Zastosowanie interferometrii biowarstwowej (BLI) do badania interakcji białko-białko w transkrypcji

Interakcje czynników transkrypcyjnych (TF) z polimerazą RNA są zwykle badane za pomocą testów pulldown. Stosujemy technologię interferometrii biowarstwowej (BLI) w celu scharakteryzowania oddziaływania GrgA z polimerazą chlamydiowego RNA. W porównaniu z testami pulldown, BLI wykrywa asocjację i dysocjację w czasie rzeczywistym, oferuje wyższą czułość i jest wysoce ilościowy.

Interakcja białko-białko w transkrypcji była tradycyjnie badana za pomocą dializy Por. Jednak dializy Por mają charakter czysto ilościowy. Aby przezwyciężyć ten problem, używamy interferometrii biowarstw (BLI).

W porównaniu do Por dan, BLI wykrywa w czasie rzeczywistym powiązania i dysocjacje między partnerami wiążącymi. Generuje również ilościowe parametry kinetyczne, które wskazują na mechanizmy interakcji. Technologia BLI może brzmieć onieśmielająco, ale nie jest trudna do nauczenia Aby korzystać z tej technologii, trzeba mieć dostęp do instrumentu BLI i związanego z nim oprogramowania.

Ten film pozwoli Ci łatwo dostosować się do technologii BLI. Około 10 minut przed rozpoczęciem testu należy odpipetować 200 mikrolitrów buforu BLI do probówki PCR. Wyjmij niklowy bioczujnik NTA z oryginalnego opakowania, przytrzymując szeroką część bioczujnika ręką w rękawiczce.

Umieścić bioczujnik nad probówką do PCR w taki sposób, aby tylko szklana końcówka biosensora była zanurzona w buforze BLI. Trzymaj końcówkę biosensora zanurzoną przez co najmniej 10 minut, aby zapewnić pełne nawodnienie. Włącz maszynę Blitz.

Upewnij się, że urządzenie jest podłączone do komputera przez port wyjściowy USB z tyłu urządzenia. Na komputerze otwórz powiązane oprogramowanie i kliknij Zaawansowana kinetyka po lewej stronie ekranu. W oprogramowaniu wpisz wszystkie odpowiednie informacje o eksperymencie pod każdym odpowiednim nagłówkiem.

Kliknij Typ bioczujnika i wybierz Nikiel NTA z menu rozwijanego. Czas trwania każdego kroku można w razie potrzeby zmienić z domyślnego. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy użyć co najmniej 30 sekund na początkową linię bazową i linię bazową oraz 120 sekund na asocjację i dysocjację.

Wyjmij uwodniony niklowy bioczujnik NTA z probówki PCR i przymocuj go do uchwytu biosensora na maszynie, wsuwając szeroką część biosensora na uchwyt. Umieść czarną probówkę do mikrowirówki o pojemności 0,5 mililitra w uchwycie probówki urządzenia i wlej do niej pipety 400 mikrolitrów buforu BLI. Zamknij pokrywę maszyny tak, aby końcówka biosensora zanurzyła się w buforze w probówce mikrowirówki.

Kliknij przycisk Dalej w oprogramowaniu, aby rozpocząć nagrywanie początkowej linii bazowej. Po zakończeniu nagrywania początkowego kroku planu bazowego otwórz pokrywę urządzenia. Przesuń suwak w prawo, tak aby uchwyt upuszczania znajdował się przed czarną strzałką.

Odpipetuj cztery mikrolitry dializowanego liganda oznaczonego przez Hisa na uchwyt kropli i zamknij pokrywę urządzenia, które automatycznie rozpocznie rejestrowanie kroku ładowania. Po zakończeniu nagrywania na etapie ładowania otwórz pokrywę urządzenia. Przesuń suwak w lewo tak, aby uchwyt rurki ponownie znalazł się przed czarną strzałką.

Zamknij pokrywę urządzenia i upewnij się, że końcówka biosensora jest zanurzona w buforze BLI rurki w uchwycie probówki. Urządzenie i oprogramowanie automatycznie rozpoczną rejestrowanie kroku linii bazowej. Po zakończeniu nagrywania kroku planu bazowego otwórz pokrywę urządzenia.

Wyjmij uchwyt na krople i wyczyść go, odpipetowując białko i spłukując go podwójnie dejonizowaną wodą, w sumie pięć razy. Użyj chusteczki higienicznej, aby wyczyścić powierzchnię uchwytu na krople po ostatnim praniu. Załóż uchwyt kropli z powrotem na maszynę.

Przesuń suwak na maszynie w prawo, tak aby uchwyt kropli ponownie znalazł się przed czarną strzałką. Odpipetować cztery mikrolitry dializowanego analitu na uchwyt kropli i zamknąć pokrywę urządzenia, które automatycznie rozpocznie rejestrowanie kroku asocjacji. Po zakończeniu nagrywania na etapie kojarzenia otwórz pokrywę urządzenia.

Przesuń suwak na maszynie w prawo, tak aby uchwyt rurki ponownie znalazł się przed czarną strzałką i zamknij pokrywę maszyny, co automatycznie rozpocznie rejestrowanie kroku dysocjacji. Po zakończeniu nagrywania etapu dysocjacji otwórz pokrywę urządzenia i wyjmij uchwyt kropli i uchwyt rurki. Dokładnie spłucz oba podwójnie dejonizowaną wodą, aby zmyć wszelkie białka.

Wyjmij bioczujnik i wyrzuć go w bezpieczny sposób. Powtórz te kroki dla tej samej pary analitów ligandowych, używając różnych stężeń analitu. Po zakończeniu wszystkich uruchomień zapisz dane w oprogramowaniu, klikając Plik i Zapisz eksperyment jako po lewej stronie ekranu.

Pod nagłówkiem Uruchom dane wybierz opcję Korekcja kroku i dopasowanie jeden do jednego, a następnie kliknij przycisk Analizuj, aby wygenerować dane kinetyczne. Aby wyodrębnić dane ilościowe do arkusza roboczego i wygenerować wykresy, kliknij Eksportuj do CSV i zapisz zarejestrowane dane jako plik CSV. Otwórz plik CSV za pomocą arkusza kalkulacyjnego.

Pełna długość GrgA składa się z 288 aminokwasów. Jak pokazano tutaj, środkowy region 28 aminokwasów wiąże Sigma 28 bezpośrednio. W tym przypadku środkowy obszar oznaczony końcowym znacznikiem Hisa został użyty jako ligand, który został najpierw unieruchomiony na końcówce niklowego bioczujnika NTA.

Pokazane są zapisy doświadczeń z trzema różnymi stężeniami analitu, z których każde rozpoczyna się 30 sekund przed wiązaniem liganda i kończy dwie minuty po rozpoczęciu ostatniego płukania. Ulepszona wizualizacja asocjacji i dysocjacji analitu liganda jest pokazana po usunięciu wartości w pierwszych dwóch etapach i zresetowaniu linii bazowej. Po wypłukaniu niezwiązanego i końcowego GrgA oznaczonego przez His od 138 do 165 z biosensora, zarejestrowano powiązanie w czasie rzeczywistym z analitem po dodaniu Sigmy 28.

Wreszcie, po praniu zarejestrowano dysocjację w czasie rzeczywistym. Przed testami BLI glicerol jest usuwany z ligandów i analitów. Zalecamy, aby BLI wykonać wkrótce po dializie, jak omówiono w tekście.

Po scharakteryzowaniu interakcji białko-białko w transkrypcji z BLI można zbadać, w jaki sposób interakcja wpływa na inicjację, wydłużenie i/lub zakończenie transkrypcji.