Połączenie obrazowania ramanowskiego i analizy wielowymiarowej w celu wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny

Ogólnym celem tego eksperymentu jest przedstawienie ogólnej metody wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej roślin za pomocą obrazowania Ramana i analizy wielowymiarowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomasy roślinnej, takie jak to, w jaki sposób główne składniki chemiczne rozmieszczają się w ścianie komórkowej rośliny. Główną zaletą tej techniki jest to, że można uzyskać niepracochłonne i nieniszczące informacje o próbce przy minimalnym przygotowaniu próbki.

Aby rozpocząć, wytnij mały blok tkanki z próbki rośliny. Zanurz tkankę we wrzącej wodzie dejonizowanej na 30 minut. Następnie natychmiast przenieś go do dejonizowanej wody o temperaturze pokojowej na 30 minut.

Powtarzaj ten krok, aż tkanka opadnie na dno pojemnika, wskazując, że powietrze z tkanki zostało usunięte i że tkanka zmiękła. Przygotuj 20%, 50%, 70% i 90% porcji PEG i wody dejonizowanej, a także czysty PEG. Utrzymuj roztwory w temperaturze 65 stopni Celsjusza.

Inkubuj tkankę w serii stopniowanych kąpieli PEG, aby wyprzeć wodę i umożliwić infiltrację PEG. Suszyć w 20% PEG przez godzinę, 50% PEG przez półtorej godziny, 70% PEG przez dwie godziny, 90% PEG przez dwie godziny i 100% PEG przez 10 godzin. Następnie podgrzej kasetę w temperaturze 65 stopni Celsjusza w piekarniku.

Wlej blok tkanki zawierający PEG do kasety, a następnie umieść blok tkanki w żądanej pozycji za pomocą wstępnie podgrzanej pęsety lub igieł. Powoli schładzaj kasetę i przechowuj chusteczkę w temperaturze pokojowej do czasu użycia. Rozetnij blok PEG zawierający tkankę docelową na mały blok za pomocą ostrej żyletki.

Zamontuj mały blok PEG na mikrotomie i wytnij cienkie odcinki z bloku PEG. Następnie spłucz skrawki wodą dejonizowaną w zegarku 10 razy, aby usunąć PEG z tkanki. Następnie zanurz skrawki w toluenie i etanolu na sześć godzin, aby usunąć ekstrakty.

Przygotować ciecz reakcyjną, mieszając w zlewce 65 ml wody dejonizowanej, 0,5 ml kwasu octowego i 0,6 g chlorku sodu. Dodać jedną sekcję i 3 ml płynu reakcyjnego do fiolki o pojemności 5 ml. Przykręcić górną część fiolki.

Następnie podgrzej fiolkę w łaźni wodnej w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby usunąć ligninę z tkanki. Przepłucz sekcję wodą dejonizowaną w szkiełku zegarkowym 10 razy. Następnie przenieś nieleczony i zdrewniały wycinek na szklane szkiełko mikroskopowe.

Ostrożnie rozłóż sekcję za pomocą szczotek lub igieł. Usuń nadmiar wody dejonizowanej za pomocą bibuły. Następnie zanurz sekcję w tlenku deuteru.

Przykryj próbkę szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zapobiec parowaniu tlenku deuteru. Otwórz oprogramowanie operacyjne konfokalnego mikroskopu Ramanowskiego.

Włącz laser i skup się na obsłudze kryształu i krzemu za pomocą obiektywu mikroskopowego o powiększeniu 100x. Kliknij przycisk kalibracji, aby skalibrować przyrząd. Przełącz przyrząd w tryb mikroskopu optycznego i włącz lampę mikroskopu.

Zamontuj szkiełko mikroskopowe na stoliku, szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę obiektywu. Obejrzyj próbkę za pomocą obiektywu mikroskopu 20x i zlokalizuj obszar zainteresowania. Przełącz się na obiektyw mikroskopu zanurzeniowego.

Nałóż olejek immersyjny na szkiełko nakrywkowe, a następnie skup się na powierzchni próbki. Następnie przełącz przyrząd w tryb testowania Ramana i wyłącz lampę mikroskopu. Wybierz obszar odwzorowania za pomocą narzędzia prostokątnego.

Zmień rozmiar kroku, aby określić liczbę uzyskanych widm. Należy pamiętać, że rozmiar kroku powinien być większy niż średnica plamki, obliczona na podstawie otworu numerycznego obiektywu. Rozmiary poniżej tej wartości spowodują nadmierne próbkowanie.

Ustaw optymalne parametry spektralne, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu i jakość spektralną, a także odpowiedni czas akwizycji w zależności od przydatności próbki. Ogólnie rzecz biorąc, wprowadź parametry obrazowania w oprogramowaniu instrumentu za pomocą długości fali lasera 532 nanometrów, filtra 100%, otworu 300, szczeliny 100, spektrometru 1840 centymetrów odwrotnych, rowków 1200T, obiektywu olejowego 60x i czasu akwizycji wynoszącego dwie sekundy. Zapisz dane spektralne przed ich przetworzeniem i przekonwertuj je na format uniwersalny przed przystąpieniem do analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Oryginalne widma Ramana ściany komórkowej topoli są pokazane tutaj. Dwa główne sygnały szumu, w tym dryfy linii bazowej i kosmiczne skoki, rozlewają się na kanały wraz z rzeczywistymi sygnałami. Należy je usunąć przed analizą danych.

W celu wyeliminowania tych sygnałów szumów można zastosować technikę redukcji szumów, taką jak algorytm Savitzky'ego-Golaya lub algorytm falkowy. W przypadku obrazowania ligniny należy wziąć pod uwagę pik widmowy około 1600 centymetrów odwrotnych ze względu na symetryczne wibracje rozciągające pierścienia aromatycznego. Do obrazowania polisacharydowego należy użyć piku widmowego o średnicy około 2889 centymetrów odwrotnych ze względu na rozciągnięcia CH i CH2.

Nie można jednak bezpośrednio generować obrazów ramanowskich celulozy i hemicelulozy. Delignacja jest zabiegiem niezbędnym do uwidocznienia ich charakterystyki spektralnej. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda jest dla nas nowa.

Walczymy, ponieważ wymaga to przeszkolenia w zakresie obsługi i wyglądu przekroju próbek oraz analizy danych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pozyskiwać informacje chemiczne o ścianie komórkowej roślin za pomocą metod in-situ. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak chemiczna obróbka wstępna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak oporność ściany komórkowej rośliny.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w wewnętrzną naturę strukturalną i topochemię w ścianie komórkowej rośliny, można ją również zastosować do innych próbek biologicznych.