</td><td>Produkcja rurek do przenoszenia jonów</td></tr><tr><td>Mikroskop fotografii cyfrowej USB</td><td>dx.com</td><td>SO2 25 ~ 500X</td><td>Analiza</td></tr><tr><td>żywica utwardzana promieniami UV</td><td>Prime Dental</td><td>Nr artykułu 006.030</td><td>Produkcja pojedynczej sondy</td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz do pipet</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 720</td><td>Produkcja sondy wyboru komórek</td></tr><tr><td>Obudowa napięciowa</td><td>Interfejs PicoChip</td><td>PCH-A00120</td><td>ICMP/MS</td></tr><tr><td>Przecinak do drutu</td><td>Rzemieślnik</td><td>4 1/2 cala szczypce końcowej</td><td>Konfiguracja złącza przewodzącego</td></tr></tbody></table>

zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Spektrometria mas pojedynczej komórki (SCMS) umożliwia czułe wykrywanie i dokładną analizę szerokiego zakresu gatunków komórkowych na poziomie pojedynczej komórki. Pojedyncza sonda, urządzenie do pobierania próbek i jonizacji w mikroskali, może być sprzężona ze spektrometrem mas do szybkiej analizy on-line składników komórkowych SCMS w warunkach otoczenia. Wcześniej technika SCMS z pojedynczą sondą była stosowana przede wszystkim do pomiaru komórek unieruchomionych na podłożu, co ograniczało typy komórek do badań. W obecnym badaniu technologia SCMS z pojedynczą sondą została zintegrowana z systemem manipulacji komórkami, zwykle używanym do zapłodnienia in vitro. Ta zintegrowana platforma do manipulacji i analizy komórek wykorzystuje sondę selekcyjną do wychwytywania zidentyfikowanych pojedynczych komórek pływających i przenoszenia komórek do końcówki pojedynczej sondy w celu lizy w mikroskali, a następnie natychmiastowej analizy spektrometrii mas. Ten proces wychwytywania i przenoszenia usuwa komórki z otaczającego roztworu przed analizą, minimalizując wprowadzanie cząsteczek matrycy do analizy spektrometrii mas. Ta zintegrowana konfiguracja jest zdolna do analizy SCMS docelowych izolowanych przez pacjenta komórek obecnych w próbkach płynów ustrojowych (np. moczu, krwi, śliny itp.), co pozwala na potencjalne zastosowania analizy SCMS w medycynie ludzkiej i biologii chorób.

W pierwszej kolejności do opracowania metody eksperymentalnej wykorzystano niepoddane działaniu leków komórki K562. W typowym eksperymencie SCMS można zaobserwować wyraźne zmiany w widmach mas podczas przenoszenia komórki, w trakcie detekcji zawartości komórkowej oraz po zakończeniu pomiaru (Rycina S1). Aby upewnić się, że komórka została pomyślnie przeniesiona, a zawartość komórkowa została wykryta, monitorowano trzy powszechne piki lipidów komórkowych (fosfatydylocholina, PC), w tym PC(34:4) (m/z 754,536), PC(36:4) (m/z 782,567) oraz PC(38:5) (m/z 808,583) (Rycina S2)21,43,46,5,56. Jeśli piki lipidów nie pojawią się w ciągu 5 s, należy zmienić poziom oleju mineralnego w mikroinjektorze, aby zmniejszyć siłę ssania utrzymującą komórkę na końcówce sondy do selekcji komórek; należy zachować ostrożność, aby nie wypchnąć oleju mineralnego z sondy do selekcji komórek. Tożsamość wielu PC w zakresie mas m/z 750-850 została potwierdzona za pomocą MS/MS na próbkach lizatu niepoddanych działaniu leków (Rycina 3, Rycina S2, Tabela 1)46.
W celu zwiększenia wszechstronności metody komórki K562 poddano również działaniu różnych związków leczniczych. Komórki K562 inkubowano z gemcytabiną (1 µM) i taksolem (1 µM) przez 1 h oraz z OSW-1 (100 nM, 1 µM) odpowiednio przez 4 h i 2 h. Następnie komórki przemyto PBS, aby zminimalizować wykrywanie związków leków z treści pozakomórkowej. Wpływ matrycy (np. jonów z pożywki hodowlanej, PBS i rozpuszczalnika) na widma masowe treści komórkowej można wyeliminować poprzez odejmowanie danych, ze względu na ich znacząco różniące się sygnały jonowe (Rycina S3). Wszystkie trzy związki leków wykryto przy użyciu układu ICMP/single-probe MS (Rycina S4)46. Wyniki te sugerują, że metoda ta może być wykorzystana do badania wewnątrzkomórkowych lipidów, leków i metabolitów na poziomie pojedynczej komórki w komórkach w roztworze w środowisku zbliżonym do naturalnego.
<img alt="Układ do analizy komórek metodą spektrometrii mas z pojedynczą sondą, mikroskopem odwróconym i jonizacją przy napięciu 4,5 kV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Układ doświadczalny dla eksperymentów MS z pojedynczychmi komórkami w zawiesinie. (AZintegrowana platforma manipulacji komórkami (ICMP) sprzężona ze spektrometrem mas.B) Schemat analizy komórek w zawiesinie. (C) Widok eksperymentalny komórek K562 przeznaczonych do selekcji przy użyciu sondy do selekcji komórek. Przedrukowano za zgodą Standke i wsp.46. Copyright 2019 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Zmodyfikowany schemat pojedynczej sondy z układem do selekcji komórek, przedstawiający kapilarę oraz dwukanałową igłę kwarcową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Zdjęcia zmodyfikowanej sondy pojedynczej oraz sondy do selekcji komórek wykorzystywanych w eksperymentach MS z pojedynczymi komórkami w zawiesinie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wynik spektrometrii mas przedstawiający piki analizy lipidów, wykres m/z względem względnej intensywności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59875/59875fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Powiększone widmo mas pojedynczej komórki przedstawiające reprezentatywne gatunki (m/z 750-850)Struktury chemiczne potwierdzono za pomocą analizy MS/MS (Rycina S1). Przedrukowano za zgodą Standke i wsp.46Copyright 2019 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59875/59875fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cząsteczka leku*</td>
			<td>m/z</td>
			<td>Błąd masy (ppm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Gemcytabina + H]+</td>
			<td>264.076</td>
			<td>11.32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Taxol + Na]+</td>
			<td>876.318</td>
			<td>2.74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[OSW-1 + Na]+</td>
			<td>895.445</td>
			<td>0.89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidy komórkowe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[PC(34:4) + H]+</td>
			<td>754.535</td>
			<td>3.71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[PC(34:3) + H]+</td>
			<td>756.551</td>
			<td>3.44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[PC(34:2) + H]+</td>
			<td>758.569</td>
			<td>0.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[PC(36:5) + H]+</td>
			<td>780.551</td>
			<td>3.07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[PC(36:4) + H]+</td>
			<td>782.568</td>
			<td>2.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[PC(36:3) + H]+</td>
			<td>784.585</td>
			<td>0.64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[PC(38:7) + H]+</td>
			<td>804.551</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[PC(38:6) + H]+</td>
			<td>806.567</td>
			<td>2.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[PC(38:5) + H]+</td>
			<td>808.583</td>
			<td>2.72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[PC(38:4) + H]+</td>
			<td>810.601</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[PC(40:7) + H]+</td>
			<td>832.583</td>
			<td>3.12</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Zidentyfikowane składniki komórkowe z wykorzystaniem układu ICMP/Single-probe. Wykrycie wszystkich związków leków zostało potwierdzone poprzez porównanie wyników MS/MS ze wzorcem związku.

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami została opracowana do użytku w połączeniu z jednosondowym zestawem spektrometrii mas do analizy on-line pojedynczych komórek zawiesinowych w warunkach otoczenia.

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Ponieważ ta metoda analizuje komórki z roztworu, może być używana do badania komórek w środowisku zbliżonym do natywnego. Obejmuje to analizę próbek komórek pobranych od pacjenta. Technika ta wymaga niewielkiego lub żadnego przygotowania próbki komórek.Dzięki temu możemy analizować poszczególne komórki online w warunkach otoczenia, co pozwala nam badać niejednorodność komórkową. Technika ta może być stosowana do badania płynnych biopsji z różnych stanów chorobowych, ponieważ może analizować różne typy komórek bezpośrednio izolowanych z próbek pacjentów. Aby przekształcić szklaną rurkę z pojedynczym otworem w stożkową sondę z ostrą końcówką, najpierw umieść szklaną rurkę z pojedynczym otworem w zaciskach pionowego uchwytu na pipety, centrując szkło w stosunku do wężownicy grzewczej i dokręć, aby zabezpieczyć rurkę na miejscu.Wężownica grzewcza składa się z drutu oporowego niklowo-chromowego o grubości 18 mm, nawiniętego wokół metalowego pręta 2,5 razy. Ustaw szklaną rurkę z programem temperatury 19.5. Ustawić tłok elektromagnesu na cztery.Uruchom elektrozawór, aby pociągnąć szklaną rurkę. Ten krok tworzy dwie sondy połączone na końcówce. Użyj swetrów, aby odciąć około jednego milimetra od końcówki każdej sondy, tworząc otwór o średnicy około 10 mikronów na końcówce sondy.Aby zgiąć szklaną sondę w celu łatwego sprzężenia z ICMP, skonfigurowano pojedynczą sondę SCMS. Najpierw umieść wyciągniętą szklaną sondę w mikrokuźni. Umieść górę około trzech milimetrów nad platynowym drutem grzejnym.Następnie zwiększ temperaturę na platynowym przewodzie do 30% temperatury maksymalnej. Zegnij sondę o około 45 stopni od pierwotnej pozycji. Umieść mikrowstrzykiwacz z odwróconym mikroskopem w dwóch systemach manipulacji komórkami na zmotoryzowanym stole w celu łatwego sprzężenia ze spektrometrem masowym.Aby skonfigurować urządzenie do wyboru szklanych komórek, włóż sondę wyboru szklanych komórek do metalowego uchwytu mikrowtryskiwacza, umieszczając długą prowadnicę w uchwycie kapilary i dokręcając, aby zamocować sondę na miejscu. Umieść końcówki sondy pod kątem równolegle do podgrzewanej płyty. Przymocuj metalowy uchwyt mikrowtryskiwacza do systemu manipulacji komórkami.Następnie umieść końcówkę sondy w pobliżu środka odwróconego światła mikroskopu. Zamocuj szklaną szkiełko zawierającą pojedynczą sondę w ramieniu clamp systemu manipulacji komórkami. Podłącz rozpuszczalnik dostarczający kapilarę do złącza przewodzącego, umieszczając kapilar w tulei plastikowej tulejki i dokręcając palcami złączkę.Podłączyć drugą stronę złączki przewodzącej do kapilary, która jest połączona ze strzykawką zawierającą rozpuszczalnik do pobierania próbek, umieszczając kapilar w tulei i dokręcając złączkę. W tych eksperymentach należy użyć acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym jako rozpuszczalnika do pobierania próbek. Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej na spektrometrze masowym.Umieść jonizację nanoelektronizacyjną lub emiter nano ESI około jednego milimetra do otworu przedłużonej rurki do przenoszenia jonów. Użyj systemu manipulacji komórkami, aby kontrolować ruchy przestrzenne pojedynczej sondy i umieść emiter nano ESI centralnie przed przedłużoną rurką do przenoszenia jonów. Odpipetować komórki z kolby do hodowli komórkowej do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Obracaj komórki w temperaturze 400 razy G w 37 stopniach Celsjusza przez pięć minut i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w czterech mililitrach pożywki RPMI zawierającej związek leczniczy o pożądanym stężeniu terapeutycznym. Dostosuj parametry eksperymentalne spektrometru masowego.Pod nagłówkiem trybu skanowania w oprogramowaniu urządzenia wybierz opcję zdefiniuj skanowanie. Użyj rozdzielczości 60 000 przy M powyżej Z 400, jeden mikroskop maksymalny czas wstrzykiwania 100 milisekund i włączona automatyczna kontrola wzmocnienia. Pod pompą strzykawkową wybierz natężenie przepływu 150 nanolitrów na minutę.Wybierz źródło NSI i przyłóż napięcie około 4,5 kilowolta. Włącz odwrócony mikroskop z 40-krotnym powiększeniem wybranym zarówno dla górnej, jak i dolnej soczewki. Podłącz go do portu USB laptopa, aby przechwytywać kanały wideo na żywo.Włącz podgrzewaną płytę i ustaw ją na 37 stopni Celsjusza. Na komputerze przejdź do zakładki pobierania danych i wybierz opcję Stale w obszarze Czas pozyskania. Aby przygotować próbkę do analizy, należy odpipetować dwie lub trzy próbki do pokrywki małej szalki Petriego.Umieść próbkę w środku światła z odwróconego mikroskopu na górze podgrzewanej płytki. Przygotuj sondę wyboru szklanej komórki do analizy. Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć sondę tak, aby jej górna część była skupiona pod odwróconym mikrocsope w tej samej płaszczyźnie co komórki.Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć końcówkę sondy wyboru komórek do docelowej komórki w celu analizy. Proces ten jest monitorowany za pomocą odwróconego mikroskopu. Delikatnie obróć uchwyt mikrowtryskiwacza, aby wyregulować położenie oleju mineralnego wewnątrz rurki.Mikroiniektor zapewnia delikatne ssanie, aby przymocować docelową komórkę do końcówki sondy wyboru komórek. Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć komórkę na końcówce sondy wyboru komórki do pojedynczej końcówki sondy za pomocą mikroskopu cyfrowego skoncentrowanego na końcówce pojedynczej sondy w celu monitorowania tego procesu. Nieleczone komórki K-562 są używane do ustalenia metody eksperymentalnej.W typowym eksperymencie SCMS można zaobserwować oczywiste zmiany widm masowych wynikające z przeniesienia komórki podczas wykrywania zawartości komórki i po zakończeniu pomiaru. Trzy typowe komórkowe piki lipidowe, w tym PC 34:4, PC 36:4 i PC 38:5, są monitorowane, aby upewnić się, że komórka została pomyślnie przeniesiona i wykryta została zawartość komórkowa. Tożsamość wielu PC w zakresie mas od 750 do 850 została potwierdzona za pomocą MSMS na próbkach lizatu komórkowego niepoddanych działaniu substancji.Za pomocą pojedynczej sondy ICMP MS wykryto gemcytabinę, taksol i OSW1 po inkubacji z komórkami K-562. Wyniki te sugerują, że metoda ta może być stosowana do badania wewnątrzkomórkowych lipidów, leków i metabolitów na poziomie pojedynczej komórki z komórek w roztworze w środowisku zbliżonym do natywnego. Należy pamiętać o bezpiecznym umieszczeniu sondy do wyboru szklanej kuwety w uniwersalnym uchwycie na pipety, aby można było odpowiednio zastosować ssanie.Metoda ta może być również stosowana do próbek pobranych od pacjentów w celu rozróżnienia różnic między metabolitami komórkowymi z różnych typów komórek, co pozwala nam lepiej zrozumieć te stany chorobowe. Po opracowaniu tej metody moglibyśmy potencjalnie wdrożyć kwantyfikację związków leczniczych na poziomie pojedynczej komórki. Podczas pracy z komórkami ważne jest, aby mieć odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny i rękawice.Podczas pracy ze szkłem można stosować dodatkowe okulary.

integrated-cell-manipulation-platform-coupled-with-single-probe-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Tutaj prezentujemy protokoły do wykonywania zarówno obrazowania tkanek za pomocą spektrometrii mas otoczenia (MSI), jak i analizy MS na żywo (SCMS) in situ przy użyciu pojedynczej sondy, która jest zminiaturyzowanym wielofunkcyjnym urządzeniem do analizy MS.

Zastosowania pojedynczej sondy: obrazowanie spektrometrią mas i analiza pojedynczych komórek w warunkach otoczenia

Opisujemy kroki, które umożliwiają szybkie pobieranie próbek in situ małej części pojedynczej komórki z dużą precyzją i minimalną inwazją, przy użyciu mikropróbkowania opartego na kapilarach, aby ułatwić chemiczną charakterystykę migawki aktywności metabolicznej w żywych zarodkach przy użyciu specjalnie zbudowanej platformy do elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas z pojedynczą komórką.

Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis)

Tutaj opisujemy wysokoprzepustową metodę kompleksowego nadzoru nad narkotykami, która pozwala na lepszą rozdzielczość i wykrywanie dużych paneli nadużywanych narkotyków i ich metabolitów, z kontrolą jakości opartą na wielosegmentowej elektroforezie kapilarnej i spektrometrii mas.

Wysokowydajny i kompleksowy nadzór nad lekami za pomocą wielosegmentowej elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas

Ten protokół przedstawia zintegrowaną platformę spektroskopii Ramana i spektrometrii mas (MS), która jest w stanie osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki. Spektroskopia Ramana może być stosowana do badania odpowiedzi komórkowej na leki, podczas gdy stwardnienie rozsiane może być wykorzystywane do ukierunkowanej i ilościowej analizy wychwytu i metabolizmu leków.

Zintegrowana platforma spektroskopii Ramana i spektrometrii mas do badania wychwytu, metabolizmu i efektów stosowania leków w pojedynczych komórkach

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

W tym protokole opisujemy, jak przygotować komórki ssaków do analizy proteomicznej pojedynczej komórki za pomocą spektrometrii mas przy użyciu dostępnych na rynku odczynników i sprzętu, z opcjami zarówno ręcznego, jak i automatycznego pipetowania.

Przygotowanie proteomiki jednokomórkowej do analizy spektrometrii mas z wykorzystaniem lizy cieplno-zamrażalniczej i nośnika izobarycznego

Ten protokół opisuje użycie mikroMS do sterowanej fluorescencją, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, umożliwiając lepsze profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczura.

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Ten protokół opisuje spektrometrię masową pojedynczych komórek obrazowania komórek OVCAR-8 z wykorzystaniem jonizacji z desorpcji i elektrozrygowania połączonych ze spektrometrami masowymi Orbitrap do metabolomiki wysokiej rozdzielczości przestrzennej.

Obrazowanie spektrometrii masowej pojedynczych komórek z wykorzystaniem jonizacji z dezorpcją za pomocą elektrycznej emisji rozpyłowej połączonej ze spektrometrami masy Orbitrap

Poznaj zintegrowaną platformę do analizy pojedynczych komórek zawiesinowych metodą spektrometrii mas z pojedynczą sondą. Technika umożliwia szybkie wykrywanie lipidów, metabolitów i leków w komórkach pacjentów.

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych (Wideo) | JoVE Journal

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych

Przeglądaj więcej filmów