Name: Połączenie obrazowania ramanowskiego i analizy wielowymiarowej w celu wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj metodę obrazowania ramanowskiego z analizą wielowymiarową do wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianach komórkowych roślin. Technika ta dostarcza nieinwazyjnych informacji o składzie chemicznym biomasy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy chińskiemu Ministerstwu Nauki i Technologii (2016YDF0600803) za wsparcie finansowe.

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Wytnij mały blok tkanki (około 3 mm x 3 mm x 5 mm) z próbki rośliny (np. łodygi topoli).</li>
	<li>Zanurz chusteczkę we wrzącej wodzie dejonizowanej na 30 minut. Natychmiast przenieś ją do wody dejonizowanej o temperaturze pokojowej (RT) na 30 minut. Powtarzaj ten krok, aż tkanka opadnie na dno pojemnika, wskazując, że powietrze z tkanki zostało usunięte i że tkanka zmiękła. 
	Uwaga: W przypadku próbek, które opadają na dno przed tym krokiem, zazwyczaj powtórz ten cykl 3-5 razy.</li>
	<li>Przygotować 20, 50, 70, 90% (v/v) podwielokrotności glikolu polietylenowego (PEG) w wodzie dejonizowanej, jak również czysty PEG, i utrzymywać roztwory w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Inkubuj tkankę w serii stopniowanych kąpieli PEG, aby wyprzeć wodę i umożliwić infiltrację PEG. 
	Uwaga: Zazwyczaj do osadzania używa się PEG o masie cząsteczkowej 2,000 (PEG2000).
	<ol>
		<li>Przetwarzaj tkankę z klasyfikowanym PEG w piecu do suszenia w następujący sposób: (a) 20% PEG przez 1 godzinę, (b) 50% PEG przez 1,5 godziny, (c) 70% PEG przez 2 godziny, (d) 90% PEG przez 2 godziny i (e) 100% PEG przez 10 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podgrzej kasetę w temperaturze 65 °C w piekarniku. Wlej PEG zawierający blok do kasety, a następnie umieść blok tkanki w żądanej pozycji za pomocą wstępnie podgrzanej pęsety lub igieł.</li>
	<li>Powoli schładzaj kasetę i przechowuj chusteczkę w temperaturze pokojowej do czasu użycia.</li>
	<li>Rozetnij blok PEG zawierający tkankę docelową na mały blok (około 1 cm x 1 cm x 2 cm) za pomocą ostrej żyletki i zamontuj go na mikrotomie.</li>
	<li>Wytnij cienkie odcinki z bloku PEG (zwykle 3-10 μm).</li>
	<li>Opłucz sekcję wodą dejonizowaną w szkiełku zegarkowym 10 razy, aby usunąć PEG z tkanki.</li>
	<li>Zanurz sekcje w toluenie/etanolu (2:1, v/v) na 6 godzin, aby usunąć ekstrakty. Przygotować ciecz reakcyjną, mieszając 65 ml wody dejonizowanej, 0,5 ml kwasu octowego i 0,6 g chlorynu sodu w zlewce. Dodać jedną sekcję i 3 ml płynu reakcyjnego do fiolki o pojemności 5 ml. Przykręcić górną część fiolki.</li>
	<li>Ogrzewać fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 75 °C przez 2 godziny w celu usunięcia ligniny z tkanki. Przepłucz sekcję wodą dejonizowaną w szkiełku zegarkowym 10 razy.</li>
	<li>Przenieś nieleczony/delignifikowany wycinek na szklane szkiełko mikroskopowe. Ostrożnie rozłóż sekcję za pomocą szczotek lub igieł. Usuń nadmiar wody dejonizowanej za pomocą bibuły.</li>
	<li>Zanurzyć wycinek w D2O. Przykryć próbkę szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci, aby zapobiec parowaniu D2O.</li>
</ol>
2. Akwizycja spektralna
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie operacyjne konfokalnego mikroskopu Ramanowskiego. Włącz laser (długość fali = 532 nm), skup się na powierzchni krzemu krystalicznego za pomocą obiektywu mikroskopu 100X i kliknij przycisk kalibracji, aby skalibrować instrument.</li>
	<li>Przełącz przyrząd w tryb mikroskopu optycznego i włącz lampę mikroskopu. Zamontuj szkiełko mikroskopowe na stoliku, szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę obiektywu.</li>
	<li>Obejrzyj próbkę za pomocą obiektywu mikroskopowego 20X i zlokalizuj obszar zainteresowania. Nałóż olejek immersyjny na szkiełko nakrywkowe i przełącz na obiektyw mikroskopu zanurzeniowego (60X, apertura numeryczna NA = 1,35). Skoncentruj się na powierzchni próbki.</li>
	<li>Przełącz przyrząd w tryb testowania Ramana i wyłącz lampę mikroskopu.</li>
	<li>Wybierz obszar odwzorowania za pomocą narzędzia prostokątnego. Zmień rozmiar kroku, aby określić liczbę uzyskanych widm. 
	Uwaga: Należy zwrócić uwagę na rozmiar kroku (zwykle większy niż średnica plamki obliczona na podstawie apertury numerycznej obiektywu; teoretycznie 1,22λ/NA). Rozmiary poniżej tej wartości spowodują nadpróbkowanie.</li>
	<li>Ustaw optymalne parametry spektralne, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu (SNR) i jakość widmową w odpowiednim czasie akwizycji (zwykle < 8 godzin), w zależności od przydatności próbki. Ogólnie rzecz biorąc, wprowadź parametry obrazowania w oprogramowaniu przyrządu w następujący sposób: laser (532 nm), filtr (100%), otwór (300), szczelina (100), spektrometr (1,840 cm-1), rowki (1200t), obiektyw (olej 60X) i czas akwizycji (2 s).</li>
	<li>Zapisz dane spektralne przed przetworzeniem danych i przekonwertuj je do uniwersalnego formatu (np. plików TXT).</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Załaduj dane spektralne (pliki TXT) do oprogramowania do analizy danych (np. Matlab). Zastosuj technikę redukcji szumów w zbiorze danych w celu poprawy SNR (np. algorytm Savitzsky'ego-Golaya lub algorytm falkowy)</li>
	<li>Użyj próbek niepoddanych obróbce, aby uzyskać obrazy ligniny i polisacharydów. W przypadku obrazowania ligniny należy wziąć pod uwagę pik widmowy około 1,600 cm-1 spowodowany symetrycznymi wibracjami rozciągającymi pierścienia aromatycznego. Do obrazowania polisacharydowego (w tym celulozy i hemicelulozy) należy użyć piku widmowego około 2,889 cm-1 ze względu na rozciąganie CH iCH2.</li>
	<li>Użyj próbek delignifikowanych, aby wygenerować obrazy celulozy i hemicelulozy. Wykonaj rozdzielczość krzywej samodzielnego modelowania (SMCR) na uzyskanych widmach, aby rozróżnić widma celulozy i hemicelulozy oraz zobrazować ich rozkład.</li>
	<li>Wykonaj analizę głównych składowych (PCA) i analizę skupień na uzyskanych danych, aby odróżnić widma Ramana od różnych warstw ściany komórkowej.</li>
</ol>

<ol><li>Gonzalo, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Enzymes+Involved+in+Lignin+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Enzymes Involved in Lignin Degradation.</a> J. Biotechnol. 236, 110-119 (2016).</li>
<li>Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosatella%2C+AA+%22Ionic+Liquids+in+the+Biorefinery+Concept%3A+Challenges+and+Perspectives%22">Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives</a>. , Wiley. 38-64 (2016).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+tissue+specific+compositions+of+bioenergy+feedstocks+Through+hyperspectral+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bio%22%5BJournal%5D)">Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging.</a> Bio. 108 (2), 286-295 (2009).</li>
<li>Tolstik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+and+prediction+of+HCC+tissues+by+Raman+imaging+with+identification+of+fatty+acids+as+potential+lipid+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer.+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).</li>
<li>Schrader, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchrader%2C+B+%22Infrared+and+Raman+spectroscopy%3A+methods+and+applications%22">Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications</a>. , John Wiley and Sons. (2008).</li>
<li>Gierlinger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+plant+cell+walls+by+confocal+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).</li>
<li>Luca, A. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+fluorescence+suppression+in+modulated+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy.</a> Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).</li>
<li>Schlücker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+microspectroscopy%3A+a+comparison+of+point%2C+line%2C+and+wide-field+imaging+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies.</a> Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).</li>
<li>Cooper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169743998001749">Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications.</a> Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).</li>
<li>Cheng, H. J., Hsiau, S. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003259101000046X">The study of granular agglomeration mechanism.</a> Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+removing+spectral+contaminants+to+improve+analysis+of+Raman+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data.</a> Sci. Rep. 6, 39891(2016).</li>
<li>Shinzawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jrs.2525/abstract">Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging.</a> J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).</li>
<li>Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/1267173">Self modeling curve resolution.</a> Technometrics. 13, 617-633 (1971).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+automatically+identifying+spectra+of+different+wood+cell+wall+layers+in+Raman+imaging+data+set%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set.</a> Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).</li>
<li>Kudelski, A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0039914008001641">Analytical application of Raman spectroscopy.</a> Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ściana komórkowa rośliny jest kompozytem, który jest zorganizowany w kilka warstw, w tym narożnik komórki (CC), ściana wtórna (SW, z warstwami S1, S2 i S3) oraz złożona blaszka środkowa (CML, blaszka środkowa plus sąsiednia ściana pierwotna), co utrudnia uzyskanie płaskiej powierzchni podczas przygotowywania próbki. W związku z tym próbki roślin, zwłaszcza trawa, która ma bardziej skomplikowaną strukturę niż drewno, często muszą zostać zestalone, aby umożliwić dokładne pokrojenie. PEG jest idealną twardą matrycą do cięci...

Biomasa roślinna jest najobfitszym zasobem odnawialnym na Ziemi; składa się głównie z ligniny, celulozy i hemicelulozy; i jest uważana za atrakcyjne źródło bioenergii i biochemikaliów1. Niestety, może być odporny na degradację i nadawać stabilność hydrolityczną lub wytrzymałość strukturalną ścianie komórkowej rośliny. Taką odporność można przypisać dostępnej powierzchni, wielkości cząstek biomasy, stopniowi polimeryzacji, krystaliczności celulozy i ochronnej ligninie2. Kompleksowe zrozumienie strukturalnej i chemicznej natury ściany komórkowej roślin jest zatem istotne z punktu widzenia biologii i chemii roślin, a także z punktu widzenia komercyjnego wykorzystania. Powszechnie stosowane analizy chemii mokrej, takie jak chromatografia, spektrometria mas i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego, dostarczają jedynie uśrednionych danych dotyczących składu mierzonej próbki. Co więcej, metody te są inwazyjne i niszczą oryginalną strukturę tkanki roślinnej3. 
Technika obrazowania Ramana to potężne narzędzie do nieniszczącej wizualizacji przestrzennie rozdzielonych informacji chemicznych4. Wykorzystuje światło laserowe do wywoływania nieelastycznego rozpraszania za pomocą fotonu i opiera się na zmianach polaryzowalności wynikających z wibracji molekularnych. W tym przypadku woda powoduje słabe rozpraszanie Ramana, co sprawia, że to podejście jest odpowiednie do badań in situ próbek biologicznych5. Zastosowanie techniki obrazowania ramanowskiego do ściany komórkowej rośliny może wyjaśnić strukturę i skład ścian komórkowych roślin w ich stanie naturalnym, z rozdzielczością w skali pojedynczej komórki, a nawet warstw ściany komórkowej6. Typowa analiza obrazowa ściany komórkowej rośliny składa się zazwyczaj z trzech etapów: 1) przygotowania próbki, 2) akwizycji spektralnej i 3) przetwarzania danych. 
Chociaż jedną z głównych zalet obrazowania Ramana jest możliwość uzyskania bezznacznikowych i nieniszczących widm przy minimalnym przygotowaniu próbki, fizyczne cięcie próbki jest nadal konieczne, aby odsłonić powierzchnię będącą przedmiotem zainteresowania. Proces ten powinien być wykonywany ostrożnie, aby uzyskać płaską powierzchnię, ponieważ technika ta polega na utrzymaniu ostrości optycznej7. Akwizycja spektralna wymaga równowagi między jakością obrazu a długim czasem akwizycji8. Przetwarzanie danych ma na celu skuteczne wyodrębnienie informacji chemicznej z danych obrazu, zwłaszcza w przypadku składników o podobnej budowie chemicznej, takich jak celuloza i hemiceluloza. Ze względu na silne nakładanie się widm, dokładne widma są trudne do rozpoznania. W tym przypadku analiza wielowymiarowa jest prostym podejściem do skutecznego odkrycia ukrywających się informacji strukturalnych i chemicznych9. W niniejszej pracy przedstawiono ogólny protokół opisujący zastosowanie obrazowania ramanowskiego do wizualizacji głównych składników ścian komórkowych roślin, w tym ligniny, celulozy i hemicelulozy.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM430</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop Ramanowski</td><td>Horiba Jobin Yvon</td><td>Xplora</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Szanghaj ZHICHENG</td><td>ZXFD-A5040</td><td></td></tr></tbody></table>

połączenie obrazowania ramanowskiego i analizy wielowymiarowej w celu wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

Zastosowanie obrazowania ramanowskiego do biomasy roślinnej rośnie, ponieważ może dostarczyć informacji przestrzennych i składowych na temat roztworów wodnych. Analiza zwykle nie wymaga intensywnego przygotowania próbki; Informacje strukturalne i chemiczne można uzyskać bez etykietowania. Jednak każdy obraz Ramana zawiera tysiące widm; Stwarza to trudności przy wydobywaniu ukrytych informacji, zwłaszcza w przypadku składników o podobnej budowie chemicznej. W niniejszej pracy przedstawiono analizę wielowymiarową w celu rozwiązania tego problemu. Protokół ustanawia ogólną metodę wizualizacji głównych składników, w tym ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny. W niniejszym protokole opisano procedury przygotowania próbki, akwizycji spektralnej i przetwarzania danych. Jest to w dużym stopniu zależne od umiejętności operatora w zakresie przygotowania próbek i analizy danych. Dzięki zastosowaniu tego podejścia badanie ramanowskie może być przeprowadzone przez użytkownika niebędącego specjalistą w celu uzyskania wysokiej jakości danych i znaczących wyników do analizy ściany komórkowej roślin.

Rysunek 1 przedstawia schemat typowego układu mikro-Raman do obrazowania ramanowskiego ściany komórkowej rośliny. Jako przykład, oryginalne widma ramanowskie topoli (Populus nigra L.) wykazują znaczące dryfty linii bazowej oraz piki szumowe (Rysunek 2a). Po zastosowaniu automatycznej metody wstępnego przetwarzania dla zestawów danych obrazowania ramanowskiego (APRI), oba te zanieczyszczenia widmowe zostają skutecznie usu...

Ten protokół ma na celu przedstawienie ogólnej metody wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianach komórkowych roślin za pomocą obrazowania Ramana i analizy wielowymiarowej.

Połączenie obrazowania ramanowskiego i analizy wielowymiarowej w celu wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest przedstawienie ogólnej metody wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej roślin za pomocą obrazowania Ramanowskiego i analizy wielowymiarowej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biomasy roślinnej, takie jak sposób rozmieszczenia głównych składników chemicznych w ścianie komórkowej roślin. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania informacji o próbce w sposób nieniszczący i niewymagający dużego nakładu pracy, przy minimalnym przygotowaniu materiału.Na początek należy wyciąć niewielki blok tkanki z próbki roślinnej. Tkankę zanurzono we wrzącej wodzie dejonizowanej na 30 minut. Następnie niezwłocznie przeniesiono ją do wody dejonizowanej w temperaturze pokojowej na 30 minut.Powtarzaj ten krok, aż tkanka opadnie na dno pojemnika, co będzie wskazywać na usunięcie z tkanki powietrza oraz jej zmiękczenie. Przygotuj aliquoty PEG i wody dejonizowanej o stężeniach 20%, 50%, 70% i 90% oraz czysty PEG. Przechowuj roztwory w temperaturze 65 °C.Inkubuj tkankę w serii kąpieli w PEG o rosnącym stężeniu, aby usunąć wodę i umożliwić infiltrację PEG. Susz w 20% PEG przez jedną godzinę, 50% PEG przez półtorej godziny, 70% PEG przez dwie godziny, 90% PEG przez dwie godziny oraz 100% PEG przez 10 godzin. Następnie wstępnie podgrzej kasetę w piekarniku do 65 °C.Wlej blok tkankowy zawierający PEG do kasetki, a następnie umieść blok tkankowy w pożądanej pozycji za pomocą uprzednio ogrzanych pęset lub igieł. Powoli schłodź kasetkę i przechowuj tkankę w temperaturze pokojowej do momentu użycia. Podziel blok PEG zawierający docelową tkankę na mniejszy blok, używając ostrego ostrza brzytwy.Zamocuj mały blok PEG w mikrotomie i wykonaj cienkie przekroje z bloku PEG. Następnie wypłucz przekroje wodą dejonizowaną w szkiełku zegarkowym 10 razy, aby usunąć PEG z tkanki. Następnie zanurz przekroje w toluenie i etanolu na sześć godzin w celu usunięcia substancji ekstrahowalnych.Przygotuj ciecz reakcyjną, mieszając w zlewce 65 mL wody dejonizowanej, 0,5 mL kwasu octowego oraz 0,6 g chlorku sodu. Do fiolki o pojemności 5 mL dodaj jedną sekcję oraz 3 mL cieczy reakcyjnej. Zakręć fiolkę.Następnie podgrzewaj fiolkę w kąpieli wodnej w temperaturze 75 °C przez dwie godziny, aby usunąć ligninę z tkanki. Przepłucz przekrój wodą dejonizowaną w szkiełku zegarkowym 10 razy. Następnie przenieś niepoddany obróbce oraz odligninowany przekrój na szklaną lamelkę mikroskopową.Ostrożnie rozprostuj przekrój, używając pędzli lub igieł. Usuń nadmiar wody dejonizowanej za pomocą ręcznika papierowego. Następnie zanurz przekrój w tlenku deuteru.Przykryj próbkę szkiełkiem nakrywką. Uszczelnij szkiełko lakierem do paznokci, aby zapobiec odparowaniu tlenku deuteru. Uruchom oprogramowanie sterujące konfokalnym mikroskopem Ramanowskim.Włącz laser i ustaw ostrość na powierzchni kryształu oraz krzemu, używając obiektywu mikroskopowego 100x. Kliknij przycisk kalibracji, aby skalibrować urządzenie. Przełącz urządzenie w tryb mikroskopu optycznego i włącz lampę mikroskopu.Zamocuj preparat na stoliku mikroskopu, tak aby szkiełko nakrywowe było skierowane w stronę obiektywu. Obejrzy próbkę przy użyciu obiektywu 20x i zlokalizuj obszar zainteresowania. Przełącz na obiektyw immersyjny.Nanieś olej immersyjny na szkiełko nakrywowe, a następnie ustaw ostrość na powierzchni próbki. Następnie przełącz urządzenie w tryb pomiaru Raman i wyłącz lampę mikroskopu. Wybierz obszar mapowania, korzystając z narzędzia prostokąta.Zmień wielkość kroku, aby określić liczbę uzyskanych widm. Należy pamiętać, że wielkość kroku powinna być większa niż średnica plamki, obliczana na podstawie apertury numerycznej obiektywu. Wartości mniejsze od tej spowodują nadmierne próbkowanie.Ustaw optymalne parametry widmowe, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu i najwyższą jakość widma, oraz odpowiedni czas akwizycji w zależności od przydatności próbki. Zazwyczaj wprowadza się parametry obrazowania w oprogramowaniu urządzenia, używając długości fali lasera 532 nanometrów, filtra 100%a, otworu 300, szczeliny 100, spektrometru 1840 cm⁻¹, rastra 1200T, obiektywu olejowego 60x oraz czasu akwizycji wynoszącego dwie sekundy. Przed przystąpieniem do przetwarzania danych należy zapisać dane widmowe, a następnie przekonwertować je na format uniwersalny przed rozpoczęciem analizy danych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Tutaj przedstawiono oryginalne widma Ramana ściany komórkowej topoli. Dwa główne sygnały szumu, obejmujące dryfty linii bazowej oraz piki kosmiczne, nakładają się na kanały wraz z właściwymi sygnałami. Powinny one zostać usunięte przed przystąpieniem do analizy danych.W celu wyeliminowania tych sygnałów szumu można zastosować technikę redukcji szumów, taką jak algorytm Savitzky'ego-Golaya lub algorytm falkowy. W przypadku obrazowania ligniny należy uwzględnić piki widmowe w okolicach 1600 cm⁻¹, wynikające z symetrycznych drgań rozciągających pierścienia aromatycznego. W przypadku obrazowania polisacharydów należy wykorzystać piki widmowe w okolicach 2889 cm⁻¹, wynikające z drgań rozciągających wiązań CH i CH2.Obrazy Ramana celulozy i hemicelulozy nie mogą być jednak generowane bezpośrednio. Delignifikacja jest niezbędną procedurą, aby odsłonić ich charakterystykę widmową. Zazwyczaj jesteśmy nowicjuszami w stosowaniu tej metody.Proces ten jest wymagający, ponieważ wymaga przeszkolenia w zakresie przygotowywania i wyglądu przekrojów próbek oraz analizy danych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo uzyskać dobrą wiedzę na temat pozyskiwania informacji chemicznych o ścianie komórkowej roślin za pomocą metod in-situ. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak wstępna obróbka chemiczna, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące oporności ściany komórkowej roślin.Chociaż metoda ta może dostarczyć wglądu w wewnętrzną strukturę i topochemię w obrębie ściany komórkowej roślin, można ją zastosować również do innych próbek biologicznych.

combining-raman-imaging-multivariate-analysis-to-visualize-lignin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Biomasa roślinna jest głównym neutralnym węglowo zasobem odnawialnym, który może być wykorzystany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu ligniny polifenolowej.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część I: Lignina

Biomasa roślinna jest głównym, neutralnym pod względem emisji dwutlenku węgla odnawialnym zasobem, który może być wykorzystywany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu węglowodanów pochodzących ze ścian komórkowych.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasy lignocelulozowej) Część II: Węglowodany

Przedstawiono metodę opartą na konfokalnej mikroskopii Ramanowskiej, która umożliwia bezznakową wizualizację ligniny w ścianach komórkowych roślin oraz porównanie procesu lignifikacji w różnych tkankach, próbkach lub gatunkach.

Bez znakowania in situ Obrazowanie lignifikacji w ścianach komórkowych roślin

Struktura ściany komórkowej roślin i cechy chemiczne są oceniane w celu zidentyfikowania idealnych surowców do produkcji biopaliw i biomateriałów. Standardowe metody mają ograniczenia, gdy są stosowane do dużych zestawów danych. Te wysokoprzepustowe metody obróbki wstępnej, scukrzania enzymatycznego i pirolizy ze spektrometrią mas wiązki molekularnej porównują dużą liczbę próbek biomasy przy skróconym czasie i kosztach eksperymentu.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe zmian oporności biomasy lignocelulozowej: lignina całkowita, monomery ligniny i enzymatyczne uwalnianie cukru

Krystaliczna celuloza jest ważnym składnikiem ściany komórkowej roślin. Jednak jego kwantyfikacja w rozdzielczości komórkowej jest technicznie trudna.  W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie technologii światła spolaryzowanego i przekrojów korzeniowych w celu uzyskania informacji o składzie ściany komórkowej w rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

BLISS, protokół podwójnego etykietowania do badania dynamiki lignifikacji, został opracowany. Wykorzystując syntetyczne reportery monolignolu i sekwencyjną kombinację bioortogonalnych reakcji klikania SPAAC i CuAAC, metodologia ta toruje drogę do dogłębnej analizy czynników regulujących biogenezę lignin w planta.

Wizualizacja dynamiki zdrewniałości w roślinach za pomocą chemii kliknięć: Podwójne etykietowanie to BŁOGOŚĆ!

Ten protokół opisuje oryginalną konfigurację łączącą pomiary czasu życia widma i fluorescencji w celu oceny transferu energii rezonansu Förstera (FRET) między sondami fluorescencyjnymi na bazie rodaminy a polimerem ligniny bezpośrednio w grubych sekcjach rośliny.

Pomiar interakcji między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w skrawkach roślin za pomocą sFLIM w oparciu o natywną autofluorescencję

Protokół ten przedstawia multimodalne podejście łączące spektroskopię Ramana i tomograficzną mikroskopię fazową w celu bezznacznikowego, nieinwazyjnego fenotypowania żywych ludzkich komórek raka piersi. Zawiera przyjazny dla użytkownika, wolny od uprzedzeń człowieka potok analityczny do szybkiej, ilościowej analizy morfochemicznej, dostarczając szczegółowych informacji molekularnych i strukturalnych z zastosowaniami w badaniach nad rakiem i biologii komórki.

Ramy obrazowania multimodalnego w celu przyspieszenia fenotypowania żywych, bezznacznikowych komórek raka piersi

W tym manuskrypcie przedstawiono metody periodatowego utleniania i sieciowania aldehydu glutarowego do kowalencyjnego unieruchamiania przeciwciał na krążkach papierowych. Oceniano aktywność wiązania unieruchomionych przeciwciał. Na podstawie tych wyników zastosowano metodę sieciowania aldehydu glutarowego w celu opracowania nowatorskiego, opartego na papierze testu immunologicznego do wykrywania immunoglobuliny G (IgG).

Kowalencyjne wiązanie przeciwciał z krążkami papieru celulozowego i ich zastosowania w kolorymetrycznych testach immunologicznych gołym okiem

Tutaj prezentujemy wiarygodny i łatwy test do pomiaru zawartości glikogenu w komórkach sinic. Procedura polega na wytrącaniu, selektywnej depolimeryzacji i wykrywaniu pozostałości glukozy. Metoda ta jest odpowiednia zarówno dla szczepów dzikich, jak i genetycznie modyfikowanych i może ułatwić inżynierię metaboliczną sinic.

Oznaczanie zawartości glikogenu w sinicach

Poznaj metodę obrazowania ramanowskiego z analizą wielowymiarową do wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianach komórkowych roślin. Technika ta dostarcza nieinwazyjnych informacji o składzie chemicznym biomasy.

Połączenie obrazowania ramanowskiego i analizy wielowymiarowej w celu wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny (Wideo) | JoVE Journal

Połączenie obrazowania ramanowskiego i analizy wielowymiarowej w celu wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny

Przeglądaj więcej filmów