Mitochondrialny test wychwytu wapnia: metoda pomiaru wychwytu wapnia w izolowanych mitochondriach oparta na czytniku płytkowym
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:13 min. • July 8th, 2025
Mitochondria pobierają cytozolowy wapń, ponieważ jest on niezbędny do ich prawidłowego funkcjonowania.
Nadmierny napływ wapnia do macierzy mitochondrialnej - mitochondrialne przeciążenie wapniem - powoduje otwarcie wewnętrznego kanału błonowego, porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów lub MPTP. Otwarty por umożliwia zwiększony odpływ wapnia z mitochondriów, powodując dysfunkcję mitochondriów.
Aby zmierzyć mitochondrialny wychwyt wapnia, należy rozpocząć od płytki wielodołkowej zawierającej izolowane mitochondria zawieszone w odpowiednim buforze. Uzupełnij studnię pirogronianem i jabłczanem, które są substratami wytwarzającymi ATP. Wymieszaj zawartość studzienki i inkubuj.
Podczas inkubacji pirogronian i jabłczan są przekształcane w ATP, energetyzując mitochondria. Dodać roztwór zawierający nieprzepuszczalne dla błony mitochondrialnej, wrażliwe na wapń cząsteczki barwnika fluorescencyjnego. Dozuj bufor zawierający wapń do energetyzowanych mitochondriów.
Monitoruj fluorescencję wapnia barwnika, gdy cząsteczki barwnika wiążą się z wolnym wapniem w buforze.
Dodaj więcej jonów wapnia, aby zainicjować mitochondrialny napływ wapnia. Stopniowo zwiększający się wapń mitochondria
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych