Wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami: solidna metoda oznaczania ilościowego znakowanych fluorescencyjnie i derywatyzowanych kwasów sjalowych wyizolowanych z wątroby myszy

Kwasy sjalowe, takie jak kwas N-acetyloneuraminowy i kwas N-glikolyloneuraminowy, są ujemnie naładowanymi ugrupowaniami węglowodanowymi znajdującymi się na dystalnych końcach łańcuchów oligosacharydowych na powierzchni komórek ssaków.

Aby określić ilościowo względne ilości tych kwasów sjalowych w tkance wątroby myszy za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami lub RP-HPLC, najpierw należy potraktować izolowaną mieszaninę kwasu sjalowego środkiem do derywatyzacji. Czynnik derywatyzacyjny oddziałuje z grupami funkcyjnymi kwasów sjalowych, tworząc stabilne, fluorescencyjne pochodne kwasu sjalowego.

Zamontuj kolumnę RP-HPLC podłączoną do detektora fluorescencji. Kolumna składa się z porowatej fazy stacjonarnej na bazie krzemionki połączonej z niepolarnymi, hydrofobowymi ligandami łańcuchów alkilowych w celu ułatwienia selektywnych oddziaływań z pochodnymi kwasu sjalowego podczas przebiegu chromatograficznego.

Zrównoważyć kolumnę za pomocą wodnej polarnej fazy ruchomej zawierającej niskie stężenia acetonitrylu, mniej polarnego rozpuszczalnika organicznego, w celu optymalnego kondycjonowania kolumny.

Załaduj derywatyzowaną mieszaninę kwasu sjalowego do kolumny.

Kwas N-acetyloneuraminowy, zawierający hydrofobową grupę N-acetylową, silniej adsorbuje się do hydrofobowych ligandów fazy stacjonarnej niż kwas N-glikolyloneuraminowy z hydrofilową grupą N-glikolilową.

Analizuj próbki przy użyciu standardowego systemu HPLC podłączonego do detektora fluorescencji online. Do analizy należy użyć kolumny C-18 z odwróconymi fazami o długości 250 mm i średnicy 4,6 milimetra.

Po przygotowaniu rozpuszczalnika A i rozpuszczalnika B oraz skonfigurowaniu przebiegu HPLC zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wstrzyknąć 50 mikrolitrów próbki do systemu HPLC.

Monitoruj eluenty za pomocą fali wzbudzenia detektora fluorescencji o długości 373 nanometrów i długości fali emisji 448 nanometrów.

Na koniec oblicz względną ilość Neu5Gc zgodnie z opisem w protokole tekstowym.