Interferencyjna mikroskopia refleksyjna do bezznacznikowej wizualizacji dynamiki mikrotubul

Mikroskopia interferencyjna odbiciowa umożliwia obrazowanie mikrotubul, które dynamicznie rosną i kurczą się.

Przymocuj paski parafiny do jednego szkiełka nakrywkowego i umieść nieco mniejsze szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Podgrzej, aby stopić parafinę, tworząc szczelny kanał. Odpipetować przez kanał roztwór zawierający przeciwciała. Przeciwciała przyczepiają się do powierzchni szkiełka nakrywkowego. Dodaj roztwór blokujący, blokując regiony niezwiązane z przeciwciałami i zapobiegając niespecyficznemu wiązaniu białek.

Umieść szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu. Ustawić podgrzewacz próbki na temperaturę ułatwiającą wzrost mikrotubul.

Nasiona mikrotubul pipetowych stabilizowane niehydrolizowalnym trifosforanem guanozyny, GTP, analogiem. Nasiona wiążą się ze szkiełkiem nakrywkowym pokrytym przeciwciałami. Dodaj bufor zawierający nieznakowaną tubulinę, GTP i środki redukujące.

W optymalnej temperaturze i warunkach buforowych nasiona działają jako miejsca zarodkowania, umożliwiając nieznakowane wiązanie tubuliny i wzrost mikrotubul.

Rozpocznij obrazowanie. Padające światło skupia się przez przysłonę aperturową na rozdzielaczu wiązki, który częściowo odbija światło do obiektywu, oświetlając próbkę. Szklany interfejs bufora szkiełka nakrywkowego częściowo odbija padające światło. Pozostałe światło padające przechodzi i odbija się na granicy faz bufor-mikrotubula.

W oparciu o odległość mikrotubula od szkiełka nakrywkowego, wiązki odbite od dwóch interfejsów interferują, wytwarzając zakłócenia konstrukcyjne – wiązki łączą się w celu wytworzenia jasnego sygnału lub zakłócenia destrukcyjne – wiązki znoszą się, tworząc ciemny sygnał.

Wizualizuj mikrotubule jako obrazy o wysokim kontraście. Rób zdjęcia poklatkowe, wykrywając wzrost i kurczenie się mikrotubul.

Na początek włóż lustro 50/50 do koła filtrów mikroskopu fluorescencyjnego za pomocą odpowiedniej kostki filtrującej. Z lustrem należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ często mają one powłokę antyrefleksyjną. Zwróć się do obiektywu o dużym powiększeniu, który ma również dużą aperturę numeryczną. Ten pokazany tutaj to obiektyw olejowy 100x z aperturą numeryczną 1,3.

Następnie użyj żyletki i szkiełka mikroskopowego jako prostej krawędzi, aby wyciąć paski plastikowej folii parafinowej o szerokości 3 milimetrów. Umieść dwa plastikowe paski folii parafinowej w odległości 3 milimetrów od siebie na czystym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 na 22 milimetry. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 na 18 milimetrów na paskach, aby utworzyć kanał.

Przenieś szkiełko nakrywkowe do bloku grzewczego o temperaturze 100 stopni Celsjusza na 10 do 30 sekund, aby folia parafinowa utworzyła uszczelniony kanał. Za pomocą pipety wprowadzić 50 mikrogramów na mililitr przeciwciała anty-rodaminowego przez perfuzję i inkubować szkiełko przez 10 minut.

Po inkubacji przemyć kanał pięciokrotnie za pomocą przefiltrowanego BRB80. Następnie należy wprowadzić 1% poloksamer 407 do przefiltrowanego BRB80, aby zablokować powierzchnię przed niespecyficznym wiązaniem i inkubować szkiełko przez 10 minut. Ponownie umyj kanał pięć razy za pomocą filtrowanego BRB80.

Aby zapobiec wysychaniu próbki, dodaj dwie kropelki przefiltrowanego BRB80 na końcach kanału i w razie potrzeby dodaj więcej buforu. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i włącz źródło światła epi-illumination. Ustaw ostrość na krawędzi filmu parafinowego, aby znaleźć powierzchnię próbki, a następnie przesuń pole, aby ustawić widok na środku komory. Będziesz obserwować wiele powierzchni, gdy obiektyw jest przesuwany w górę iw dół z powodu wstecznego odbicia światła od układu optycznego w obrębie ścieżki optycznej.

Następnie wyśrodkuj membranę polową w polu view, zamykając ją do połowy i używając regulacyjnych Gdy membrana jest prawidłowo wyrównana, otwórz ją ponownie. Następnie wsuń soczewkę Bertranda, aby view tylna płaszczyzna ogniskowa, znana również jako źrenica wyjściowa obiektywu.

Zamknij przysłonę przysłony poza krawędziami źrenicy wyjściowej i użyj regulacyjnych, aby wyśrodkować przysłonę przysłony w stosunku do źrenicy wyjściowej. Sprawdź dwukrotnie, otwierając przysłonę apertury i dopasowując jej krawędzie do krawędzi źrenicy wyjściowej. Następnie ustaw przysłonę na około 2/3 apertury numerycznej obiektywu.

Aby zobrazować dynamikę mikrotubul za pomocą tubuliny mózgowej, zacznij od ustawienia temperatury podgrzewacza próbki na 37 stopni Celsjusza. Za pomocą pipety wlej 10 mikrolitrów nasion mikrotubul stabilizowanych GMPCPP i monitoruj ich wiązanie z powierzchnią, obrazując powierzchnię na żywo. Gdy 10 do 20 nasion zostanie związanych w polu widzenia, umyj próbkę przy użyciu podwójnej objętości kanału wstępnie podgrzanego i przefiltrowanego BRB80.

Następnie wlej 10 mikrolitrów mieszanki polimeryzacyjnej.

Aby zmierzyć wzrost mikrotubul, ustaw film poklatkowy za pomocą oprogramowania do akwizycji, aby uzyskać obraz co 5 sekund przez 15 minut. Zwiększ kontrast, uzyskując średni obraz 10 w każdym punkcie czasowym. Uzyskaj obrazy tła, jak pokazano w poprzedniej sekcji. Oblicz medianę, przechodząc do pozycji Obraz, wybierając opcję Stos, następnie Z Project, a następnie Mediana. Odejmij odpowiednie tło, przechodząc do Procesu, przechodząc do Kalkulatora obrazów i wybierając Odejmij z menu rozwijanego. Upewnij się, że zaznaczona jest opcja 32-bitowego wyniku zmiennoprzecinkowego.

W przypadku skurczu mikrotubul pozyskuj obrazy z prędkością 100 klatek na sekundę, ustawiając opóźnienie czasowe na zero i utrzymując czas ekspozycji na poziomie 10 milisekund.