Ilościowa i jakościowa metoda oznaczania sfingomieliny metodą LC-MS przy użyciu dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków sfingomieliny

Ogólnym celem tej procedury jest dokładna analiza ilości i struktury każdego gatunku Sfingomieliny w próbkach biologicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie lipidów dotyczące biologii lipidów i lipidów. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy scharakteryzować różne gatunki Sfingomieliny w próbkach biologicznych za pomocą chromatografii systemu spektrometrii mas. Na początek wyjmij pożywkę hodowlaną z 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego komórki HeLa i przepłucz komórki dwukrotnie sześcioma mililitrami lodowatego PBS.

Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego PBS do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej i użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki. Po wyjęciu z powierzchni naczynia przenieś komórki do dwóch mililitrowych silikonowanych plastikowych rurek. Po odwirowaniu usunąć supernatant i dodać jeden mililitr metanolu do każdej osadki komórek.

Następnie krótko zwiruj rurki. Następnie umieść próbki w sonikatorze typu kąpielowym i poddaj sonifikacji z mocą 200 watów przez pięć minut. Po zakończeniu przenieś homogenat całej komórki do probówek wyposażonych w nakrętki wyłożone teflonem.

Teraz dodaj jeden mililitr metanolu, jeden mililitr chloroformu, 0,8 mililitra podwójnie destylowanej wody w 50 mikrolitrach 10 mikromolowych wzorca wewnętrznego do każdej probówki. Zakryj rurki i energicznie wiruj je z prędkością 2 500 obr./min przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj dodatkowy mililitr chloroformu i jeden mililitr podwójnie destylowanej wody do każdej probówki.

Ponownie energicznie wiruj rurki z prędkością 2 500 obr./min przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować próbki, aby całkowicie oddzielić fazę wodną i organiczną. Przenieś dolną fazę do jednorazowych szklanych probówek.

Dodaj dwa mililitry chloroformu do probówek. Następnie energicznie wirować rurki z prędkością 2 500 obr./min przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby wystarczająco wymieszać się z górną fazą i puchem międzyfazowym. Po drugim odwirowaniu przenieś zmodyfikowaną dolną fazę do jednorazowych szklanych probówek wraz z początkową dolną fazą.

Teraz umieść szklane probówki pod strumieniem azotu na około 60 minut i całkowicie usuń rozpuszczalniki organiczne z zebranej dolnej fazy. Na koniec należy rozpuścić próbki w 500 mikrolitrach metanolu lub etanolu. Przefiltrować powstałą mieszaninę za pomocą filtra 0,02 mikrona do szklanych fiolek.

Następnie przechowuj próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wykonaj seryjne rozcieńczenia wzorcowego związku i dodaj 50 mikrolitrów każdego stężenia do oddzielnych probówek. Następnie przygotuj trzy próbki kontroli jakości, dodając do pierwszej próbki ilość w granicach trzykrotności dolnej granicy krzywej wzorcowej, ilość w pobliżu środka krzywej dla drugiej próbki i ilość w pobliżu górnej granicy krzywej wzorcowej dla trzeciej próbki.

Następnie dodaj homogenat komórek w jednym mililitrze metanolu do każdej probówki i wyekstrahuj całkowitą frakcję lipidową z każdej próbki przy użyciu właśnie pokazanej metody. Aby rozpocząć, przygotuj fazę mobilną. Wymieszaj ze sobą acetonitryl, metanol i podwójnie destylowaną wodę w stosunku dwa do dwóch do jednego dla fazy wodnej.

Używaj izopropanolu do fazy organicznej w szklanych butelkach z nakrętkami wyłożonymi teflonem. Następnie poddaj sonikacji obie fazy ruchome przez pięć minut w sonikatorze typu kąpielowym. Następnie dodaj kwas mrówkowy do końcowego stężenia 26,4 milimola i wodorotlenek amonu o stężeniu 14,9 milimola do każdej fazy ruchomej.

W celu przeprowadzenia analizy jakościowej należy aktywować system wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Umieścić probówki wlotowe w szklanych butelkach, które zawierają fazy ruchome i oczyścić przewody HPLC. Następnie połącz kolumnę C18 HPLC z systemem HPLC.

Utrzymuj temperaturę w piecu kolumnowym na poziomie 50 stopni Celsjusza i kondycjonuj kolumnę wodną fazą ruchomą o stężeniu 100 mikrolitrów na minutę. Podczas cyklu należy umieścić próbki w stojaku na próbki próbnika automatycznego. Ustawić parametry systemu potrójnej, poczwórnej i poczwórnej liniowej spektrometrii mas z pułapką jonową dla trzyetapowej analizy spektrometrii mas, zgodnie z tabelą pierwszą i tabelą drugą dołączonego protokołu tekstowego.

Należy również ustawić parametry dla pierwszego i drugiego jonu prekursorowego interesujących gatunków SM, zgodnie z bardziej szczegółowym opisem w dołączonym protokole tekstowym. Utwórz plik wsadowy i prześlij plik wsadowy, aby uzyskać dane dotyczące trzech widm jonów produktu MS każdego rodzaju Sfingomieliny za pomocą chromatografii cieczowej, elektronrozpylania, jonizacji, tandemowej analizy spektrometrycznej mas. Otrzymać trójfazowe widma jonów produktu MS interesujących gatunków Sfingomieliny za pomocą chromatografii cieczowej, analizy tandemowej spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylaną.

Następnie przypisz każdemu MS trzy widma jonów produktowych Sfingomieliny, porównując stosunek masy do ładunku widm jonów produktu w dokładnej masie zasady długołańcuchowej Sfingoidu i interesującego nas ugrupowania n-acylowego. Ilościowo przeanalizować sfingomielinę za pomocą chromatografii cieczowej, jonizacji elektronizacyjnej, analizy tandemowej spektrometrii mas, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie przetwórz dane z monitorowania wielu reakcji za pomocą oprogramowania do integracji danych w celu uzyskania danych dotyczących obszaru piku dla wyekstrahowanego chromatogramu jonowego każdego gatunku Sfingomieliny.

Określ ilościowo każdy gatunek Sfingomieliny i skonstruuj krzywe standardowe zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Przedstawiono tutaj spektrum zarówno chemicznie syntetyzowanej Sfingomieliny, jak i Sfingomieliny w próbkach lipidów wyekstrahowanych z komórek HeLa. Warto zauważyć, że intensywność widma demetylowanej sfingozylofosforylcholiny jest większa niż ugrupowania n-acylowego SM w obu próbkach.

Interesujące jest również widmo odpowiadające sfingozyno-1-fosforanowi przydatne do spekulacji na temat liczby wiązań węglowych i podwójnych długołańcuchowej podstawy sfingomieliny. W obecnej metodzie ilościowej kluczowe znaczenie ma precyzyjne przygotowanie próbek do skonstruowania krzywej kalibracyjnej w celu walidacji tej metody. Krzywa dopasowana do niskiego stężenia została wyraźnie poprawiona dzięki zastosowaniu współczynnika ważenia równego jeden na x kwadrat w porównaniu z zastosowaniem współczynnika ważenia jeden lub jeden na x.

Technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii i przemysłu do scharakteryzowania różnych gatunków Sfingomieliny w próbkach biologicznych i produktach przemysłowych, takich jak kosmetyki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak precyzyjnie analizować ilość i strukturę każdego gatunku Sfingomieliny w próbkach biologicznych. Nie zapominaj, że praca z absorbentami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiednich okularów.

Ponadto ważne jest, aby nosić rękawice, aby zapobiec zanieczyszczeniu lipidów pochodzących z rąk.