Oznaczanie zdolności zatrzymywania wapnia w izolowanych mitochondriach

Umieść mitochondria wyizolowane z komórek nerwiaka zarodkowego w buforze zawierającym nieprzepuszczalny dla błony, wiążący wapń barwnik fluorescencyjny.

Inkubuj, aby mitochondria ustabilizowały się w buforze.

Dodać bufor zawierający wapń i inkubować z potrząsaniem.

Jony wapnia wiążą się z cząsteczkami barwnika, powodując ich fluorescencję.

Za pomocą spektrometru fluorescencyjnego monitoruj fluorescencję barwnika w czasie rzeczywistym.

Teraz należy wstrzykiwać bufor zawierający wapń w regularnych odstępach czasu.

Zwiększone stężenie wapnia sprzyja mitochondrialnemu wychwytowi wapnia, zmniejszając wolne jony wapnia dostępne do wiązania się z barwnikiem, co skutkuje zmniejszoną fluorescencją.

Gdy mitochondria osiągną maksymalną zdolność magazynowania wapnia, dalsze dodawanie wapnia powoduje otwarcie porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów (mPTP).

Ten otwór porów uwalnia wapń z mitochondriów do bufora, gdzie wiąże się z barwnikiem i powoduje zwiększoną fluorescencję.

Określ całkowitą ilość wapnia potrzebną do indukowania otwarcia mPTP, co odzwierciedla zdolność zatrzymywania wapnia w mitochondriach.

Przygotować pożywkę z chlorkiem potasu i dodać zielony barwnik fluorescencyjny wiążący wapń do końcowego stężenia 0,5 mikromola przed eksperymentem. Aby określić zdolność zatrzymywania wapnia w mitochondriach, najpierw przenieś 1 mililitr izolowanych mitochondriów w pożywce chlorku potasu zawierającej 0,5 mikromolowego zielonego barwnika fluorescencyjnego wiążącego wapń do każdej studzienki 6-dołkowej płytki.

Inkubuj mitochondria w wiążącym wapń zielonym barwniku fluorescencyjnym na 6-dołkowej płytce w temperaturze pokojowej. Chroń go przed światłem otoczenia przez 1 minutę. Po inkubacji dodać 4 mikrolitry podwielokrotności 20-milimolowego roztworu chlorku wapnia do każdej studzienki 6-dołkowej płytki, używając automatycznego ustawienia dozowania, aby wprowadzić 200 nanomoli wapnia na miligram białka mitochondrialnego.

Użyj spektrometru fluorescencyjnego, aby monitorować zmiany fluorescencji co trzy sekundy przez 2 minuty, z długością fali wzbudzenia 506 nanometrów i długością fali emisji 531 nanometrów. Płyta wyposażona jest w wytrząsanie z prędkością 600 obr./min przez 3 sekundy między odczytami, kontrolowane przez oprogramowanie. Dodaj dodatkową 4-mikrolitrową podwielokrotność 20-milimolowego roztworu chlorku wapnia do każdej studzienki, a następnie monitoruj zmiany fluorescencji co 3 sekundy przez 2 minuty.