Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Znaczenie tej metody polega na tym, że umożliwia ona obrazowanie mikrotubul bez znaczników jednocześnie z białkami znakowanymi fluorescencyjnie z dużą liczbą klatek na sekundę. Główną zaletą tej techniki jest jej łatwa implementacja i minimalne wymagania dotyczące komponentów optycznych. Omija również potrzebę znakowania mikrotubul fluoro-4.

Na początek należy przygotować polimer PDMS, łącząc utwardzacz i elastomer bazowy w stosunku masowym 1:10. Mieszaj je przez dwie minuty, a następnie odgazowuj mieszaninę w komorze próżniowej, aż wszystkie pęcherzyki znikną. Następnie wylej mieszaninę na formę główną warstwą o grubości około 0,5 centymetra, uważając, aby nie tworzyć bąbelków, i piecz mieszaninę w piekarniku nagrzanym do 70 stopni Celsjusza przez 40 minut.

Następnie wytnij strukturalne obszary polimeru i przebij otwory na każdym końcu kanału za pomocą dziurkacza PDMS. Później oczyść strukturalną stronę bloku PDMS. Następnie spłucz trzykrotnie izopropanolem i metanolem, a następnie ultraczystą wodą i wysusz powierzchnię suszarką.

Następnie należy oczyścić plazmowo PDMS za pomocą plazmy tlenowej lub powietrznej i umieścić oczyszczony plazmowo PDMS na odpowiednio oczyszczonym szkle nakrywkowym. Podgrzej go na płycie grzejnej w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 15 minut. Włóż do otworów rurkę z polietylenu o niskiej gęstości o odpowiedniej wielkości i podłącz rurkę wylotową do strzykawki o pojemności 0,5 mililitra.

Następnie wlej roztwory do mikrokanalików, zanurzając rurkę wlotową w roztworze i pobierając wymaganą objętość za pomocą strzykawki. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i włącz źródło światła epi-illumination do obrazowania IRM. Aby ustawić ostrość mikroskopu, poszukaj właściwej płaszczyzny ogniskowej w pobliżu interfejsu rozwiązania PDMS i wybierz pole widzenia w pobliżu środka kanału.

Następnie należy przygotować 0,1-mikromolowy roztwór mikrogranulek fluorescencyjnych w BRB80 i przepuścić co najmniej jedną objętość kanału roztworu mikrogranulek. Monitoruj reakcję za pomocą IRM lub TIRF. Po osiągnięciu pożądanej gęstości mikrogranulek zmyj nadmiar BRB80.

Przelej rozcieńczone nasiona do komory reakcyjnej i monitoruj reakcję za pomocą IRM. Po osiągnięciu pożądanej gęstości nasion zmyj nadmiar BRB80. Następnie należy przygotować mieszaninę do przedłużania mikrotubul zawierającą 12-mikromolową nieznakowaną tubulinę, jednomilimolową GTP, pięciomilimolową DTT w buforze BRB80.

Następnie przelej co najmniej jedną objętość kanałową mieszaniny przedłużającej, upewniając się, że temperatura reakcji wynosi 28 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć, ustaw ustawienia obrazowania w oprogramowaniu mikroskopu. Rozpocznij obrazowanie i wlej roztwór kinezyny do komory.

Następnie wyobraź sobie niekurczliwe mikrotubule kinezyny 1 oznaczone GFP. Po zakończeniu pomiaru nagraj krótki film, w którym stolik jest powoli przesuwany ruchem okrężnym lub bocznym. Mediana projekcji tego filmu posłuży jako obraz tła i zostanie odjęta od surowych pomiarów.

Utwórz projekcję mediany w ImageJ z nagrania w tle, klikając Obraz. Następnie wybierz opcję Stosy i kliknij Z Project. Następnie odejmij medianę projekcji tła od surowych danych obrazu, klikając Proces, a następnie wybierz opcję Kalkulator obrazu, upewniając się, że zaznaczyłeś opcję 32-bitowego wyniku zmiennoprzecinkowego.

Aby zarejestrować obraz, wybierz kolekcję mikrokulek w pobliżu interesującej nas mikrotubuli i użyj ich do wyrównania obrazów TIRF i IRM. Dla każdego ściegu w tej kolekcji użyj narzędzia do zaznaczania wielopunktowego, aby zaznaczyć przybliżone położenie w kanale TIRF, a następnie odpowiadające mu położenie w kanale IRM. Następnie uruchom dostarczone makro ImageJ.

Mikrogranulki pojawiają się jako ciemne plamy w kanale IRM po prawej stronie i jako jasne punkty w kanale TIRF po lewej stronie. Procedura wyrównywania prawidłowo nakłada się na dwa kanały, lokalizując wybrane koraliki. Przy użyciu tego protokołu uzyskano również kymogram cząsteczek kinezyny znakowanych EGFP poruszających się w kierunku kurczących się końców mikrotubul.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wybrać obiektywy o dużej aperturze numerycznej, aby uzyskać całkowite odbicie wewnętrzne, a także zmaksymalizować wydajność zbierania i kontrast obrazu. Metoda ta może być stosowana do obrazowania w wysokiej rozdzielczości pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych jednocześnie w strukturze makromolekularnej wystarczająco masywnej, aby można ją było uwidocznić za pomocą IRM, takiej jak błona komórkowa lub włókno aktynowe. Protokół ten zapewnia również łatwą do dostosowania procedurę jednoczesnego obrazowania z dowolną kombinacją IRM, TIRF i epifluorescencji.