Blokowanie PCR typu dzikiego w celu wykrycia mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości

Reakcja łańcuchowa polimerazy blokującej typu dzikiego lub WTB-PCR wykrywa mutacje punktowe poprzez selektywną amplifikację zmutowanych alleli o niskiej liczebności, jednocześnie hamując amplifikację alleli typu dzikiego o wysokiej liczebności w próbkach DNA.

WTB-PCR wykorzystuje zablokowane kwasy nukleinowe lub jednoniciowy, zmodyfikowany oligonukleotyd zawierający LNA komplementarny do nici DNA typu dzikiego próbki, który wiąże się specyficznie z nicią komplementarną. Wiązanie LNA blokuje aktywność polimerazy DNA i hamuje wydłużanie matrycowego DNA typu dzikiego.

Aby przeprowadzić WTB-PCR, należy pobrać mieszankę wzorcową zawierającą dNTP, LNA oraz specyficzne dla celu startery do przodu i do tyłu w wodzie destylowanej bez nukleaz.

Dodaj termostabilny roztwór zawierający polimerazę DNA do probówki i odpipetuj mieszaninę do dołka na płytce PCR. Dodaj próbkę genomowego DNA zawierającą DNA typu dzikiego i zmutowanego do studzienki i rozpocznij PCR.

Podczas PCR denaturacja za pośrednictwem wysokiej temperatury oddziela dwuniciowe DNA. Oddzielone nici działają jak szablony dla starterów do wyżarzania, podczas gdy LNA wiąże się ze swoją komplementarną nicią DNA typu dzikiego i tworzy hybrydę DNA typu blokerowego i dzikiego. W wyższej temperaturze polimeraza DNA dodaje dNTP i wydłuża matryce starter-DNA.

Wyższa temperatura topnienia hybrydy LNA-DNA niż kompleksu DNA-DNA utrzymuje ją w stanie nienaruszonym. Modyfikacja LNA ostatecznie blokuje polimerazę DNA przed rozszerzeniem hybrydy LNA-DNA, co hamuje jej wydłużanie.

W ciągu kilku cykli PCR blokowanie za pośrednictwem LNA zwiększa liczbę amplikonów typu zmutowanego w stosunku do wariantu typu dzikiego w próbce, pomagając w ich selektywnym wykrywaniu.

Startery do przodu i do tyłu zostały zaprojektowane z sekwencją 5'-M13, aby umożliwić wyżarzanie uzupełniających starterów sekwencjonowania. Zaprojektuj oligonukleotyd blokujący tak, aby miał około 10 do 15 zasad długości i był komplementarny z matrycą typu dzikiego, w której pożądane jest wzbogacenie mutantów.

Krótszy oligo poprawi dyskryminację w niedopasowaniu. Aby osiągnąć wysoką swoistość docelową, ważne jest, aby nie używać zbyt dużej ilości nukleotydów blokujących, ponieważ spowoduje to bardzo "lepki" oligonukleotyd.

Aby zaprojektować oligonukleotyd blokujący, zacznij od przejścia do strony internetowej Oligo Tools. Wybierz narzędzie "Oligo T_M Prediction". Otworzy się nowe okno. Wklej sekwencję szablonu typu dzikiego, który ma zostać zablokowany, w polu "Sekwencja oligo". Dodaj znak plus przed podstawami blokującymi, aby je oznaczyć. Kliknij przycisk "Oblicz", aby określić przybliżone T_M hybrydy blokującej DNA. Obliczone temperatury topnienia pojawią się w poniższych polach.

Zaprojektuj oligo blokującego tak, aby miał temperaturę topnienia od 10 do 15 stopni Celsjusza wyższą od temperatury rozciągania podczas termocyklingu. Tutaj temperatura przedłużenia wynosi 72 stopnie Celsjusza. Aby dostosować temperaturę topnienia, dodaj, usuń lub zastąp zasady blokujące. Unikaj długich odcinków od trzech do czterech blokujących podstawy C lub G.

Następnie, aby uniknąć tworzenia się struktury drugorzędowej lub samoomeryzacji, wróć do ekranu głównego witryny Oligo Tools i wybierz narzędzie "Optymalizator Oligo". Otworzy się nowe okno. Wklej sekwencję szablonu typu dzikiego, który ma zostać zablokowany, w polu. Dodaj znak plus, aby wskazać bazy blokujące. Zaznacz dwa pola "Struktura drugorzędna" i "Tylko ja" i naciśnij przycisk "Analizuj", aby zobaczyć wyniki hybrydyzacji i struktury drugorzędnej.

Wyniki te reprezentują bardzo przybliżone szacunki temperatur topnienia odpowiednio samo-dimerów i struktur drugorzędowych. Niższe wyniki są optymalne i można je osiągnąć, ograniczając parowanie bloker-bloker. Usuń lub zmień położenie nukleotydów blokujących, aby osiągnąć niższe wyniki. Zoptymalizowany oligonukleotyd blokujący dla MyD88, pokazany tutaj, zapewnia równowagę między temperaturą topnienia hybrydy blokującej DNA a wystarczająco niskimi wynikami hybrydyzacji i struktury drugorzędowej.

Został zaprojektowany, aby pokryć aminokwasy od Q262 do I266 i zawiera odwrócony 3' dT, który hamuje zarówno wydłużanie przez polimerazę DNA, jak i degradację przez 3'-egzonukleazę. Po zaprojektowaniu starterów należy skonfigurować PCR blokujący typu dzikiego i przeprowadzić termocykling, jak opisano w dokumencie towarzyszącym.