Test kolorymetryczny do oznaczania ilościowego węglowodanów niestrukturalnych w tkankach roślinnych

Węglowodany strawne są niestrukturalnymi składnikami tkanki roślinnej i działają jako rezerwowe źródło energii dla wzrostu i metabolizmu roślin.

Aby określić ilościowo węglowodany niestrukturalne, weź zmierzoną ilość tkanki roślinnej w probówce. Dodać rozcieńczony kwas siarkowy do probówki i podgrzać próbkę. Po podgrzaniu kwas siarkowy hydrolizuje polisacharydy strawnych węglowodanów do odpowiednich podjednostek monosacharydowych.

Ostudzić próbkę. Odwirować probówkę w celu granulowania niestrawionego materiału roślinnego i uzyskać supernatant zawierający cukrów prostych.

Odessać supernatant do świeżej probówki i potraktować cukrów prostych roztworem fenolu, a następnie dodać kwas siarkowy. Wiruj probówkę, aby wymieszać zawartość i inkubować.

Podczas inkubacji kwas siarkowy odwadnia cukrów prostych do wytworzenia pochodnych furfuralu. Te pochodne furfuralu reagują z fenolem, tworząc roztwór żółtego złota.

Spektroskopowo określić absorbancję roztworu żółtego złota o długości 490 nanometrów, co odpowiada zawartości węglowodanów w próbce roślinnej.

Następnie weź różne stężenia roztworów glukozy i powtórz obróbkę kwasem fenolowo-siarkowym, aby uzyskać różną intensywność koloru, i wykreśl krzywą standardową. Porównaj wartość absorbancji nieznanej próbki węglowodanów ze wzorcem glukozy, aby uzyskać zawartość węglowodanów strawnych w tkance roślinnej.

Najpierw odważ powtórzenia z każdej próbki tkanki do szklanych probówek o pojemności 15 mililitrów. Oznaczyć probówki i zanotować dokładną masę każdej próbki.

Następnie dodaj 1 mililitr 0,1 molowego kwasu siarkowego do każdej probówki i szczelnie zamknij nakrętki. Następnie umieść probówki we wrzącej łaźni wodnej na 1 godzinę.

Przenieś rurki do letniej łaźni wodnej, aby ostygły. Następnie wlej zawartość probówek do oznaczonych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek. Następnie odwirować probówki o masie 15 000 g przez 10 minut. Za pomocą mikropipety przenieś supernatant do nowo oznakowanych probówek o pojemności 1,5 mililitra.

Za pomocą pipety przenieś 15 mikrolitrów każdej nieznanej próbki do własnej probówki. Następnie dodaj 385 mikrolitrów wody destylowanej do każdej probówki.

W dygestorium dodaj 400 mikrolitrów 5% fenolu do każdej probówki z próbką standardową i nieznaną. Natychmiast po tym dodaj 2 mililitry kwasu siarkowego do każdej probówki.

Upewnij się, że dodałeś kwas siarkowy na powierzchnię roztworu.

Po inkubacji probówek przez 10 minut, zwiruj probówki. Następnie inkubuj probówkę przez dodatkowe 30 minut.

Przenieś 800 mikrolitrów z każdej probówki na próbkę do trzech polistyrenowych 1,5-mililitrowych półmikro kuwet. Następnie ustaw spektrofotometr na odczyt 490 nanometrów i skalibruj go za pomocą ślepej kuwety.

Na koniec przepuść każdą kuwetę przez spektrofotometr i zapisz absorbancję.