Połączenie obrazowania ramanowskiego i analizy wielowymiarowej w celu wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny
10 czerwca 2017
Ten protokół ma na celu przedstawienie ogólnej metody wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianach komórkowych roślin za pomocą obrazowania Ramana i analizy wielowymiarowej.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest przedstawienie ogólnej metody wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej roślin za pomocą obrazowania Ramana i analizy wielowymiarowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomasy roślinnej, takie jak to, w jaki sposób główne składniki chemiczne rozmieszczają się w ścianie komórkowej rośliny. Główną zaletą tej techniki jest to, że można uzyskać niepracochłonne i nieniszczące informacje o próbce przy minimalnym przygotowaniu próbki.
Aby rozpocząć, wytnij mały blok tkanki z próbki rośliny. Zanurz tkankę we wrzącej wodzie dejonizowanej na 30 minut. Następnie natychmiast przenieś go do dejonizowanej wody o temperaturze pokojowej na 30 minut.
Powtarzaj ten krok, aż tkanka opadnie na dno pojemnika, wskazując, że powietrze z tkanki zostało usunięte i że tkanka zmiękła. Przygotuj 20%, 50%, 70% i 90% porcji PEG i wody dejonizowanej, a także czysty PEG. Utrzymuj roztwory w temperaturze 65 stopni Celsjusza.
Inkubuj tkankę w serii stopniowanych kąpieli PEG, aby wyprzeć wodę i umożliwić infiltrację PEG. Suszyć w 20% PEG przez godzinę, 50% PEG przez półtorej godziny, 70% PEG przez dwie godziny, 90% PEG przez dwie godziny i 100% PEG przez 10 godzin. Następnie podgrzej kasetę w temperaturze 65 stopni Celsjusza w piekarniku.
Wlej blok tkanki zawierający PEG do kasety, a następnie umieść blok tkanki w żądanej pozycji za pomocą wstępnie podgrzanej pęsety lub igieł. Powoli schładzaj kasetę i przechowuj chusteczkę w temperaturze pokojowej do czasu użycia. Rozetnij blok PEG zawierający tkankę docelową na mały blok za pomocą ostrej żyletki.
Zamontuj mały blok PEG na mikrotomie i wytnij cienkie odcinki z bloku PEG. Następnie spłucz skrawki wodą dejonizowaną w zegarku 10 razy, aby usunąć PEG z tkanki. Następnie zanurz skrawki w toluenie i etanolu na sześć godzin, aby usunąć ekstrakty.
Przygotować ciecz reakcyjną, mieszając w zlewce 65 ml wody dejonizowanej, 0,5 ml kwasu octowego i 0,6 g chlorku sodu. Dodać jedną sekcję i 3 ml płynu reakcyjnego do fiolki o pojemności 5 ml. Przykręcić górną część fiolki.
Następnie podgrzej fiolkę w łaźni wodnej w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby usunąć ligninę z tkanki. Przepłucz sekcję wodą dejonizowaną w szkiełku zegarkowym 10 razy. Następnie przenieś nieleczony i zdrewniały wycinek na szklane szkiełko mikroskopowe.
Ostrożnie rozłóż sekcję za pomocą szczotek lub igieł. Usuń nadmiar wody dejonizowanej za pomocą bibuły. Następnie zanurz sekcję w tlenku deuteru.
Przykryj próbkę szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zapobiec parowaniu tlenku deuteru. Otwórz oprogramowanie operacyjne konfokalnego mikroskopu Ramanowskiego.
Włącz laser i skup się na obsłudze kryształu i krzemu za pomocą obiektywu mikroskopowego o powiększeniu 100x. Kliknij przycisk kalibracji, aby skalibrować przyrząd. Przełącz przyrząd w tryb mikroskopu optycznego i włącz lampę mikroskopu.
Zamontuj szkiełko mikroskopowe na stoliku, szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę obiektywu. Obejrzyj próbkę za pomocą obiektywu mikroskopu 20x i zlokalizuj obszar zainteresowania. Przełącz się na obiektyw mikroskopu zanurzeniowego.
Nałóż olejek immersyjny na szkiełko nakrywkowe, a następnie skup się na powierzchni próbki. Następnie przełącz przyrząd w tryb testowania Ramana i wyłącz lampę mikroskopu. Wybierz obszar odwzorowania za pomocą narzędzia prostokątnego.
Zmień rozmiar kroku, aby określić liczbę uzyskanych widm. Należy pamiętać, że rozmiar kroku powinien być większy niż średnica plamki, obliczona na podstawie otworu numerycznego obiektywu. Rozmiary poniżej tej wartości spowodują nadmierne próbkowanie.
Ustaw optymalne parametry spektralne, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu i jakość spektralną, a także odpowiedni czas akwizycji w zależności od przydatności próbki. Ogólnie rzecz biorąc, wprowadź parametry obrazowania w oprogramowaniu instrumentu za pomocą długości fali lasera 532 nanometrów, filtra 100%, otworu 300, szczeliny 100, spektrometru 1840 centymetrów odwrotnych, rowków 1200T, obiektywu olejowego 60x i czasu akwizycji wynoszącego dwie sekundy. Zapisz dane spektralne przed ich przetworzeniem i przekonwertuj je na format uniwersalny przed przystąpieniem do analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Oryginalne widma Ramana ściany komórkowej topoli są pokazane tutaj. Dwa główne sygnały szumu, w tym dryfy linii bazowej i kosmiczne skoki, rozlewają się na kanały wraz z rzeczywistymi sygnałami. Należy je usunąć przed analizą danych.
W celu wyeliminowania tych sygnałów szumów można zastosować technikę redukcji szumów, taką jak algorytm Savitzky'ego-Golaya lub algorytm falkowy. W przypadku obrazowania ligniny należy wziąć pod uwagę pik widmowy około 1600 centymetrów odwrotnych ze względu na symetryczne wibracje rozciągające pierścienia aromatycznego. Do obrazowania polisacharydowego należy użyć piku widmowego o średnicy około 2889 centymetrów odwrotnych ze względu na rozciągnięcia CH i CH2.
Nie można jednak bezpośrednio generować obrazów ramanowskich celulozy i hemicelulozy. Delignacja jest zabiegiem niezbędnym do uwidocznienia ich charakterystyki spektralnej. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda jest dla nas nowa.
Walczymy, ponieważ wymaga to przeszkolenia w zakresie obsługi i wyglądu przekroju próbek oraz analizy danych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pozyskiwać informacje chemiczne o ścianie komórkowej roślin za pomocą metod in-situ. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak chemiczna obróbka wstępna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak oporność ściany komórkowej rośliny.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w wewnętrzną naturę strukturalną i topochemię w ścianie komórkowej rośliny, można ją również zastosować do innych próbek biologicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianach komórkowych roślin z wykorzystaniem obrazowania Ramana oraz analizy wielowymiarowej. Technika ta umożliwia nieniszczącą analizę składu chemicznego biomasy roślinnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Badania nad biomasą
- Chemia analityczna
Wstęp
- Zrozumienie składu ścian komórkowych roślin jest kluczowe dla wykorzystania biomasy.
- Obrazowanie Ramanowskie umożliwia szczegółowe mapowanie chemiczne tkanek roślinnych.
- Analiza wielowymiarowa wspomaga interpretację złożonych danych z obrazowania.
- Metoda ta minimalizuje przygotowanie próbek i jest nieinwazyjna.
Cel badania
- Wizualizacja rozkładu głównych składników chemicznych w ścianach komórkowych roślin.
- Zastosowanie metody analizy biomasy roślinnej niewymagającej dużego nakładu pracy.
- Pogłębienie wiedzy na temat struktury i składu ścian komórkowych roślin.
Zastosowane metody
- Wycinanie małych bloków tkanki z próbek roślinnych.
- Zanurzanie tkanki w wrzącej wodzie dejonizowanej przez 30 minut.
- Przeniesienie tkanki do wody dejonizowanej w temperaturze pokojowej na 30 minut.
- Wykorzystanie obrazowania Ramana do wizualizacji oraz analizy wielowymiarowej do interpretacji danych.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja ligniny, celulozy i hemicelulozy.
- Wykazane wzorce rozmieszczenia składników chemicznych w ścianach komórkowych.
- Opracowanie nieniszczącej metody analizy tkanek roślinnych.
- Ułatwienie dalszych badań nad zastosowaniami biomasy roślinnej.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w badaniu składu ścian komórkowych roślin.
- Obrazowanie ramanowskie w połączeniu z analizą wielowymiarową dostarcza cennych informacji.
- Podejście to może przyczynić się do postępu w badaniach nad biologią roślin i wykorzystaniem biomasy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia nieniszczącą wizualizację ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianach komórkowych roślin bez użycia znaczników, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach konwersji biomasy i opracowywaniu materiałów pochodzenia biologicznego. Dzięki dostarczaniu danych o składzie chemicznym z rozdzielczością przestrzenną, ułatwia ona walidację celów w inżynierii enzymatycznej oraz optymalizację obróbki wstępnej. Podejście to zmniejsza zależność od analiz niszczących i zwiększa pewność prognostyczną w przepływach pracy dotyczących wczesnego etapu przesiewania biomasy.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę architektury ściany komórkowej roślin w celu sformułowania hipotez dotyczących oporności biomasy i dostępności enzymatycznej.
- Wartość operacyjna: Wspiera walidację funkcjonalną celów poprzez korelację rozkładu chemicznego z wynikami strawności enzymatycznej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe wyniki spektralne, które mogą zostać zestandaryzowane w celu wysokoprzepustowego przesiewu wariantów biomasy.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przygotowanie do analizy dzięki powtarzalnemu przygotowaniu próbek i minimalnej zmienności zależnej od operatora po przeszkoleniu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza istotnych dla chorób wglądów w system, łącząc skład ściany komórkowej z cechami fenotypowymi w zakresie wydajności biomasy i efektywności przetwarzania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do skalowania przedklinicznego poprzez dostarczanie spójnych, beznakietkowych danych kompozycyjnych dla zestawów próbek.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając wczesną charakterystykę biomasy i umożliwiając podejmowanie decyzji opartych na danych w procesach rozwoju enzymów oraz metod wstępnej obróbki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących barier strukturalnych w dekonstrukcji biomasy poprzez bezpośrednią wizualizację sieci lignina-polisacharyd.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, rozdzielone przestrzennie mapy chemiczne, które umożliwiają porównanie zmian w składzie ścian komórkowych wywołanych genetycznie lub traktowaniem.
- Analityka: Generuje wielowymiarowe wyniki ilościowo określające rozkład i ko-lokalizację składników, co umożliwia obiektywne porównanie różnych warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną, dostarczając punktów odniesienia w zakresie składu, co pozwala ocenić przydatność biomasy w procesach pozyskiwania biopaliw lub bioproduktów.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania i analizy, którą można zastosować dla wielu rodzajów surowców biomasowych oraz na różnych etapach projektu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w zakresie oporności biomasy.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność dzięki zdefiniowanym protokołom akwizycji widm i przetwarzania danych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w rozwoju szczepów biomasy lub metod obróbki wstępnej poprzez zapewnienie wczesnej oceny ryzyka składnikowego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów biomasy z uwzględnieniem ryzyka na podstawie zwalidowanych profili strukturalnych i składnikowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie spektroskopii Ramanowskiej, wielowymiarowej analizy danych oraz obchodzenia się z tkankami roślinnymi.
- Zależne od dostępu do konfokalnych mikroskopów Ramanowskich z odpowiednimi długościami fal laserowych i obiektywami.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania próbek, sekcjonowania i interpretacji danych w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy jej zastosowaniu do różnych gatunków roślin lub typów tkanek o zróżnicowanej złożoności ścian komórkowych.
- Ograniczone przez konieczność delignifikacji w celu rozdzielenia sygnałów celulozy i hemicelulozy, co dodaje kolejne kroki proceduralne i wprowadza potencjalną zmienność.
