Name: Ilościowa i jakościowa metoda oznaczania sfingomieliny metodą LC-MS przy użyciu dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków sfingomieliny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę ilościowego i jakościowego oznaczania sfingomieliny w próbkach biologicznych przy użyciu chromatografii cieczowej i spektrometrii mas LC-MS. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę lipidów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant badawczy z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii (KAKENHI) dla K.H. (#15K01691), Y.F. (#15K08625), K.Y. (#26461532), oraz grant na badania nad Projektem Chorób Nieuleczalnych z Ministerstwa Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej (K.Y. #201510032A). Dziękujemy Grupie Edanz (www.edanzediting.com/ac) za redakcję szkicu tego manuskryptu.

Przed użyciem zapoznaj się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS). Nosić rękawice, aby zminimalizować zanieczyszczenie próbki SM pochodzącym ze skóry. Niniejszy protokół został zastosowany do komórek HeLa wyhodowanych w minimalnej niezbędnej pożywce Eagle'a, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 1000 U/L penicyliny i 100 mg / L streptomycyny.
1. Przygotowanie próbek lipidów
UWAGA: Ważne jest, aby wszystkie naczynia szklane, w tym probówki z nakrętkami wyłożonymi teflonem, były wolne od detergentów.
<ol>
	<li>Ekstrakcja całkowitej frakcji lipidowej z homogenatu komórkowego metodą Bligha i Dyera7
	<ol>
		<li>Wyjmij pożywkę hodowlaną (lub kondycjonowaną) z 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowych i spłucz dwukrotnie 6 ml lodowatego PBS.</li>
		<li>Dodaj 1 ml lodowatego PBS do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej za pomocą pipety P1000. Zbierz komórki za pomocą skrobaków do komórek i zbierz do silikonowanych plastikowych probówek o pojemności 2,0 ml.</li>
		<li>Po odwirowaniu (1 000 × g, 5 min, 4 °C) usunąć supernatant za pomocą pipety P1000.</li>
		<li>Dodaj 1 ml metanolu. Rurki wirowe na krótko i sonikować z mocą 200 W przez 5 minut w sonikatorze typu kąpielowego. 
		UWAGA: Dostosuj poziom wody w sonikatorze typu kąpielowego, aby osad komórkowy był skutecznie homogenizowany.</li>
		<li>Przenieść homogenat komórkowy w metanolu za pomocą pipety do probówek (13 mm x 100 mm) z nakrętkami wyłożonymi teflonem.</li>
		<li>Do każdej probówki dodać 1 ml metanolu, 1 ml chloroformu, 0,8 ml podwójnie destylowanej wody i 50 μl 10 μmol/L wzorca wewnętrznego d18:1/(D31)-16:0 SM.</li>
		<li>Energicznie obracać probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: W tym momencie powstaje pojedyncza faza (chloroform/metanol/woda = 1/2/0,8 (v/v/v)).</li>
		<li>Dodać 1 ml chloroformu i 1,0 ml podwójnie destylowanej wody.</li>
		<li>Rurki wirowe energicznie z prędkością 2 500 obr./min przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: W tym momencie faza wodna (górna) i faza organiczna (dolna) są oddzielane.</li>
		<li>Po odwirowaniu (2 150 × g, 5 min, 25 °C) zebrać dolną fazę i przenieść ją do jednorazowych szklanych probówek (początkowa dolna faza). 
		UWAGA: Zebrać dolną fazę za pomocą pipety Pasteura i bezpiecznego filtra do pipet. Włóż końcówkę pipety do dolnej fazy, ściśnij małą bańkę obok zaworu "E", aby dostarczyć górną fazę i kłaczek międzyfazowy do wnętrza końcówki pipety, a następnie zasysaj dolną fazę do pipety.</li>
		<li>Dodać 2 ml chloroformu do probówek i energicznie wirować probówki z prędkością 2500 obr./min przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby wystarczająco wymieszać się z górną fazą i puchem międzyfazowym.</li>
		<li>Po odwirowaniu (2 150 × g, 5 min, 25 °C) zebrać zmodyfikowaną dolną fazę i przenieść ją do jednorazowych szklanych probówek z początkową dolną fazą, jak opisano w kroku 1.1.10.</li>
		<li>Umieść szklane probówki pod strumieniem azotu i całkowicie usuń rozpuszczalniki organiczne z zebranej dolnej fazy.</li>
		<li>Próbki należy rozpuścić w 500 μl metanolu lub etanolu, przefiltrować filtrem 0,02 μm i przechowywać w szklanych fiolkach w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki do skonstruowania krzywej kalibracyjnej i walidacji metody
	<ol>
		<li>Dodaj 50 μl 0,1, 0,5, 1, 5, 10 lub 50 μmol/L wzorcowego związku (d18:1/(D9)-18:1 SM) do probówek z nakrętkami wyłożonymi teflonem.</li>
		<li>Dodaj homogenat komórek do każdej probówki i dodaj metanol do 1 ml. 
		UWAGA: Ilość homogenatu komórkowego jako matrycy różni się w zależności od każdego eksperymentu. Jeśli gatunki SM w próbkach pochodzących z komórek w 10-centymetrowej naczyniu hodowlanym są rutynowo analizowane, ilość homogenatu komórkowego w każdej probówce powinna być zbliżona do ilości komórek w 10-centymetrowej naczyniu hodowlanym.</li>
		<li>Ekstrahować całkowitą frakcję lipidową zgodnie z opisem w krokach 1.1.6-1.1.14.</li>
		<li>Przygotować próbki do kontroli jakości (QC) w celu walidacji metody zgodnie z opisem w krokach 1.2.1-1.2.3. Przygotować trzy próbki QC o różnych stężeniach wzorcowego związku (d18:1/(D9)-18:1 SM): jedna w odległości 3x od dolnej granicy krzywej wzorcowej (QC-low, QC-L), jedna w pobliżu środka (QC-middle, QC-M) i jedna w pobliżu górnej granicy krzywej wzorcowej (QC-high, QC-H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza SM przez LC-ESI-MS/MS
<ol>
	<li>Przygotowanie fazy mobilnej
	<ol>
		<li>Zmieszać rozpuszczalniki (acetonitryl/metanol/ddH2O = 2/2/1 (v/v/v) dla fazy wodnej i izopropanol dla fazy organicznej) w szklanych butelkach z nakrętkami wyłożonymi teflonem i sonikować przez 5 minut w sonikatorze typu kąpielowego.</li>
		<li>Dodać kwas mrówkowy (stężenie końcowe 26,4 mmol/l) i NH4OH (14,9 mmol/l) do każdej fazy ruchomej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza jakościowa SM metodą LC-ESI-MS3
	<ol>
		<li>Aktywować system wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), umieścić probówki wlotowe w szklanych butelkach zawierających fazy ruchome i oczyścić przewody HPLC. Połączyć kolumnę C18 HPLC (średnica wewnętrzna 1,5 mm × długości 100 mm, wielkość cząstek 3,0 μm) z systemem HPLC, utrzymywać temperaturę w piecu kolumnowym na poziomie 50 °C i kondycjonować kolumnę w wodnej fazie ruchomej na poziomie 100 μl/min. Umieść próbki w stojaku na próbki w automatycznym podajniku próbek.</li>
		<li>Ustawić parametry systemu spektrometrii mas z potrójnym kwadrupolem i kwadrupolową liniową pułapką jonową do analizy MS3, jak wymieniono w Tabeli 1 i Tabeli 2, a także pierwszy i drugi jon prekursorowy interesujących nas gatunków SM.
		<ol>
			<li>Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania do akwizycji danych, kliknij dwukrotnie "Konfiguracja sprzętowa", wybierz "LC+QTRAP4500+Valve" i kliknij "Aktywuj profil".</li>
			<li>Utwórz nowy podfolder, klikając "Nowy podprojekt" i "OK".</li>
			<li>Kliknij zakładkę "plik", wybierz "Nowy", a następnie wybierz "Metoda pozyskiwania" i "OK". Kliknij ikonę "Mass Spec" i zakładkę "MS". Wybierz typ skanowania jako "MS/MS/MS (MS3)", szybkość skanowania jako 10 000 Da/s, polaryzację jako "Ujemna" i "Czas trwania" jako całkowity czas do analizy (min). Ustaw m/z opcji "Start (Da)" i "Stop (Da)" jako zakres, który ma być skanowany. Ustawić m/z 1. i 2. jonów prekursorowych docelowych gatunków SM będących przedmiotem zainteresowania. 
			UWAGA: Aby przeanalizować wiele gatunków SM, zaznacz ikonę "-MS3", kliknij prawym przyciskiem myszy, wybierz "Kopiuj ten eksperyment", a następnie umieść m/z 1. i 2. jonów prekursorowych innych gatunków SM.</li>
			<li>Wybierz zakładkę "Zaawansowany MS" i ustaw każdy parametr w następujący sposób: Tryb skanowania jako "Profil", Rozmiar kroku jako 0,12 (Da), Rozdzielczość Q1 i Q3 odpowiednio "Jednostka" i "LIT", Próg intensywności jako 0, Czas ustawienia jako 50 (ms), Przerwa między zakresami masy jako 1,5 ms, wybierz "Czas dynamicznego napełniania", Q3 Bariera wejścia jako 8 V i czas wzbudzenia jako 25 ms.</li>
			<li>Kliknij przycisk "Edytuj parametry" w zakładce "MS" i wybierz zakładkę "Źródło/Gaz". Ustaw parametry gazu kurtynowego, gazu zderzeniowego, napięcia rozpylania jonowego, temperatury, źródła jonów gazu1 i gazu2 zgodnie z tabelą 1. Następnie wybierz zakładkę "Związek". Ustawić parametry potencjału deklastracji, potencjału wejściowego, energii zderzenia, energii wzbudzenia i rozrzutu energii zderzenia, jak podano w tabeli 2.</li>
			<li>Podświetl "Zintegrowany zawór Valco" i wybierz "Nazwa pozycji dla kroku 0" jako A, a następnie ustaw "B" jako pozycję na łączny czas 5,0 min. Ustaw również "A" jako pozycję na łączny czas 70.0 min.</li>
			<li>Podświetl "System Shimadzu LC". Wybierz zakładkę "Pompa" i ustaw tryb pompowania jako przepływ binarny, przepływ całkowity jako 0,28 ml/min, a maksymalne limity ciśnienia na 20,0 MPa. Wybierz zakładkę "Automatyczny podajnik próbek" i ustaw objętość płukania na 200 μl, skok igły na 52 mm, prędkość płukania na 35 μl/s, prędkość próbkowania na 5,0 μl/s, czas czyszczenia na 25,0 min, czas zanurzania płukania na 5 s, a tryb płukania na "Przed i po aspiracji".
			<ol>
				<li>Dodatkowo włącz chłodziarkę, ustaw temperaturę chłodnicy na 4 °C, a skok igły fiolki kontrolnej na 52 mm. Wybierz zakładkę "Piekarnik", włącz piekarnik i ustaw temperaturę piekarnika i temperaturę maksymalną odpowiednio na 50 °C i 85 °C.</li>
				<li>Wybierz zakładkę "Kontroler" i zaznacz pole "Włącz". Wybierz zakładkę "Program czasowy" i ustaw gradienty rozpuszczalników w następujący sposób: Rozpuszczalniki A/B w stosunku 100/0 przez 5 minut, zaprogramuj zmiany liniowe na 80/20 w ciągu 4 minut, na 35/65 w ciągu 50 minut i na 25/75 w ciągu 1 minuty. Następnie utrzymuj je na poziomie 25/75 przez 10 minut, a następnie liniowo do 100/0 przez 4 minuty. Następnie zapisz metodę.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Utwórz plik wsadowy
		<ol>
			<li>Kliknij dwukrotnie ikonę "Build Acquisition Batch", kliknij "Dodaj zestaw", "Dodaj próbki", ustaw liczbę nowych próbek i kliknij "OK".</li>
			<li>Kliknij przycisk "Edytor metod" i wybierz metodę, która ma być użyta. Jeżeli w jednym pliku wsadowym stosuje się wiele metod, należy zaznaczyć pole "Użyj wielu metod" i wybrać metodę pobierania dla każdej próbki. Zmień nazwę "Nazwa próbki", ustaw odpowiedni numer dla "Pozycji fiolki" i wprowadź ilość objętości wstrzyknięcia. Następnie zapisz plik wsadowy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Otrzymać widma jonów produktu MS3 gatunków SM będących przedmiotem zainteresowania za pomocą analizy LC-ESI-MS3
		<ol>
			<li>Wybierz zakładkę "Prześlij" w pliku wsadowym, zaznacz linię próbek do analizy i kliknij przycisk "Prześlij".</li>
			<li>Kliknij ikonę "View Quene", ikonę "Equilibrate", wybierz metodę akwizycji, która ma być użyta, ustaw czas na 1 minutę i kliknij "OK".</li>
			<li>Dezaktywuj "Rezerwuj instrument do strojenia", klikając odpowiednią ikonę. Następnie wykonaj sekwencję wsadową, klikając ikonę "Rozpocznij próbkę".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przypisz każdemu widmu jonów produktu MS3 SM, porównując stosunek masy do ładunku (m/z) widm jonów produktu i dokładną masę interesującego sfingoidu LCB i N-acylu. Określić liczbę atomów węgla i wiązań podwójnych w sfingoidzie LCB i ugrupowaniu N-acylowym zgodnie z odpowiednimi jonami produktowymi.
		<ol>
			<li>Upewnij się, że wybrano odpowiedni folder podprojektu, a następnie kliknij dwukrotnie ikonę "Otwórz plik danych" i wybierz próbki do analizy. Przeciągnij pik na chromatogramie dla każdego docelowego gatunku SM, a następnie kliknij dwukrotnie. Przedstawione zostaną uzyskane widma jonów produktu MS3 w obrębie obszaru przeciąganego.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza ilościowa SM metodą LC-ESI-MS/MS
	<ol>
		<li>Ustaw fazy ruchome i kolumnę HPLC zgodnie z opisem w krokach 2.1 i 2.2.1.</li>
		<li>Ustawić parametry systemu spektrometrii mas z potrójnym kwadrupolem i kwadrupolową liniową pułapką jonową do analizy monitorowania wielu reakcji (MRM) zgodnie z tabelami 1 i 2.
		<ol>
			<li>Przeprowadzić procedury opisane w krokach 2.2.2.1 i 2.2.2.2.</li>
			<li>Kliknij zakładkę "plik", wybierz "Nowy", a następnie wybierz "Metoda pozyskiwania" i "OK". Kliknij ikonę "Mass Spec" i zakładkę "MS". Wybierz typ skanowania jako "MRM", polaryzację jako "Pozytywna". Ustaw "Czas trwania" jako cały czas do analizy. Ustawić m/z z [M+H]+ i 184 odpowiednio jako "Q1 Mass (Da)" i 'Q3 Mass (Da)' docelowych gatunków SM będących przedmiotem zainteresowania. Ustaw "Czas" jako 10 ms, a "ID" jako nazwę docelowego gatunku SM.</li>
			<li>Wybierz zakładkę "Zaawansowane MS" i ustaw każdy parametr w następujący sposób: zarówno rozdzielczość Q1, jak i Q3 jako "Jednostka", Próg intensywności jako 0, Ustawienie czasu jako 0 (ms) i Przerwa między zakresami masy jako 5 ms.</li>
			<li>Kliknij przycisk "Edytuj parametry" w zakładce "MS" i wybierz zakładkę "Źródło/Gaz". Umieść parametr gazu kurtynowego, gazu zderzeniowego, napięcia rozpylania jonów, temperatury, źródła jonów gazu1 i gazu2 zgodnie z tabelą 1. Następnie wybierz zakładkę "Związek". Umieść parametry potencjału deklastracji, potencjału wejściowego, energii zderzenia i potencjału wyjścia z ogniwa zderzeniowego zgodnie z tabelą 2.</li>
			<li>Ustawić zawór zgodnie z opisem w kroku 2.2.2.6.</li>
			<li>Ustaw warunek LC zgodnie z opisem w kroku 2.2.2.7. Następnie zapisz metodę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Utwórz plik wsadowy zgodnie z opisem w kroku 2.2.3.</li>
		<li>Uzyskać dane MRM dla każdego gatunku SM za pomocą analizy LC-ESI-MS/MS zgodnie z opisem w kroku 2.2.4.</li>
		<li>Przetwarzaj dane MRM za pomocą oprogramowania do integracji danych i uzyskuj dane dotyczące powierzchni piku dla ekstrahowanego chromatogramu jonowego każdego gatunku SM.
		<ol>
			<li>Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania do integracji danych w analizie ilościowej, kliknij zakładkę "Edytuj" i wybierz Ustawienia domyślne integracji użytkownika. Ustaw szerokość gładkości gaussowskiej na 1,0 punktu i kliknij "OK". Kliknij zakładkę "Edytuj" i wybierz "Nowa tabela wyników". Wybierz próbkę, która ma zostać zintegrowana, kliknij przycisk strzałki i kliknij "Dalej". Wybierz "Utwórz nową metodę", ustaw nazwę metody i kliknij "Dalej". Kliknij "Dalej" i zaznacz pole d18:1/(D31)-16:0 SM tak, jak jest, kliknij "Dalej" i kliknij "Zakończ".</li>
			<li>Kliknij "Wyświetla przegląd pików" i potwierdź, że piki chromatogramu są prawidłowo rozpoznane. Należy zauważyć, że czas retencji d18:1/(D31)-16:0 SM jest zwykle krótszy o ~ 0,3 min w porównaniu z czasem 34-1 SM (zwykle składa się z d18:1/16:0 SM).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Określić ilościowo każdy gatunek SM zgodnie ze stosunkiem piku każdego gatunku SM do wzorca wewnętrznego SM d18:1/(D31)-16:0 SM.
		<ol>
			<li>Kliknij kartę "Plik", wybierz "Eksportuj", wybierz "Tabela wyników", potwierdź format jako "MultiQuant", kolumny jako "Eksportuj wszystkie kolumny", wiersze jako "Eksportuj wszystkie wiersze z wyjątkiem tych jawnie ukrytych", a następnie kliknij "OK".</li>
			<li>Otwórz wyeksportowany plik w programie Excel. Znormalizować obszar docelowych gatunków SM przez obszar IS (d18:1/(D31)-16:0 SM). Następnie pomnóż przez teoretyczną ilość IS w wstrzykniętej próbce, aby obliczyć ilość docelowych gatunków SM w wstrzykniętej próbce.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konstruowanie krzywej standardowej
	<ol>
		<li>Uzyskać dane MRM d18:1/(D9)-18:1 SM i d18:1/(D31)-16:0 SM w próbkach do skonstruowania krzywej wzorcowej za pomocą analizy LC-ESI-MS/MS, jak opisano w kroku 2.3.1-2.3.4.</li>
		<li>Uzyskaj dane dotyczące powierzchni piku d18:1/(D9)-18:1 SM i d18:1/(D31)-16:0 SM zgodnie z opisem w kroku 2.3.5.</li>
		<li>Obliczyć ilość d18:1/(D9)-18:1 SM w wstrzykiwanej próbce zgodnie z opisem w kroku 2.3.6.</li>
		<li>Skonstruuj linię trendu, ustawiając oś X i oś Y jako wartość nominalną i obliczoną wartość d18:1/(D9)-18:1 SM i uzyskaj wzór na linię trendu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Walidacja metody ilościowej za pomocą oprogramowania Excel
	<ol>
		<li>W celu walidacji metody należy określić ilościowo ilość d18:1/(D9)-18:1 SM i d18:1/(D31)-16:0 SM w próbkach kontroli jakości, analizując każdą próbkę kontroli jakości co najmniej trzy razy w ciągu 1 dnia i powtarzać co najmniej 3 dni, jak opisano w kroku 2.3.1–2.3.4.</li>
		<li>Uzyskać dane dotyczące powierzchni piku i obliczyć ilość d18:1/(D9)-18:1 SM w wstrzykniętej próbce, jak opisano w krokach 2.3.5 i 2.3.6.</li>
		<li>Zgodnie z uzyskaną krzywą kalibracyjną obliczyć ilość d18:1/(D9)-18:1 SM w wstrzykniętej próbce.</li>
		<li>Ocena precyzji
		<ol>
			<li>Oblicz średnią i odchylenie standardowe wielkości d18:1/(D9)-18:1 SM uzyskanej w kroku 2.5.3 na zestawie danych śróddziennych i międzydziennych za pomocą oprogramowania Excel.</li>
			<li>Średnią otrzymaną w kroku 2.5.4.1 dzieli się przez odchylenie standardowe i wyraża jako %.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ocena dokładności
		<ol>
			<li>Oblicz dokładność każdych danych w następujący sposób: 
			[(Kwota obliczona uzyskana w kroku 2.5.3.) / (Kwota nominalna) - 1] × 100(%)</li>
			<li>Oblicza średnią wartości bezwzględnej dokładności w zbiorze danych dla dnia bieżącego i międzydziennego.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+family+of+animal+sphingomyelin+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a family of animal sphingomyelin synthases.</a> EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).</li>
<li>Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophospholipid+receptors+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Lysophospholipid receptors in drug discovery.</a> Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).</li>
<li>Kihara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+degradation+pathways%2C+functions%2C+and+pathology+of+ceramides+and+epidermal+acylceramides%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides.</a> Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).</li>
<li>Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipidomics%3A+high-throughput%2C+structure-specific%2C+and+quantitative+analysis+of+sphingolipids+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Methods. 36 (2), 207-224 (2005).</li>
<li>Houjou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+selective+identification+of+molecular+species+in+phosphatidylcholine+and+sphingomyelin+by+conditional+neutral+loss+scanning+and+MS3%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).</li>
<li>Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Quantitation+Using+Two+Stable+Isotopically+Labeled+Species+and+Direct+Detection+of+N-Acyl+Moiety+of+Sphingomyelin%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin.</a> Lipids. , (2017).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/10.1139/o59-099#.WlOY-N-nHIU">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+the+correct+weighting+factors+for+linear+and+quadratic+calibration+curves+with+least-squares+regression+algorithm+in+bioanalytical+LC-MS%2FMS+assays+and+impacts+of+using+incorrect+weighting+factors+on+curve+stability%2C+data+quality%2C+and+assay+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance.</a> Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Thomas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozone-induced+dissociation%3A+elucidation+of+double+bond+position+within+mass-selected+lipid+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions.</a> Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).</li>
<li>Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+sphingomyelin+characterization+using+electron+impact+excitation+of+ions+from+organics+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry.</a> J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).</li>
<li>Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+Structural+Characterization+of+Sphingolipids+via+193+nm+Ultraviolet+Photodissociation+and+Ultra+High+Resolution+Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry.</a> J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).</li>
<li>Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+complex+lipid+isomers+by+radical-directed+dissociation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry.</a> Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

W niniejszej metodzie jakościowej otrzymano jony pochodne MS3 SPC i ugrupowania N-acylowego. Bardzo ważne jest prawidłowe przypisanie zarówno SPC, jak i ugrupowania N-acylowego. W tym celu należy zauważyć, że inne cząsteczki zawierające fosforylcholinę mogą być również wykrywane jako jony porodowe MS3. Diacylofosfatydylocholina (PC) i plazmalogen-PC są obficie obecne w komórkach ssaków, a ich hydrofobowość jest podobna do SM. Dlatego diacyl-PC i plazmalogen-PC z izotopem (zwykle <s...

Sfingomielina (SM) jest powszechnym sfingolipidem w komórkach ssaków. SM jest syntetyzowany wewnątrzkomórkowo1 i występuje jako prekursor innych sfingolipidów, takich jak sfingozyno-1-fosforan i ceramid, które odgrywają kluczową rolę odpowiednio w transporcie komórek odpornościowych i homeostazie bariery skórnej2,3. Dlatego dokładna analiza metabolizmu SM jest ważna dla wyjaśnienia fizjologicznej i patologicznej roli sfingolipidów.
SM składa się z ceramidu i fosforylcholiny, która jest połączona z grupą 1-hydroksy ceramidu, która z kolei składa się z sfingozyny i ugrupowania N-acylowego. Różnorodność liczby wiązań węglowych i podwójnych zarówno w ugrupowaniu sfingozyny, jak i N-acylu skutkuje liczbą gatunków ceramidów (i SM). Ostatnie postępy w LC-ESI-MS/MS umożliwiły analizę ilościową i jakościową SM4,5. W analizie jakościowej liczbę wiązań węglowych i podwójnych sfingoidalnego LCB SM zidentyfikowano poprzez przypisanie widm jonów produktowych LCB. Jednak informacje strukturalne ugrupowania N-acylowego nie zostały uzyskane bezpośrednio, ponieważ odpowiadające mu jony produktowe nie zostały zgłoszone, a zatem ugrupowania N-acylowe wydedukowano przez analizę różnicową między jonami prekursorowymi a jonami porodowymi odpowiadającymi LCB zarówno w trybie jonów dodatnich, jak i ujemnych4,5. W niniejszym raporcie przedstawiono metodę jednoczesnego wykrywania jonów produktowych zarówno LCB, jak i ugrupowania N-acylowego w trybie MS3 przy użyciu spektrometrii mas z potrójnym kwadrupolem i kwadrupolem liniowym pułapką jonową, co ułatwia precyzyjne spekulacje strukturalne każdego gatunku SM6.
Efekty tłumienia (lub wzmacniania) jonów powodowane przez matrycę w próbkach biologicznych utrudniają dokładną kwantyfikację w analizie LC-ESI-MS, dlatego pożądane jest skonstruowanie krzywych kalibracyjnych dla wszystkich analitów będących przedmiotem zainteresowania w identycznej matrycy próbki biologicznej. Jednak ta strategia nie jest wykonalna, ponieważ prawie niemożliwe jest przygotowanie wszystkich gatunków SM w próbkach biologicznych, zwłaszcza w kompleksowej analizie. W związku z tym praktyczne jest skonstruowanie krzywej kalibracyjnej i określenie zakresu ilościowego przy użyciu reprezentatywnych gatunków SM wzbogaconych w próbkach biologicznych. Użyliśmy dwóch znakowanych izotopowo gatunków SM do skonstruowania krzywej kalibracyjnej; Jeden był używany do wzorca wewnętrznego, a drugi do wzorcowego związku. Wykryliśmy niewielką ilość izotopowo znakowanych gatunków SM jako standardowy związek wzbogacony w próbkach biologicznych i udało nam się uzyskać krzywą kalibracyjną i zakres ilościowy6.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100 mm naczynie do hodowli tkankowych</td><td>IWAKI</td><td>3020-100</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>IWAKI</td><td>9000-220</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowana probówka 2,0 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Probówka</td><td>IWAKI</td><td>TST SCR 16-100</td><td></td></tr><tr><td>Zakrętka wyłożona teflonem</td><td>IWAKI</td><td>9998CAP415-15</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa szklana rurka</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>CAPCELL PAK C18 ACR 3 &micro; m 1,5 mm ID x 100 mm</td><td>Shiseido</td><td>92223</td><td>Nabój ochronny jest wkładany do uchwytu naboju i połączony z kolumną C18</td></tr><tr><td>CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 mm x 10 mm WKŁAD OCHRONNY</td><td>Shiseido</td><td>12197</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na kartridże</td><td>Shiseido</td><td>12415</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Wako</td><td>018-19853</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Alkohol Izopropylowy)</td><td>Wako</td><td>161-09163</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako</td><td>134-14523</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Wako</td><td>066-00466</td><td></td></tr><tr><td>28% Woda amoniakcyjna</td><td>Wako</td><td>016-03146</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator (typ kąpielowy)</td><td>SHARP</td><td>UT-206H</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy do szklanej probówki</td><td>TAITEC</td><td>Mix-EVR</td><td></td></tr><tr><td>1,4 ml szklana fiolka</td><td>Tomsic</td><td>500-1982</td><td>Próbki są przechowywane w szklanej fiolce o pojemności 1,4 ml zamkniętej nakrętką i przegrodą 8 mm w temperaturze -20&g; C</td></tr><tr><td>Przegroda 8 mm</td><td>Tomsic</td><td>200-3322</td><td>Podczas analizy próbek nakrętki są zastępowane nakrętkami z rozciętą przegrodą</td></tr><tr><td>Zakrętka do szklanej fiolki 1,4 mm</td><td>Tomsic</td><td>500-2762</td><td></td></tr><tr><td>Zakrętka z przegrodą szczelinową</td><td>Shimadzu GLC</td><td>GLCTV-803</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 0,22 &micro; m filtr</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Potrójna kwadrupolowa i kwadrupolowa liniowa spektrometria mas pułapek jonowych</td><td>SCIEX</td><td>QTRAP4500</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych i analizy widm jonów produktu</td><td>SCIEX</td><td>Analyst Oprogramowanie</td><td></td></tr><tr><td>do integracji danych w analizie ilościowej</td><td>SCIEX</td><td>MultiQuant</td><td></td></tr><tr><td>HPLC system</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Szklana butelka</td><td>Sansyo</td><td>85-0002</td><td></td></tr><tr><td>d18:1/24:0 sfingomielina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860592P</td><td></td></tr><tr><td>Sfingozylofosforylcholina</td><td>Merck</td><td>567735</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>26140079</tr><tr><td>L-glutamina</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Penicylina i streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Orzeł" s minimum niezbędne medium</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa i jakościowa metoda oznaczania sfingomieliny metodą lc-ms przy użyciu dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków sfingomieliny

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Prezentujemy metodę jakościowej i ilościowej analizy sfingomieliny (SM) za pomocą chromatografii cieczowej, elektrorozpylania, jonizacji, tandemowej spektrometrii mas (LC-ESI-MS/MS). SM jest powszechnym sfingolipidem składającym się z fosforylcholiny i ceramidu jako składnika hydrofilowego i hydrofobowego, odpowiednio. Wiele gatunków SM jest obecnych w komórkach ssaków ze względu na różnorodność zasady długiego łańcucha sfingoidu (LCB) i ugrupowanie N-acylowe w ceramidzie. W niniejszym raporcie przedstawiono metodę szacowania liczby wiązań węglowych i podwójnych w LCB i ugrupowaniu N-acylowym na podstawie odpowiadających im jonów produktowych w eksperymentach MS/MS/MS (MS 3). Ponadto przedstawiono metodę analizy ilościowej SM z wykorzystaniem dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków SM, co ułatwia określenie zakresu stosowanego w oznaczaniu ilościowym SM. Niniejsza metoda będzie przydatna w charakterystyce różnych gatunków SM w próbkach biologicznych i produktach przemysłowych, takich jak kosmetyki.

Chemicznie syntetyzowany d18:1/24:0 SM (Rysunek 1A) oraz d18:1/24:0 SM w próbkach lipidów wyekstrahowanych z komórek HeLa (Rysunek 1B) zostały poddane analizie LC-ESI-MS3 z wykorzystaniem [M+HCOO]- oraz [M-CH3]- odpowiednio jako pierwszego i drugiego jonu prekursorowego. Należy zauważyć, że intensywność widma zdemetylowanej sfingozylofosforylocholiny (S...

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia i kwalifikacji każdego gatunku sfingomieliny za pomocą monitorowania wielu reakcji i trybu MS/MS/MS, odpowiednio.

Ilościowa i jakościowa metoda oznaczania sfingomieliny metodą LC-MS przy użyciu dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków sfingomieliny

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Ogólnym celem tej procedury jest dokładna analiza ilości i struktury każdego gatunku Sfingomieliny w próbkach biologicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie lipidów dotyczące biologii lipidów i lipidów. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy scharakteryzować różne gatunki Sfingomieliny w próbkach biologicznych za pomocą chromatografii systemu spektrometrii mas. Na początek wyjmij pożywkę hodowlaną z 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego komórki HeLa i przepłucz komórki dwukrotnie sześcioma mililitrami lodowatego PBS.Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego PBS do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej i użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki. Po wyjęciu z powierzchni naczynia przenieś komórki do dwóch mililitrowych silikonowanych plastikowych rurek. Po odwirowaniu usunąć supernatant i dodać jeden mililitr metanolu do każdej osadki komórek.Następnie krótko zwiruj rurki. Następnie umieść próbki w sonikatorze typu kąpielowym i poddaj sonifikacji z mocą 200 watów przez pięć minut. Po zakończeniu przenieś homogenat całej komórki do probówek wyposażonych w nakrętki wyłożone teflonem.Teraz dodaj jeden milili

quantitative-qualitative-method-for-sphingomyelin-lc-ms-using-two

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Przedstawiamy metodę wykorzystującą spektrometrię mas MALDI oraz chemię redukcyjnego metylowania do ilościowego określania zmian w metylowaniu lizyny.

Zastosowanie metody MassSQUIRM do ilościowych pomiarów aktywności demetylazy lizyny

Opisano specyficzną i czułą metodę pozwalającą na poznanie profilu ekspresji antygenów glikosfingolipidowych w organach i komórkach układu odpornościowego. Metoda ta wykorzystuje spektrometrię mas z pułapką jonową, umożliwiając etapową fragmentację cząsteczek glikosfingolipidów w celu analizy strukturalnej w porównaniu ze standardami otrzymanymi drogą syntezy chemicznej.

Analiza spektrometryczna glikosfingolipidowych antygenów

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Tutaj pokazujemy, że izolowane ludzkie płytki krwi mogą być używane jako dostępny model ex vivo do badania adaptacji metabolicznych w odpowiedzi na inhibitor kompleksu I rotenon. Podejście to wykorzystuje śledzenie izotopowe i względną kwantyfikację za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas i może być stosowane w różnych projektach badawczych.

Analiza LC-MS ludzkich płytek krwi jako platforma do badania metabolizmu mitochondrialnego

Wiele przewidywanych (fosfo)lipaz jest słabo scharakteryzowanych pod względem specyficzności substratowej i funkcji fizjologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół optymalizacji aktywności enzymów, poszukiwania naturalnych substratów i proponowania funkcji fizjologicznych tych enzymów.

Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Prezentujemy protokół wykorzystujący chromatografię cieczową w połączeniu z tandemową spektrometrią mas do identyfikacji i ilościowego oznaczania głównych lipidów komórkowych u Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda ilościowej oceny głównych klas lipidów w komórce drożdży jest wszechstronna, solidna i czuła.

Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Sfingolipidy to bioaktywne metabolity o ugruntowanej roli w chorobach człowieka. Scharakteryzowanie zmian w tkankach za pomocą spektrometrii mas może ujawnić role w etiologii choroby lub zidentyfikować cele terapeutyczne. Jednak związek KTT stosowany do kriokonserwacji w biorepozytoriach zakłóca spektrometrię mas. Przedstawiono metody analizy sfingolipidów w tkankach ludzkich osadzonych w OCT za pomocą LC-ESI-MS/MS.

Przygotowanie tkanek ludzkich osadzonych w związku o optymalnej temperaturze skrawania do analizy metodą spektrometrii mas

Przedstawiona tutaj jest metoda badania struktur lipidowych poprzez znakowanie stabilnych izotopów przy użyciu czasu ich retencji, mobilności i fragmentacji.

Śledzenie lipidów de novo przy użyciu znakowania stabilnych izotopów LC-TIMS-TOF MS/MS

Poznaj metodę ilościowego i jakościowego oznaczania sfingomieliny w próbkach biologicznych przy użyciu chromatografii cieczowej i spektrometrii mas LC-MS. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę lipidów.

Ilościowa i jakościowa metoda oznaczania sfingomieliny metodą LC-MS przy użyciu dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków sfingomieliny (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowa i jakościowa metoda oznaczania sfingomieliny metodą LC-MS przy użyciu dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków sfingomieliny

Przeglądaj więcej filmów