Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami została opracowana do użytku w połączeniu z jednosondowym zestawem spektrometrii mas do analizy on-line pojedynczych komórek zawiesinowych w warunkach otoczenia.

Ponieważ ta metoda analizuje komórki z roztworu, może być używana do badania komórek w środowisku zbliżonym do natywnego. Obejmuje to analizę próbek komórek pobranych od pacjenta. Technika ta wymaga niewielkiego lub żadnego przygotowania próbki komórek.

Dzięki temu możemy analizować poszczególne komórki online w warunkach otoczenia, co pozwala nam badać niejednorodność komórkową. Technika ta może być stosowana do badania płynnych biopsji z różnych stanów chorobowych, ponieważ może analizować różne typy komórek bezpośrednio izolowanych z próbek pacjentów. Aby przekształcić szklaną rurkę z pojedynczym otworem w stożkową sondę z ostrą końcówką, najpierw umieść szklaną rurkę z pojedynczym otworem w zaciskach pionowego uchwytu na pipety, centrując szkło w stosunku do wężownicy grzewczej i dokręć, aby zabezpieczyć rurkę na miejscu.

Wężownica grzewcza składa się z drutu oporowego niklowo-chromowego o grubości 18 mm, nawiniętego wokół metalowego pręta 2,5 razy. Ustaw szklaną rurkę z programem temperatury 19.5. Ustawić tłok elektromagnesu na cztery.

Uruchom elektrozawór, aby pociągnąć szklaną rurkę. Ten krok tworzy dwie sondy połączone na końcówce. Użyj swetrów, aby odciąć około jednego milimetra od końcówki każdej sondy, tworząc otwór o średnicy około 10 mikronów na końcówce sondy.

Aby zgiąć szklaną sondę w celu łatwego sprzężenia z ICMP, skonfigurowano pojedynczą sondę SCMS. Najpierw umieść wyciągniętą szklaną sondę w mikrokuźni. Umieść górę około trzech milimetrów nad platynowym drutem grzejnym.

Następnie zwiększ temperaturę na platynowym przewodzie do 30% temperatury maksymalnej. Zegnij sondę o około 45 stopni od pierwotnej pozycji. Umieść mikrowstrzykiwacz z odwróconym mikroskopem w dwóch systemach manipulacji komórkami na zmotoryzowanym stole w celu łatwego sprzężenia ze spektrometrem masowym.

Aby skonfigurować urządzenie do wyboru szklanych komórek, włóż sondę wyboru szklanych komórek do metalowego uchwytu mikrowtryskiwacza, umieszczając długą prowadnicę w uchwycie kapilary i dokręcając, aby zamocować sondę na miejscu. Umieść końcówki sondy pod kątem równolegle do podgrzewanej płyty. Przymocuj metalowy uchwyt mikrowtryskiwacza do systemu manipulacji komórkami.

Następnie umieść końcówkę sondy w pobliżu środka odwróconego światła mikroskopu. Zamocuj szklaną szkiełko zawierającą pojedynczą sondę w ramieniu clamp systemu manipulacji komórkami. Podłącz rozpuszczalnik dostarczający kapilarę do złącza przewodzącego, umieszczając kapilar w tulei plastikowej tulejki i dokręcając palcami złączkę.

Podłączyć drugą stronę złączki przewodzącej do kapilary, która jest połączona ze strzykawką zawierającą rozpuszczalnik do pobierania próbek, umieszczając kapilar w tulei i dokręcając złączkę. W tych eksperymentach należy użyć acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym jako rozpuszczalnika do pobierania próbek. Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej na spektrometrze masowym.

Umieść jonizację nanoelektronizacyjną lub emiter nano ESI około jednego milimetra do otworu przedłużonej rurki do przenoszenia jonów. Użyj systemu manipulacji komórkami, aby kontrolować ruchy przestrzenne pojedynczej sondy i umieść emiter nano ESI centralnie przed przedłużoną rurką do przenoszenia jonów. Odpipetować komórki z kolby do hodowli komórkowej do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Obracaj komórki w temperaturze 400 razy G w 37 stopniach Celsjusza przez pięć minut i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w czterech mililitrach pożywki RPMI zawierającej związek leczniczy o pożądanym stężeniu terapeutycznym. Dostosuj parametry eksperymentalne spektrometru masowego.

Pod nagłówkiem trybu skanowania w oprogramowaniu urządzenia wybierz opcję zdefiniuj skanowanie. Użyj rozdzielczości 60 000 przy M powyżej Z 400, jeden mikroskop maksymalny czas wstrzykiwania 100 milisekund i włączona automatyczna kontrola wzmocnienia. Pod pompą strzykawkową wybierz natężenie przepływu 150 nanolitrów na minutę.

Wybierz źródło NSI i przyłóż napięcie około 4,5 kilowolta. Włącz odwrócony mikroskop z 40-krotnym powiększeniem wybranym zarówno dla górnej, jak i dolnej soczewki. Podłącz go do portu USB laptopa, aby przechwytywać kanały wideo na żywo.

Włącz podgrzewaną płytę i ustaw ją na 37 stopni Celsjusza. Na komputerze przejdź do zakładki pobierania danych i wybierz opcję Stale w obszarze Czas pozyskania. Aby przygotować próbkę do analizy, należy odpipetować dwie lub trzy próbki do pokrywki małej szalki Petriego.

Umieść próbkę w środku światła z odwróconego mikroskopu na górze podgrzewanej płytki. Przygotuj sondę wyboru szklanej komórki do analizy. Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć sondę tak, aby jej górna część była skupiona pod odwróconym mikrocsope w tej samej płaszczyźnie co komórki.

Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć końcówkę sondy wyboru komórek do docelowej komórki w celu analizy. Proces ten jest monitorowany za pomocą odwróconego mikroskopu. Delikatnie obróć uchwyt mikrowtryskiwacza, aby wyregulować położenie oleju mineralnego wewnątrz rurki.

Mikroiniektor zapewnia delikatne ssanie, aby przymocować docelową komórkę do końcówki sondy wyboru komórek. Użyj systemu manipulacji komórkami, aby przesunąć komórkę na końcówce sondy wyboru komórki do pojedynczej końcówki sondy za pomocą mikroskopu cyfrowego skoncentrowanego na końcówce pojedynczej sondy w celu monitorowania tego procesu. Nieleczone komórki K-562 są używane do ustalenia metody eksperymentalnej.

W typowym eksperymencie SCMS można zaobserwować oczywiste zmiany widm masowych wynikające z przeniesienia komórki podczas wykrywania zawartości komórki i po zakończeniu pomiaru. Trzy typowe komórkowe piki lipidowe, w tym PC 34:4, PC 36:4 i PC 38:5, są monitorowane, aby upewnić się, że komórka została pomyślnie przeniesiona i wykryta została zawartość komórkowa. Tożsamość wielu PC w zakresie mas od 750 do 850 została potwierdzona za pomocą MSMS na próbkach lizatu komórkowego niepoddanych działaniu substancji.

Za pomocą pojedynczej sondy ICMP MS wykryto gemcytabinę, taksol i OSW1 po inkubacji z komórkami K-562. Wyniki te sugerują, że metoda ta może być stosowana do badania wewnątrzkomórkowych lipidów, leków i metabolitów na poziomie pojedynczej komórki z komórek w roztworze w środowisku zbliżonym do natywnego. Należy pamiętać o bezpiecznym umieszczeniu sondy do wyboru szklanej kuwety w uniwersalnym uchwycie na pipety, aby można było odpowiednio zastosować ssanie.

Metoda ta może być również stosowana do próbek pobranych od pacjentów w celu rozróżnienia różnic między metabolitami komórkowymi z różnych typów komórek, co pozwala nam lepiej zrozumieć te stany chorobowe. Po opracowaniu tej metody moglibyśmy potencjalnie wdrożyć kwantyfikację związków leczniczych na poziomie pojedynczej komórki. Podczas pracy z komórkami ważne jest, aby mieć odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny i rękawice.

Podczas pracy ze szkłem można stosować dodatkowe okulary.