Name: Zastosowanie interferometrii biowarstwowej (BLI) do badania interakcji białko-białko w transkrypcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj interferometrię biowarstwową (BLI) do badania interakcji białko-białko w transkrypcji. Ta metoda umożliwia analizę kinetyki wiązania GrgA z polimerazą RNA w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (Granty # AI122034 i AI140167) oraz New Jersey Health Foundation (Grant # PC 20-18).

1. Przygotowanie białek
<ol>
	<li>Za pomocą worka dializacyjnego (o odpowiednim rozmiarze odcięcia) należy dializować każde białko, które ma być użyte do testów BLI (w tym zarówno ligand znakowany Hisem, jak i analit) w stosunku do 1000 objętości buforu BLI (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2, 0,1 mM DTT, pH 8,0, wstępnie schłodzone do 4 °C) w temperaturze 4 °C przez 4 godziny 
	UWAGA: Testy BLI wymagają, aby ligand był obecny w stężeniach, które nasycają miejsca wiązania na bioczujniku, a analit musi być wysoce oczyszczony, aby znane były stężenia molowe analitu, który reaguje z ligandem. Metodologie ekspresji i oczyszczania białek znakowanych His- i Strep-tagiem nie są tutaj omówione, ale można je znaleźć w poprzednich publikacjach14,15. Chociaż system ten nie wymaga, aby ligand był w postaci wysoce oczyszczonej, konieczne jest dializowanie nawet nieoczyszczonych ligandów do buforu BLI w celu zminimalizowania zmian we wzorcach interferencji światła białego spowodowanych jakimikolwiek zmianami buforu podczas testu.</li>
	<li>Zmienić na świeży bufor BLI i kontynuować dializę przez kolejne 4 godziny.</li>
</ol>
2. Konfiguracja hydratacji i testu biosensora
<ol>
	<li>Około 10 minut przed rozpoczęciem testu należy pobrać pipetę z 200 μl buforu BLI do probówki PCR.</li>
	<li>Wyjmij bioczujnik Ni-NTA z oryginalnego opakowania, przytrzymując szeroką część biosensora ręką w rękawiczce.</li>
	<li>Umieścić bioczujnik nad probówką do PCR w taki sposób, aby tylko szklana końcówka biosensora była zanurzona w buforze BLI.</li>
	<li>Trzymaj końcówkę biosensora zanurzoną przez co najmniej 10 minut, aby zapewnić pełne nawodnienie.
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy szklana końcówka biosensora Ni-NTA nie dotyka niczego innego niż bufor BLI podczas powyższego kroku. 
		UWAGA: Ten protokół wykorzystuje bioczujnik Ni-NTA w połączeniu z ligandem oznaczonym His. W razie potrzeby bioczujnik SA-streptawidyny może być używany w połączeniu z biotynylowanym ligandem, jeśli: (i) zarówno ligand, jak i analit mają znacznik His lub (ii) żaden z nich go nie posiada.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz maszynę BLItz.</li>
	<li>Upewnij się, że urządzenie jest podłączone do komputera przez port wyjściowy USB z tyłu urządzenia.</li>
	<li>Na komputerze otwórz powiązane oprogramowanie (np. BLItz Pro) i kliknij Advanced Kinetics po lewej stronie ekranu.</li>
	<li>W oprogramowaniu wpisz wszystkie odpowiednie informacje o eksperymencie (w tym nazwę eksperymentu, opis, identyfikator próbki i stężenie białka) pod każdym odpowiednim nagłówkiem.</li>
	<li>Kliknij Typ bioczujnika i wybierz Ni-NTA z menu rozwijanego.
	<ol>
		<li>Pod nagłówkiem Ustawienia uruchamiania sprawdź, czy wytrząsarka jest ustawiona na wartość Włącz.</li>
		<li>Pod nagłówkiem Lista typów kroków sprawdź, czy na liście znajduje się 5 elementów: Początkowy plan bazowy, Ładowanie, Plan bazowy, Skojarzenie i Dysocjacja. 
		UWAGA: Czas trwania każdego kroku można w razie potrzeby zmienić z domyślnego. Aby uzyskać optymalne wyniki, użyj co najmniej 30 s dla początkowej linii bazowej i linii bazowej; i 120 s dla asocjacji i dysocjacji. Czas trwania etapu ładowania (w zakresie od 120 do 240 s) będzie zależał od stężenia liganda i powinowactwa znacznika epitopu Hisa na ligandzie do biosensora Ni-NTA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij uwodniony bioczujnik Ni-NTA z probówki do PCR i przymocuj go do uchwytu biosensora na maszynie, wsuwając szeroką część biosensora na uchwyt. 
	UWAGA: Nie pozwól, aby bioczujnik wyschł podczas eksperymentu.</li>
	<li>Umieść czarną probówkę do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml w uchwycie probówki urządzenia i odpipetuj do niej 400 μl buforu BLI.</li>
	<li>Sprawdź, czy suwak maszyny jest ustawiony w taki sposób, aby uchwyt rurki znajdował się przed czarną strzałką na maszynie.</li>
	<li>Zamknij pokrywę maszyny tak, aby końcówka biosensora zanurzyła się w buforze w probówce mikrowirówki.</li>
	<li>Kliknij przycisk Dalej w oprogramowaniu, aby rozpocząć nagrywanie początkowej linii bazowej.</li>
</ol>
3. Ładowanie liganda do biosensora
<ol>
	<li>Po zakończeniu nagrywania kroku Początkowa linia bazowa otwórz pokrywę urządzenia.</li>
	<li>Przesuń suwak w prawo tak, aby uchwyt kropli (zamiast uchwytu probówki) znajdował się przed czarną strzałką.</li>
	<li>Odpipetować 4 μl dializowanego liganda znakowanego Hisem (z kroku 1.1) na uchwyt kropli i zamknąć pokrywę urządzenia. 
	UWAGA: Optymalne stężenie liganda, który ma być użyty, może się różnić dla każdego białka. Stężenie od 1,0 do 2,0 mg/ml jest zwykle wystarczające do nasycenia NTA na końcówce biosensora w ciągu 240 s.</li>
	<li>W oprogramowaniu kliknij przycisk Dalej, aby rozpocząć ładowanie.</li>
</ol>
4. Wymywanie dodatkowego ligandu
<ol>
	<li>Po zakończeniu nagrywania w kroku ładowania otwórz pokrywę urządzenia.</li>
	<li>Przesuń suwak w lewo tak, aby uchwyt rurki ponownie znalazł się przed czarną strzałką.</li>
	<li>Zamknij pokrywę urządzenia i upewnij się, że końcówka biosensora jest zanurzona w buforze BLI rurki w uchwycie probówki.</li>
	<li>Kliknij ponownie przycisk Dalej w oprogramowaniu, aby rozpocząć nagrywanie linii bazowej.</li>
</ol>
5. Związek analitu z ligandem
<ol>
	<li>Po zakończeniu nagrywania kroku Linia bazowa otwórz pokrywę urządzenia.</li>
	<li>Wyjmij uchwyt na krople i wyczyść go, odpipetowując białka i spłukując wodą podwójnie dejonizowaną (ddH2O) w sumie 5 razy.
	<ol>
		<li>Użyj chusteczki higienicznej, aby wyczyścić powierzchnię uchwytu na krople po umyciu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załóż uchwyt kropli z powrotem na maszynę.</li>
	<li>Przesuń suwak na maszynie w prawo, tak aby uchwyt kropli ponownie znalazł się przed czarną strzałką.</li>
	<li>Pobrać pipetą 4 μl dializowanego analitu (z kroku 1.1) na uchwyt kropli i zamknąć pokrywę urządzenia.</li>
	<li>W oprogramowaniu kliknij przycisk Dalej, aby rozpocząć asocjację.</li>
</ol>
6. Dysocjacja analitu od liganda
<ol>
	<li>Po zakończeniu nagrywania w kroku Skojarzenie otwórz pokrywę urządzenia.</li>
	<li>Przesuń suwak na maszynie w prawo, tak aby uchwyt rurki ponownie znalazł się przed czarną strzałką.</li>
	<li>W oprogramowaniu kliknij przycisk Dalej, aby rozpocząć dysocjację.</li>
	<li>Po zakończeniu nagrywania w kroku Dysocjacja otwórz pokrywę urządzenia.</li>
	<li>Wyjmij uchwyt kropli i uchwyt probówki.</li>
	<li>Dokładnie spłucz oba ddH2O, aby zmyć wszelkie białka.</li>
	<li>Wyjmij bioczujnik i wyrzuć go w bezpieczny sposób.</li>
</ol>
7. Powtarzające się interakcje z różnymi stężeniami
<ol>
	<li>Powtórz kroki 2-7 dla tej samej pary ligand-analit, używając różnych stężeń analitu. 
	UWAGA: Stężenie analitu może wymagać dostosowania w kilku seriach przed uzyskaniem optymalnych wyników. Z naszego doświadczenia wynika, że stosunek stężeń analitu 1:5:10, zaczynający się od 75 nM, jest zwykle odpowiedni.</li>
</ol>
8. Analiza danych za pomocą oprogramowania
<ol>
	<li>Po zakończeniu wszystkich przebiegów zapisz dane w oprogramowaniu, klikając filet, a następnie Save experiment as po lewej stronie ekranu.</li>
	<li>Pod nagłówkiem Run Data (Uruchom dane) wybierz opcję Step Correction and Fitting (Korekcja krokowa i dopasowanie) (1:1) i kliknij przycisk Analizuj, aby wygenerować dane kinetyczne</li>.
	<li>Aby wyodrębnić dane ilościowe do arkusza roboczego i wygenerować wykresy, kliknij Eksportuj do CSV i zapisz zarejestrowane dane jako plik .csv. Otwórz plik .csv za pomocą arkusza kalkulacyjnego.
	<ol>
		<li>Aby najskuteczniej pokazać kinetykę asocjacji i dysocjacji, usuń wszystkie punkty wykresu przed krokiem linii bazowej i znormalizuj wszystkie kolejne punkty wykresu od końcowej wartości linii bazowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vvedenskaya, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+RNA+polymerase+and+the+core+recognition+element+are+a+determinant+of+transcription+start+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).</li>
<li>Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+sigma+factors%3A+a+historical%2C+structural%2C+and+genomic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).</li>
<li>Visweswariah, S. S., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+bacterial+transcription+factors%3A+how+proteins+take+on+new+tasks%2C+but+do+not+always+stop+doing+the+old+ones%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones.</a> Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).</li>
<li>Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trachoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Trachoma.</a> Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+incidence+and+prevalence+of+selected+curable+sexually+transmitted+infections%3A+2008%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+and+Reproductive+Health+Matters%22%5BJournal%5D)">Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008.</a> Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).</li>
<li>Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+rate+of+persistence+and+respiratory+tract+symptoms+of+Chlamydia+pneumoniae+infection+in+1211+kindergarten+and+school+age+children%5BTitle%5D)+AND+%22The+Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children.</a> The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).</li>
<li>De Puysseleyr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+presence+and+zoonotic+transmission+of+Chlamydia+suis+in+a+pig+slaughterhouse%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).</li>
<li>Hulin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+preference+and+zoonotic+potential+of+Chlamydia+psittaci+and+C.+gallinacea+in+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry.</a> Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+of+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chlamydia.</a> Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).</li>
<li>Belland, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+transcriptional+profiling+of+the+developmental+cycle+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).</li>
<li>Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+stage-specific+gene+regulation+during+the+developmental+cycle+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).</li>
<li>Tan, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTan%2C+M+%22Intracellular+pathogens+I%3A+Chlamydiales%22">Intracellular pathogens I: Chlamydiales</a>. Tan, M., Bavoil , P. M. , ASM Press. 149-169 (2012).</li>
<li>Domman, D., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+Footsteps+of+Chlamydial+Gene+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).</li>
<li>Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+protein+GrgA+activates+transcription+by+contacting+the+nonconserved+region+of+%CF%8366%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).</li>
<li>Desai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+GrgA+in+regulation+of+%CF%8328-dependent+transcription+in+the+obligate+intracellular+bacterial+pathogen+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).</li>
<li>Joy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Detection+of+Biomolecular+Interactions+Using+BioLayer+Interferometry+for+Kinetic+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).</li>
<li>Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+and+its+use+in+biomolecular+interaction+analysis+%28BIA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA).</a> Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).</li>
<li>Nelson, R. W., Krone, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+surface+plasmon+resonance+biomolecular+interaction+analysis+mass+spectrometry+%28BIA%2FMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS).</a> Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).</li>
<li>Visentin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+non-specific+binding+to+measure+the+active+concentration+and+kinetics+of+serum+anti-HLA+antibodies+by+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance.</a> Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).</li>
<li>Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+surface+plasmon+resonance+and+waveguide-enhanced+glucose+biosensing+with+N-alkylaminated+polypyrrole%2Fglucose+oxidase+multilayers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).</li>
<li>Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Surface+Plasmon+Resonance+to+Quantitatively+Assess+Lipid-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).</li>
<li>Wang, D. S., Fan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Surface+Plasmon+Resonance+Sensors%3A+From+Principles+to+Point-of-Care+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications.</a> Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175(2016).</li>
<li>Shah, N. B., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-layer+interferometry+for+measuring+kinetics+of+protein-protein+interactions+and+allosteric+ligand+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383(2014).</li>
<li>Wartchow, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computer-Aided+Molecular+Design%22%5BJournal%5D)">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Interakcje białko-białko mają kluczowe znaczenie dla regulacji transkrypcji i innych procesów biologicznych. Są one najczęściej badane za pomocą testów pulldown. Chociaż testy pulldown są stosunkowo łatwe do przeprowadzenia, są słabo ilościowe i mogą nie wykrywać słabych, ale biologicznie znaczących interakcji. Dla porównania, wykrywając asocjację i dysocjację w czasie rzeczywistym między ligandem a analitem, BLI zapewnia stałe szybkości asocjacji i dysocjacji, a także ogólne powinowactwo.
W p...

Transkrypcja, która wytwarza cząsteczki RNA przy użyciu DNA jako szablonu, jest pierwszym krokiem ekspresji genów. Synteza bakteryjnego RNA rozpoczyna się po związaniu holoenzymu polimerazy RNA (RNAP) z docelowym promotorem1,2. Holoenzym RNAP (RNAPholo) składa się z wielopodjednostkowego rdzenia katalitycznego (RNAPcore) i czynnika σ, który jest wymagany do rozpoznania sekwencji promotora. Aktywatory i represory transkrypcji, zbiorczo nazywane TF, regulują ekspresję genów poprzez składniki wiążące RNAPcore, czynniki σ i/lub DNA. W zależności od organizmu, znaczna część jego genomu może być poświęcona TF, które regulują transkrypcję w odpowiedzi na potrzeby fizjologiczne i sygnały środowiskowe3.
Chlamydia jest nieodzowną bakterią wewnątrzkomórkową odpowiedzialną za różne choroby u ludzi i zwierząt4,5,6,7,8. Na przykład Chlamydia trachomatis jest prawdopodobnie najczęściej przenoszonym patogenem przenoszonym drogą płciową u ludzi na całym świecie i główną przyczyną ślepoty w niektórych krajach słabo rozwiniętych4,5. Chlamydia ma unikalny cykl rozwojowy charakteryzujący się dwiema naprzemiennymi formami komórkowymi zwanymi ciałem elementarnym (EB) i ciałem siatkowym (RB) 9. Podczas gdy EB są zdolne do przetrwania w środowisku zewnątrzkomórkowym, nie są zdolne do proliferacji. EB dostają się do komórek gospodarza przez endocytozę i różnicują się w większe RB w wakuoli w cytoplazmie gospodarza w ciągu kilku godzin po inokulacji. RB nie są już zakaźne, ale rozprzestrzeniają się poprzez rozszczepienie binarne. Około 20 godzin zaczynają różnicować się z powrotem do EB, które opuszczają komórki gospodarza około 30-70 godzin.
Postęp cyklu rozwojowego chlamydii jest regulowany przez transkrypcję. Podczas gdy zdecydowana większość z prawie 1000 genów chlamydiów ulega ekspresji w połowie cyklu, podczas którego RB aktywnie się replikują, tylko niewielka liczba genów jest transkrybowana natychmiast po wprowadzeniu EB do komórek gospodarza, aby zainicjować konwersję EB do RB, a kolejny mały zestaw genów jest transkrybowany lub coraz częściej transkrybowany, aby umożliwić różnicowanie RB w EBs10, 11.
Genom chlamydii koduje trzy czynniki σ, a mianowicie σ66, σ28 i σ54. σ66, co jest równoznaczne z porządkowaniemσ 70 E. coli i innych bakterii, jest odpowiedzialne za rozpoznawanie promotorów genów wczesnego i średniego cyklu, a także niektórych późnych genów, podczas gdy σ28 i σ54 są wymagane do transkrypcji niektórych późnych genów. Wiadomo, że kilka genów zawiera zarówno promotor zależny od σ66, jak i promotor zależny odσ 2812.
Pomimo skomplikowanego cyklu rozwojowego, tylko niewielka liczba TF została znaleziona u chlamydiae13. GrgA (wcześniej opisywane jako hipotetyczne białko CT504 w C. trachomatis serowar D i CTL0766 w C. trachomatis L2) jest TF specyficznym dla Chlamydii, początkowo rozpoznanym jako aktywator σ genów zależnych od6614. Testy powinowactwa wykazały, że GrgA aktywuje ich transkrypcję poprzez wiązanie zarówno σ66, jak i DNA. Co ciekawe, później odkryto, że GrgA również współprecypituje z σ28 i aktywuje transkrypcję z σ28 zależnych od promotorów in vitro15. Aby zbadać, czy GrgA ma podobne, czy różne powinowactwa do σ66 i σ28, uciekliśmy się do użycia BLI. Testy BLI wykazały, że GrgA oddziałuje z σ66 z 30-krotnie większym powinowactwem niż z σ28, co sugeruje, że GrgA może odgrywać różne role w transkrypcji zależnej odσ 66 i transkrypcji zależnej odσ 2815.
BLI wykrywa wzór interferencyjny białego światła, które odbija się od warstwy unieruchomionego białka na końcówce biosensora i porównuje go z wewnętrznym wzorcem warstwy odniesienia16. Dzięki analizie tych dwóch wzorców interferencji, BLI może dostarczyć cennych informacji w czasie rzeczywistym na temat ilości białka związanego z końcówką bioczujnika. Białko, które jest unieruchomione na końcówce bioczujnika, jest określane jako ligand i jest zwykle unieruchamiane za pomocą wspólnego znacznika przeciwciała lub epitopu (np. znacznika poli-His- lub biotyny), który ma powinowactwo do powiązanej cząstki (takiej jak NTA lub streptawidyna) na końcówce bioczujnika. Wiązanie białka wtórnego, zwanego analitem, z ligandem na końcu biosensora powoduje zmiany w nieprzezroczystości biosensora, a tym samym powoduje zmiany we wzorcach interferencyjnych. Po powtórzeniu dla różnych stężeń analitu, BLI może dostarczyć nie tylko jakościowych, ale także ilościowych informacji o powinowactwie między ligandem a analitem16.
Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jako pierwsi zastosowaliśmy BLI do scharakteryzowania interakcji białko-białko w transkrypcji15. W tej publikacji pokazujemy, że fragment GrgA, który wcześniej okazał się wymagany do wiązaniaσ 28, rzeczywiście pośredniczy w wiązaniu. Niniejszy manuskrypt koncentruje się na etapach testów BLI oraz generowaniu wykresów BLI i parametrów kinetyki wiązania. Metody produkcji (i oczyszczania) ligandów i analitów nie są tutaj uwzględnione.

<table><tbody><tr><td>Maszyna BLItz</td><td>ForteBio</td><td>45-5000</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do dializy membrana celulozowa</td><td>MilliporeSigma</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td>Tacka biosensora Ni-NTA do zanurzania i odczytu</td><td>ForteBio</td><td>18-5101</td><td>Gotowe do użycia biosensory Ni-NTA do białek znakowanych poli-Hisem</td></tr><tr><td>Uchwyt na krople</td><td>ForteBio</td><td>45-5004</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do PCR (0,2 ml)</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td></td>CLS6571</tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek (czarne)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-391-166</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki nawilżane</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa telewizja cyfrowa Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MiliporeSigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MiliporeSigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MilliporeSigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GoldBio</td><td>T095100</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie interferometrii biowarstwowej (bli) do badania interakcji białko-białko w transkrypcji

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Czynnik transkrypcyjny (TF) to białko, które reguluje ekspresję genów poprzez interakcję z polimerazą RNA, innym TF i/lub matrycowym DNA. GrgA jest nowym aktywatorem transkrypcji występującym w szczególności w obligatoryjnym wewnątrzkomórkowym patogenie bakteryjnym Chlamydia. Testy ściągania białek przy użyciu kulek powinowactwa ujawniły, że GrgA wiąże dwa czynniki σ, a mianowicie σ66 i σ28, które rozpoznają różne zestawy promotorów genów, których produkty są różnie wymagane na etapach rozwoju. Użyliśmy BLI w celu potwierdzenia i dalszego scharakteryzowania interakcji. BLI wykazuje kilka zalet w porównaniu z pulldown: 1) ujawnia powiązania i dysocjację w czasie rzeczywistym między partnerami wiążącymi, 2) generuje ilościowe parametry kinetyczne oraz 3) może wykrywać wiązania, których testy pulldown często nie wykrywają. Te cechy pozwoliły nam wydedukować fizjologiczne role GrgA w regulacji ekspresji genów u Chlamydii i możliwe szczegółowe mechanizmy interakcji. Przewidujemy, że ta stosunkowo przystępna cenowo technologia może być niezwykle przydatna do badania transkrypcji i innych procesów biologicznych.

Wcześniej, za pomocą analiz BLI, ustaliliśmy, że wiązanie GrgA z σ28 zależy od środkowego regionu GrgA składającego się z 28 aminokwasów (pozycje 138-165)15. W związku z tym, w porównaniu z pełną długością białka GrgA z His-tagiem na N-końcu (NH-GrgA), konstrukt GrgA z delecją tego regionu (NH-GrgAΔ138-165) wykazywał zmniejszoną szybkość asocjacji i zwiększoną szybkość dysocjacji, co doprowadziło do 3-milionokrotnego spadku całkowitego powinowactwa (Tabela 1). W niniejs...

Interakcje czynników transkrypcyjnych (TF) z polimerazą RNA są zwykle badane za pomocą testów pulldown. Stosujemy technologię interferometrii biowarstwowej (BLI) w celu scharakteryzowania oddziaływania GrgA z polimerazą chlamydiowego RNA. W porównaniu z testami pulldown, BLI wykrywa asocjację i dysocjację w czasie rzeczywistym, oferuje wyższą czułość i jest wysoce ilościowy.

Zastosowanie interferometrii biowarstwowej (BLI) do badania interakcji białko-białko w transkrypcji

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Interakcja białko-białko w transkrypcji była tradycyjnie badana za pomocą dializy Por. Jednak dializy Por mają charakter czysto ilościowy. Aby przezwyciężyć ten problem, używamy interferometrii biowarstw (BLI).W porównaniu do Por dan, BLI wykrywa w czasie rzeczywistym powiązania i dysocjacje między partnerami wiążącymi. Generuje również ilościowe parametry kinetyczne, które wskazują na mechanizmy interakcji. Technologia BLI może brzmieć onieśmielająco, ale nie jest trudna do nauczenia Aby korzystać z tej technologii, trzeba mieć dostęp do instrumentu BLI i związanego z nim oprogramowania.Ten film pozwoli Ci łatwo dostosować się do technologii BLI. Około 10 minut przed rozpoczęciem testu należy odpipetować 200 mikrolitrów buforu BLI do probówki PCR. Wyjmij niklowy bioczujnik NTA z oryginalnego opakowania, przytrzymując szeroką część bioczujnika ręką w rękawiczce.Umieścić bioczujnik nad probówką do PCR w taki sposób, aby tylko szklana końcówka biosensora była zanurzona w buforze BLI. Trzymaj końcówkę biosensora zanurzoną przez co najmniej 10 minut, aby zapewnić pełne nawodnienie. Włącz maszynę Blitz.Upewnij się, że urządzenie jest podłączone do komputera przez port wyjściowy USB z tyłu urządzenia. Na komputerze otwórz powiązane oprogramowanie i kliknij Zaawansowana kinetyka po lewej stronie ekranu. W oprogramowaniu wpisz wszystkie odpowiednie informacje o eksperymencie pod każdym odpowiednim nagłówkiem.Kliknij Typ bioczujnika i wybierz Nikiel NTA z menu rozwijanego. Czas trwania każdego kroku można w razie potrzeby zmienić z domyślnego. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy użyć co najmniej 30 sekund na początkową linię bazową i linię bazową oraz 120 sekund na asocjację i dysocjację.Wyjmij uwodniony niklowy bioczujnik NTA z probówki PCR i przymocuj go do uchwytu biosensora na maszynie, wsuwając szeroką część biosensora na uchwyt. Umieść czarną probówkę do mikrowirówki o pojemności 0,5 mililitra w uchwycie probówki urządzenia i wlej do niej pipety 400 mikrolitrów buforu BLI. Zamknij pokrywę maszyny tak, aby końcówka biosensora zanurzyła się w buforze w probówce mikrowirówki.Kliknij przycisk Dalej w oprogramowaniu, aby rozpocząć nagrywanie początkowej linii bazowej. Po zakończeniu nagrywania początkowego kroku planu bazowego otwórz pokrywę urządzenia. Przesuń suwak w prawo, tak aby uchwyt upuszczania znajdował się przed czarną strzałką.Odpipetuj cztery mikrolitry dializowanego liganda oznaczonego przez Hisa na uchwyt kropli i zamknij pokrywę urządzenia, które automatycznie rozpocznie rejestrowanie kroku ładowania. Po zakończeniu nagrywania na etapie ładowania otwórz pokrywę urządzenia. Przesuń suwak w lewo tak, aby uchwyt rurki ponownie znalazł się przed czarną strzałką.Zamknij pokrywę urządzenia i upewnij się, że końcówka biosensora jest zanurzona w buforze BLI rurki w uchwycie probówki. Urządzenie i oprogramowanie automatycznie rozpoczną rejestrowanie kroku linii bazowej. Po zakończeniu nagrywania kroku planu bazowego otwórz pokrywę urządzenia.Wyjmij uchwyt na krople i wyczyść go, odpipetowując białko i spłukując go podwójnie dejonizowaną wodą, w sumie pięć razy. Użyj chusteczki higienicznej, aby wyczyścić powierzchnię uchwytu na krople po ostatnim praniu. Załóż uchwyt kropli z powrotem na maszynę.Przesuń suwak na maszynie w prawo, tak aby uchwyt kropli ponownie znalazł się przed czarną strzałką. Odpipetować cztery mikrolitry dializowanego analitu na uchwyt kropli i zamknąć pokrywę urządzenia, które automatycznie rozpocznie rejestrowanie kroku asocjacji. Po zakończeniu nagrywania na etapie kojarzenia otwórz pokrywę urządzenia.Przesuń suwak na maszynie w prawo, tak aby uchwyt rurki ponownie znalazł się przed czarną strzałką i zamknij pokrywę maszyny, co automatycznie rozpocznie rejestrowanie kroku dysocjacji. Po zakończeniu nagrywania etapu dysocjacji otwórz pokrywę urządzenia i wyjmij uchwyt kropli i uchwyt rurki. Dokładnie spłucz oba podwójnie dejonizowaną wodą, aby zmyć wszelkie białka.Wyjmij bioczujnik i wyrzuć go w bezpieczny sposób. Powtórz te kroki dla tej samej pary analitów ligandowych, używając różnych stężeń analitu. Po zakończeniu wszystkich uruchomień zapisz dane w oprogramowaniu, klikając Plik i Zapisz eksperyment jako po lewej stronie ekranu.Pod nagłówkiem Uruchom dane wybierz opcję Korekcja kroku i dopasowanie jeden do jednego, a następnie kliknij przycisk Analizuj, aby wygenerować dane kinetyczne. Aby wyodrębnić dane ilościowe do arkusza roboczego i wygenerować wykresy, kliknij Eksportuj do CSV i zapisz zarejestrowane dane jako plik CSV. Otwórz plik CSV za pomocą arkusza kalkulacyjnego.Pełna długość GrgA składa się z 288 aminokwasów. Jak pokazano tutaj, środkowy region 28 aminokwasów wiąże Sigma 28 bezpośrednio. W tym przypadku środkowy obszar oznaczony końcowym znacznikiem Hisa został użyty jako ligand, który został najpierw unieruchomiony na końcówce niklowego bioczujnika NTA.Pokazane są zapisy doświadczeń z trzema różnymi stężeniami analitu, z których każde rozpoczyna się 30 sekund przed wiązaniem liganda i kończy dwie minuty po rozpoczęciu ostatniego płukania. Ulepszona wizualizacja asocjacji i dysocjacji analitu liganda jest pokazana po usunięciu wartości w pierwszych dwóch etapach i zresetowaniu linii bazowej. Po wypłukaniu niezwiązanego i końcowego GrgA oznaczonego przez His od 138 do 165 z biosensora, zarejestrowano powiązanie w czasie rzeczywistym z analitem po dodaniu Sigmy 28.Wreszcie, po praniu zarejestrowano dysocjację w czasie rzeczywistym. Przed testami BLI glicerol jest usuwany z ligandów i analitów. Zalecamy, aby BLI wykonać wkrótce po dializie, jak omówiono w tekście.Po scharakteryzowaniu interakcji białko-białko w transkrypcji z BLI można zbadać, w jaki sposób interakcja wpływa na inicjację, wydłużenie i/lub zakończenie transkrypcji.

application-biolayer-interferometry-bli-for-studying-protein-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy technologię interferometrii biowarstw (BLI) do wykrywania interakcji międzycząsteczkowych między ligandami a docelowymi analitami w czasie rzeczywistym. BLI mierzy zmiany we wzorze interferencji światła białego odbitego od warstwy unieruchomionych ligandów na powierzchni biosensora, gdy oddziałują one z analitami w roztworze.

Technologia interferometrii biowarstw do wykrywania interakcji między ligandem a analitem

Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.

Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

Protokół tutaj opisuje interakcje oczyszczonego białka kanału jonowego hEAG1 z małocząsteczkowym ligandem lipidowym fosfatydyloinozytolem 4,5-bisfosforanem (2). Pomiar pokazuje, że BLI może być potencjalną metodą badań przesiewowych ligandów kanałów jonowych małych cząsteczek.

Uchwycenie kinetyki oddziaływania białka kanału jonowego z małymi cząsteczkami za pomocą testu interferometrii biowarstwowej

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy zmodyfikowany protokół CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq z tandemowym oczyszczaniem FLAG-biotyna w celu określenia celów RNA białek wiążących RNA (RBP) w komórkach ssaków.

Profilowanie interakcji białko-RNA w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania FLAG-biotyna

Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Celem protokołu jest przygotowanie hydrolizatu keratyny z piór kurczaka metodą hydrolizy alkaliczno-enzymatycznej oraz sprawdzenie, czy dodanie hydrolizatu keratyny do bazy maści kosmetycznej poprawia funkcję bariery skórnej (zwiększając nawilżenie i zmniejszając przeznaskórkową utratę wody). Testy przeprowadza się na ochotnikach i ochotniczkach.

Przygotowanie hydrolizatu keratyny z piór kurczaka i jego zastosowanie w kosmetyce

Poznaj interferometrię biowarstwową (BLI) do badania interakcji białko-białko w transkrypcji. Ta metoda umożliwia analizę kinetyki wiązania GrgA z polimerazą RNA w czasie rzeczywistym.

Zastosowanie interferometrii biowarstwowej (BLI) do badania interakcji białko-białko w transkrypcji

Przeglądaj więcej filmów