Co to jest interferencja biowarstwowa?

Interferencja biowarstwowa to technika służąca do pomiaru interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym bez potrzeby używania etykiet.

Jak działa biosensor?

Biosensor wykrywa zmiany wzorców interferencji światła wywołane zdarzeniami wiązania na powierzchni czujnika.

Czym są tagi histydynowe?

Tagi histydynowe to krótkie sekwencje peptydów, które mogą wiążą się z jonami niklu, umożliwiając unieruchomienie białek na biosensorach.

Jaka jest znaczność przesunięć długości fali?

Przesunięcia długości fali wskazują na zmiany grubości optycznej spowodowane wiązaniem molekularnym, dostarczając ilościowych danych na temat interakcji.

Czy tę metodę można zastosować dla różnych rodzajów ligandów?

Tak, protokół można dostosować dla różnych ligandów i analityków, czyniąc go wszechstronnym dla różnych zastosowań badawczych.

Technologia interferometrii biowarstw do wykrywania interakcji między ligandem a analitem

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

0 views • 5:13 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wykryć interakcje ligand-analit za pomocą interferometrii biowarstwowej, BLI, należy rozpocząć od uwodnionego bioczujnika światłowodowego przymocowanego do uchwytu przyrządu BLI, ustawionego na żądany program.

Końcówka biosensora jest pokryta biokompatybilną warstwą unieruchomioną grupami kwasu niklowo-nitrylotryoctowego, Ni-NTA. Zanurz końcówkę biosensora w buforze.

Przyrząd emituje białe światło w kierunku bioczujnika, które odbija się od dwóch interfejsów: wewnętrznej warstwy referencyjnej lub optycznej oraz warstwy biokompatybilnej. Odbite wiązki interferują konstruktywnie lub destrukcyjnie przy różnych długościach fal świetlnych. Fotodetektor wykrywa powstały wzór interferencyjny

Po wyjściowym pomiarze odpowiedzi interferometrycznej dodaj roztwór liganda znakowany histydyną. Znaczniki histydyny wiążą się z kationami niklu na biosensorze, unieruchamiając ligandy na końcówce.

W wyniku asocjacji emitowane białe światło odbija się od warstwy optycznej, a warstwa biokompatybilna zostaje unieruchomiona ligandami o zwiększonej grubości optycznej na końcówce. Zwiększa to odległość między warstwami odbijającymi, powodując przesunięcie wzoru interferencyjnego i przesunięcie długości fali.

Umyj końcówkę, usuwając niezwiązane ligandy. Inkubować z docelowym roztworem analitu. Analit wiąże się z ligandem, dodatkowo zwiększając grubość optyczną na końcówce, powodując zwiększone przesunięcie długości fali.

Umieść końcówkę biosensora w buforze. Zarejestruj przesunięcie długości fali podczas dysocjacji analitu od liganda unieruchomionego na końcówce.

Monitorowanie zmian przesunięcia długości fali w czasie ułatwia badanie interakcji molekularnych między ligandami i analitami.

Włącz maszynę BLItz. Upewnij się, że urządzenie jest podłączone do komputera przez port wyjściowy USB z tyłu urządzenia.

Na komputerze otwórz powiązane oprogramowanie i kliknij "Zaawansowana kinetyka" po lewej stronie ekranu. W oprogramowaniu wpisz wszystkie odpowiednie informacje o eksperymencie pod każdym odpowiednim nagłówkiem. Kliknij "Typ bioczujnika" i wybierz "Ni-NTA" z menu rozwijanego. Czas trwania każdego kroku można w razie potrzeby zmienić z domyślnego. Aby uzyskać optymalne wyniki, użyj co najmniej 30 sekund na początkową linię bazową i linię bazową oraz 120 sekund na asocjację i dysocjację.

Wyjmij uwodniony bioczujnik niklowo-NTA z probówki do PCR i przymocuj go do uchwytu biosensora na maszynie, wsuwając szeroką część biosensora na uchwyt.

Umieść czarną probówkę do mikrowirówki o pojemności 0,5 mililitra w uchwycie probówki urządzenia i wlej do niej pipety 400 mikrolitrów buforu BLI. Zamknij pokrywę maszyny tak, aby końcówka biosensora zanurzyła się w buforze w probówce mikrowirówki. Kliknij "Dalej" w oprogramowaniu, aby rozpocząć nagrywanie początkowej linii bazowej.

Po zakończeniu nagrywania początkowego kroku planu bazowego otwórz pokrywę urządzenia. Przesuń suwak w prawo. Odpipetować 4 mikrolitry dializowanego liganda oznaczonego przez Hisa na uchwyt kropli i zamknąć pokrywę urządzenia, które automatycznie rozpocznie rejestrowanie kroku ładowania.

Po zakończeniu nagrywania na etapie ładowania otwórz pokrywę urządzenia. Przesuń suwak w lewo tak, aby uchwyt rurki ponownie znalazł się przed czarną strzałką. Zamknij pokrywę urządzenia i upewnij się, że końcówka biosensora jest zanurzona w buforze BLI rurki w uchwycie probówki. Urządzenie i oprogramowanie automatycznie rozpoczną rejestrowanie kroku linii bazowej.

Po zakończeniu nagrywania kroku planu bazowego otwórz pokrywę urządzenia. Wyjmij uchwyt na krople i wyczyść go, odpipetowując białko i spłukując go wodą podwójnie dejonizowaną, w sumie pięć razy. Użyj chusteczki higienicznej, aby wyczyścić powierzchnię uchwytu na krople po ostatnim praniu. Załóż uchwyt kropli z powrotem na maszynę. Przesuń suwak na maszynie w prawo, tak aby uchwyt kropli ponownie znalazł się przed czarną strzałką.

Odpipetować 4 mikrolitry dializowanego analitu na uchwyt kropli i zamknąć pokrywę urządzenia, które automatycznie rozpocznie rejestrowanie kroku asocjacji. Po zakończeniu nagrywania na etapie kojarzenia otwórz pokrywę urządzenia. Przesuń suwak na maszynie w prawo, tak aby uchwyt rurki ponownie znalazł się przed czarną strzałką i zamknij pokrywę maszyny, co automatycznie rozpocznie rejestrowanie kroku dysocjacji.