Mitochondrialny test wychwytu wapnia: metoda pomiaru wychwytu wapnia w izolowanych mitochondriach oparta na czytniku płytkowym

Mitochondria pobierają cytozolowy wapń, ponieważ jest on niezbędny do ich prawidłowego funkcjonowania.

Nadmierny napływ wapnia do macierzy mitochondrialnej - mitochondrialne przeciążenie wapniem - powoduje otwarcie wewnętrznego kanału błonowego, porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów lub MPTP. Otwarty por umożliwia zwiększony odpływ wapnia z mitochondriów, powodując dysfunkcję mitochondriów.

Aby zmierzyć mitochondrialny wychwyt wapnia, należy rozpocząć od płytki wielodołkowej zawierającej izolowane mitochondria zawieszone w odpowiednim buforze. Uzupełnij studnię pirogronianem i jabłczanem, które są substratami wytwarzającymi ATP. Wymieszaj zawartość studzienki i inkubuj.

Podczas inkubacji pirogronian i jabłczan są przekształcane w ATP, energetyzując mitochondria. Dodać roztwór zawierający nieprzepuszczalne dla błony mitochondrialnej, wrażliwe na wapń cząsteczki barwnika fluorescencyjnego. Dozuj bufor zawierający wapń do energetyzowanych mitochondriów.

Monitoruj fluorescencję wapnia barwnika, gdy cząsteczki barwnika wiążą się z wolnym wapniem w buforze.

Dodaj więcej jonów wapnia, aby zainicjować mitochondrialny napływ wapnia. Stopniowo zwiększający się wapń mitochondrialny zmniejsza ilość jonów wapnia w buforze, zmniejszając fluorescencję wapnia barwnika.

Gdy mitochondria osiągną maksymalną zdolność przenoszenia wapnia, dalsze dodawanie jonów wapnia otwiera kanały MPTP i importuje wapń do buforu. Wapń buforowy wiąże się z cząsteczkami barwnika, powodując zwiększoną fluorescencję wapnia barwnika.

Wykreślić fluorescencję barwnika w różnych punktach czasowych dodawania wapnia, aby monitorować kinetykę mitochondrialnego wychwytu wapnia.

Aby rozpocząć pomiar mitochondrialnego wychwytu wapnia za pomocą czytnika płytek, zaprogramuj czytnik tak, aby wykonywał kinetyczny odczyt fluorescencji zieleni wapniowej-5N co sekundę, przez łączny czas 1,000 sekund.

Zaprogramuj wtryskiwacze odczynników tak, aby dozowały 5 mikrolitrów roztworu chlorku wapnia w różnych punktach czasowych. Następnie zalać wtryskiwacze roztworem chlorku wapnia, który będzie używany.

Następnie dodaj 200 mikrogramów wyizolowanych mitochondriów do jednego dołka 96-dołkowej płytki i dodaj odpowiednią objętość buforu chlorku potasu, aby uzyskać całkowitą objętość 197 mikrolitrów. Następnie dodaj 1 mikrolitr 1 molowego pirogronianu, 1 mikrolitr 500 milimolowego jabłczanu i 1 mikrolitr 1 milimolowego bulionu calcium green-5N i delikatnie wymieszaj pipetując.

Inkubować chroniony przed światłem w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, aby mitochondria zostały pobudzone. Na koniec uruchom zaprogramowany protokół kinetyczny i monitoruj fluorescencję zieleni wapniowej-5N.