PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem Sangera w celu wykrycia mutacji somatycznej o niskiej częstotliwości

Jesteśmy zainteresowani zrozumieniem mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości w tkankach nowotworowych. W artykule przedstawiono zastosowanie metody wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości opartej na naszym sekwencjonowaniu Sangera w teście chłoniaka angioimmunoblastycznego, stanowiąc podstawę do zastosowania tej metody w innych testach chorobowych. Obecnie istnieją metody wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości, takie jak ilościowy PCR, cyfrowy PCR i NGS.

Ale nie ma raportu na temat wykrywania mutacji IGHV7-3 o niskiej częstotliwości na podstawie sekwencjonowania Sangera, którego granica wykrywalności wynosi tylko 5% do 20%Ogólnie rzecz biorąc, ze względu na ograniczenia techniczne, detekcja niskiej częstotliwości oparta na sekwencjonowaniu Sangera nie może być dokładnie określona ilościowo. Nasza technika oferuje wysoką czułość, niski koszt i dużą elastyczność, co czyni ją idealnym wyborem do wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości. Planujemy zaprojektować startery pseudogenowe, a także multipleksowe startery GCR, aby zbadać ich zastosowanie w chorobach krwi.

Na początek przygotuj wszystkie odczynniki potrzebne do przygotowania próbki tkanki i ekstrakcji DNA. Dodaj 500 mikrolitrów buforu parafinowego i 20 mikrolitrów roztworu proteinazy K do około 30 miligramów tkanki w probówce do mikrowirówki. Obracaj probówkę mikrowirówki przez co najmniej 10 sekund i umieść ją w suchym termostacie ustawionym na 55 stopni Celsjusza na 90 minut.

Po inkubacji przenieść próbkę, w tym ciecz i tkankę, do kolumny wirowej, która jest umieszczona w probówce filtracyjnej. Wirować przy 16 500 g przez pięć minut, aby oddzielić ciecz do rurki filtracyjnej. Następnie przenieś ciecz z rurki filtracyjnej do oznakowanej probówki z próbką i wykonaj ekstrakcję DNA zgodnie z instrukcjami producenta.

Zmierz stężenie i czystość wyekstrahowanego DNA. Aby rozpocząć, wyekstrahuj DNA z próbek tkanek zatopionych w parafinie utrwalonym w formalinie. Następnie odwirować suchy proszek startera w ilości 5 400 do 8 400 g przez dwie do trzech minut i dodać odpowiednią ilość podwójnie destylowanej wody wzdłuż ścianki probówki startera.

Dodaj po pięć mikrolitrów startera do przodu i do tyłu do 50 mikrolitrów podkładu typu dzikiego i 40 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody. Po wymieszaniu dwa do trzech razy zwiruj probówkę i krótko ją odwiruj. W przypadku reakcji łańcuchowej polimerazy lub procedury PCR dodaj wymagane odczynniki do każdej probówki reakcyjnej.

Wirować do mieszania i krótkiego odwirowania. Umieść probówkę do PCR w przyrządzie do PCR w celu amplifikacji. Ustaw program cyklu termicznego i uruchom go.

Następnie wykonaj elektroforezę żelową na produkcie PCR przy użyciu 2% agarozy, aby sprawdzić, czy docelowy fragment jest amplifikowany. W celu oczyszczenia produktów PCR należy na krótko odwirować oczyszczacz I i oczyszczacz II, które zostały doprowadzone do temperatury pokojowej i przygotować mieszaninę reakcyjną oczyszczania. Umieść probówkę do PCR w przyrządzie do PCR i uruchom maszynę z ustawionymi parametrami.

Aby rozpocząć, wykonaj reakcję łańcuchową polimerazy lub PCR, aby amplifikować żądany region wyekstrahowanego tkankowo DNA. Doprowadź główną mieszankę enzymu do amplifikacji sekwencjonowania, bufor i podwójnie destylowaną wodę do temperatury pokojowej i natychmiast odwiruj. Po przygotowaniu probówek do sekwencjonowania umieść probówkę do PCR na wstępnie ustawionym przyrządzie do PCR w celu amplifikacji.

Następnie należy wyjąć produkt z przyrządu do PCR i przechowywać produkty reakcji w lodówce chronionej przed światłem. Dokładnie wymieszaj koraliki magnetyczne. Dodaj 10 mikrolitrów kulek magnetycznych i 40 mikrolitrów 80% etanolu do płytki 96-dołkowej i uszczelnij płytkę folią.

Umieść 96-dołkową płytkę na wytrząsarce wirowej na 10 sekund, aby całkowicie zawiesić i wymieszać kulki. Następnie zabezpiecz płytkę gumką recepturką na oscylatorze poziomym i wibruj maksymalnym ustawieniem przez trzy do pięciu minut. Następnie umieść płytkę PCR na stojaku magnetycznym, upewniając się, że jest mocno dociśnięta.

Trzymaj podstawkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty w celu adsorpcji statycznej. Po zaadsorbowaniu kulek usuń folię sufitową i wylej płyn odpadowy. Dwukrotnie opłucz kulki 40 mikrolitrami 80% etanolu.

Po wylaniu odpadowego płynu umieść talerz na chłonnym papierze i delikatnie osusz go. Umieść papier chłonny z płytką magnetyczną w wirówce i krótko wiruj z prędkością 120 g. Po wyjęciu alkoholu wstaw talerz do piekarnika w temperaturze 60 stopni Celsjusza na trzy do pięciu minut, aby całkowicie wyschły koraliki.

Następnie dodaj 40 mikrolitrów czystej wody do płytki i zamknij ją folią. Potrząśnij nim na wytrząsarce wirowej przez trzy do pięciu sekund i umieść płytkę na poziomym wytrząsarce. Zabezpiecz ją i pozwól płytce trząść się przez trzy do pięciu minut, aby rozpuścić oczyszczony produkt do sekwencjonowania.

Na koniec odwirować rozpuszczony produkt sekwencjonowania o masie 180 g i użyć produktu do analizy genomowej za pomocą elektroforezy kapilarnej. Metoda ta może wykryć znaną mutację RHOA G17V i inne mutacje o niskiej częstotliwości w przedziale amplifikacji starterów przed i za nim. Mutacje w dwóch dodatkowych genach, a mianowicie IDH2 i JAK1, również zostały poprawnie przeanalizowane przy użyciu tej metody.