Blokowanie PCR typu dzikiego w celu wykrycia mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości

Reakcja łańcuchowa polimerazy blokującej typu dzikiego lub WTB-PCR wykrywa mutacje punktowe poprzez selektywną amplifikację zmutowanych alleli o niskiej liczebności, jednocześnie hamując amplifikację alleli typu dzikiego o wysokiej liczebności w próbkach DNA.

WTB-PCR wykorzystuje zablokowane kwasy nukleinowe lub jednoniciowy, zmodyfikowany oligonukleotyd zawierający LNA komplementarny do nici DNA typu dzikiego próbki, który wiąże się specyficznie z nicią komplementarną. Wiązanie LNA blokuje aktywność polimerazy DNA i hamuje wydłużanie matrycowego DNA typu dzikiego.

Aby przeprowadzić WTB-PCR, należy pobrać mieszankę wzorcową zawierającą dNTP, LNA oraz specyficzne dla celu startery do przodu i do tyłu w wodzie destylowanej bez nukleaz.

Dodaj termostabilny roztwór zawierający polimerazę DNA do probówki i odpipetuj mieszaninę do dołka na płytce PCR. Dodaj próbkę genomowego DNA zawierającą DNA typu dzikiego i zmutowanego do studzienki i rozpocznij PCR.

Podczas PCR denaturacja za pośrednictwem wysokiej temperatury oddziela dwuniciowe DNA. Oddzielone nici działają jak szablony dla starterów do wyżarzania, podczas gdy LNA wiąże się ze swoją komplementarną nicią DNA typu dzikiego i tworzy h