Ilościowa i jakościowa metoda oznaczania sfingomieliny metodą LC-MS przy użyciu dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków sfingomieliny
7 maja 2018
Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia i kwalifikacji każdego gatunku sfingomieliny za pomocą monitorowania wielu reakcji i trybu MS/MS/MS, odpowiednio.
Ogólnym celem tej procedury jest dokładna analiza ilości i struktury każdego gatunku Sfingomieliny w próbkach biologicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie lipidów dotyczące biologii lipidów i lipidów. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy scharakteryzować różne gatunki Sfingomieliny w próbkach biologicznych za pomocą chromatografii systemu spektrometrii mas. Na początek wyjmij pożywkę hodowlaną z 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego komórki HeLa i przepłucz komórki dwukrotnie sześcioma mililitrami lodowatego PBS.
Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego PBS do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej i użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki. Po wyjęciu z powierzchni naczynia przenieś komórki do dwóch mililitrowych silikonowanych plastikowych rurek. Po odwirowaniu usunąć supernatant i dodać jeden mililitr metanolu do każdej osadki komórek.
Następnie krótko zwiruj rurki. Następnie umieść próbki w sonikatorze typu kąpielowym i poddaj sonifikacji z mocą 200 watów przez pięć minut. Po zakończeniu przenieś homogenat całej komórki do probówek wyposażonych w nakrętki wyłożone teflonem.
Teraz dodaj jeden mililitr metanolu, jeden mililitr chloroformu, 0,8 mililitra podwójnie destylowanej wody w 50 mikrolitrach 10 mikromolowych wzorca wewnętrznego do każdej probówki. Zakryj rurki i energicznie wiruj je z prędkością 2 500 obr./min przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj dodatkowy mililitr chloroformu i jeden mililitr podwójnie destylowanej wody do każdej probówki.
Ponownie energicznie wiruj rurki z prędkością 2 500 obr./min przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować próbki, aby całkowicie oddzielić fazę wodną i organiczną. Przenieś dolną fazę do jednorazowych szklanych probówek.
Dodaj dwa mililitry chloroformu do probówek. Następnie energicznie wirować rurki z prędkością 2 500 obr./min przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby wystarczająco wymieszać się z górną fazą i puchem międzyfazowym. Po drugim odwirowaniu przenieś zmodyfikowaną dolną fazę do jednorazowych szklanych probówek wraz z początkową dolną fazą.
Teraz umieść szklane probówki pod strumieniem azotu na około 60 minut i całkowicie usuń rozpuszczalniki organiczne z zebranej dolnej fazy. Na koniec należy rozpuścić próbki w 500 mikrolitrach metanolu lub etanolu. Przefiltrować powstałą mieszaninę za pomocą filtra 0,02 mikrona do szklanych fiolek.
Następnie przechowuj próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wykonaj seryjne rozcieńczenia wzorcowego związku i dodaj 50 mikrolitrów każdego stężenia do oddzielnych probówek. Następnie przygotuj trzy próbki kontroli jakości, dodając do pierwszej próbki ilość w granicach trzykrotności dolnej granicy krzywej wzorcowej, ilość w pobliżu środka krzywej dla drugiej próbki i ilość w pobliżu górnej granicy krzywej wzorcowej dla trzeciej próbki.
Następnie dodaj homogenat komórek w jednym mililitrze metanolu do każdej probówki i wyekstrahuj całkowitą frakcję lipidową z każdej próbki przy użyciu właśnie pokazanej metody. Aby rozpocząć, przygotuj fazę mobilną. Wymieszaj ze sobą acetonitryl, metanol i podwójnie destylowaną wodę w stosunku dwa do dwóch do jednego dla fazy wodnej.
Używaj izopropanolu do fazy organicznej w szklanych butelkach z nakrętkami wyłożonymi teflonem. Następnie poddaj sonikacji obie fazy ruchome przez pięć minut w sonikatorze typu kąpielowym. Następnie dodaj kwas mrówkowy do końcowego stężenia 26,4 milimola i wodorotlenek amonu o stężeniu 14,9 milimola do każdej fazy ruchomej.
W celu przeprowadzenia analizy jakościowej należy aktywować system wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Umieścić probówki wlotowe w szklanych butelkach, które zawierają fazy ruchome i oczyścić przewody HPLC. Następnie połącz kolumnę C18 HPLC z systemem HPLC.
Utrzymuj temperaturę w piecu kolumnowym na poziomie 50 stopni Celsjusza i kondycjonuj kolumnę wodną fazą ruchomą o stężeniu 100 mikrolitrów na minutę. Podczas cyklu należy umieścić próbki w stojaku na próbki próbnika automatycznego. Ustawić parametry systemu potrójnej, poczwórnej i poczwórnej liniowej spektrometrii mas z pułapką jonową dla trzyetapowej analizy spektrometrii mas, zgodnie z tabelą pierwszą i tabelą drugą dołączonego protokołu tekstowego.
Należy również ustawić parametry dla pierwszego i drugiego jonu prekursorowego interesujących gatunków SM, zgodnie z bardziej szczegółowym opisem w dołączonym protokole tekstowym. Utwórz plik wsadowy i prześlij plik wsadowy, aby uzyskać dane dotyczące trzech widm jonów produktu MS każdego rodzaju Sfingomieliny za pomocą chromatografii cieczowej, elektronrozpylania, jonizacji, tandemowej analizy spektrometrycznej mas. Otrzymać trójfazowe widma jonów produktu MS interesujących gatunków Sfingomieliny za pomocą chromatografii cieczowej, analizy tandemowej spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylaną.
Następnie przypisz każdemu MS trzy widma jonów produktowych Sfingomieliny, porównując stosunek masy do ładunku widm jonów produktu w dokładnej masie zasady długołańcuchowej Sfingoidu i interesującego nas ugrupowania n-acylowego. Ilościowo przeanalizować sfingomielinę za pomocą chromatografii cieczowej, jonizacji elektronizacyjnej, analizy tandemowej spektrometrii mas, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie przetwórz dane z monitorowania wielu reakcji za pomocą oprogramowania do integracji danych w celu uzyskania danych dotyczących obszaru piku dla wyekstrahowanego chromatogramu jonowego każdego gatunku Sfingomieliny.
Określ ilościowo każdy gatunek Sfingomieliny i skonstruuj krzywe standardowe zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Przedstawiono tutaj spektrum zarówno chemicznie syntetyzowanej Sfingomieliny, jak i Sfingomieliny w próbkach lipidów wyekstrahowanych z komórek HeLa. Warto zauważyć, że intensywność widma demetylowanej sfingozylofosforylcholiny jest większa niż ugrupowania n-acylowego SM w obu próbkach.
Interesujące jest również widmo odpowiadające sfingozyno-1-fosforanowi przydatne do spekulacji na temat liczby wiązań węglowych i podwójnych długołańcuchowej podstawy sfingomieliny. W obecnej metodzie ilościowej kluczowe znaczenie ma precyzyjne przygotowanie próbek do skonstruowania krzywej kalibracyjnej w celu walidacji tej metody. Krzywa dopasowana do niskiego stężenia została wyraźnie poprawiona dzięki zastosowaniu współczynnika ważenia równego jeden na x kwadrat w porównaniu z zastosowaniem współczynnika ważenia jeden lub jeden na x.
Technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii i przemysłu do scharakteryzowania różnych gatunków Sfingomieliny w próbkach biologicznych i produktach przemysłowych, takich jak kosmetyki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak precyzyjnie analizować ilość i strukturę każdego gatunku Sfingomieliny w próbkach biologicznych. Nie zapominaj, że praca z absorbentami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiednich okularów.
Ponadto ważne jest, aby nosić rękawice, aby zapobiec zanieczyszczeniu lipidów pochodzących z rąk.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę ilościowego i jakościowego określania gatunków sfingomieliny z wykorzystaniem wielokrotnego monitorowania reakcji i technik MS/MS/MS. Ma na celu dostarczenie informacji na temat biologii lipidów poprzez precyzyjną analizę sfingomieliny w próbkach biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia lipidów
- Spektrometria mas
- Analiza próbek biologicznych
Tło
- Sfingomieliny są ważnymi lipidami w membranach komórkowych.
- Zrozumienie ich struktury i ilości jest kluczowe dla badań nad lipidami.
- Ta metoda poprawia charakterystykę gatunków sfingomieliny.
- Rozwiązuje kluczowe pytania w biologii lipidów.
Cel badania
- Analiza ilości i struktury gatunków sfingomieliny.
- Poprawa rozumienia biologii lipidów.
- Dostarczenie niezawodnej metody charakteryzacji lipidów w próbkach biologicznych.
Zastosowane metody
- Hodowla komórek i ich zebranie z komórek HeLa.
- Użycie lodowego PBS do płukania i zbierania komórek.
- Centryfugacja do izolowaniu pelletów komórkowych.
- Ekstrakcja sfingomieliny za pomocą metanolu.
Główne wyniki
- Udana charakterystyka różnych gatunków sfingomieliny.
- Zadokumentowano skuteczność systemu chromatograficzno-spektrometrii masowej.
- Został przedstawiony szczegółowy protokół analizy lipidów.
- Przyczyniono się do lepszego zrozumienia biologii lipidów.
Wnioski
- Ta metoda pozwala na precyzyjną analizę gatunków sfingomieliny.
- Może być stosowana do różnych próbek biologicznych.
- Poprawia rozumienie ról lipidów w systemach biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables precise structural and quantitative analysis of sphingomyelin species in biological samples, supporting lipid biomarker discovery and mechanistic de-risking in early drug development. By characterizing sphingomyelin composition, it enhances target validation in pathways involving membrane lipid dynamics and signaling. The approach provides predictive confidence for lipid-modulating therapeutics and supports portfolio triage through quantitative lipid profiling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of sphingolipid metabolism pathways to clarify therapeutic hypotheses in lipid-related diseases.
- Operational Value: Provides qualitative structural data via MS3 to identify sphingoid long-chain base and N-acyl moiety composition for target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative sphingomyelin measurements using stable isotope-labeled internal standards for assay standardization.
- Operational Value: Supports reproducible lipid extraction and LC-MS/MS workflows suitable for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant sphingolipid profiling in preclinical models to align with translational biomarker strategies.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation through consistent lipid quantification across sample types.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing structural lipid data that informs target selection and pathway analysis prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying sphingomyelin species involved in cellular signaling and membrane dynamics.
- Screening: Enables assay readiness through standardized lipid extraction and MRM-based detection for compound effect evaluation.
- Analytics: Generates quantitative peak area data and qualitative MS3 spectra to compare lipid modulation across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling sphingomyelin profiling in disease models for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable lipid analysis platform applicable across therapeutic areas involving membrane biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in lipid target validation through precise structural and quantitative sphingomyelin data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via isotope-labeled internal standards and standardized extraction protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in lipid pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lipid-targeting compounds based on quantitative sphingomyelin response data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid extraction, LC-MS/MS operation, and MS3 data interpretation for structural elucidation.
- Dependent on access to triple quadrupole or linear ion trap mass spectrometry systems capable of MS3 acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of lipid extraction and derivatization protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse biological matrices beyond cultured cells.
- Limited by the availability of sphingomyelin isotope standards for accurate quantification across diverse lipid species.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:33
Preparation of Lipid Samples
3:06
Sample Preparation for Calibration Curve and Method Validation
3:50
SM Analysis by LC-ESI-MS/MS
5:33
Batch File Creation and Assigning the MS Three Product Ion Spectra of Sphingomyelin
6:23
Quantitative Analysis of SM by LC-ESI-MS/MS
7:02
Results: Validating the Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin
8:01
Conclusion
