Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek
May 3rd, 2022
Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.
Znaczenie tej metody polega na tym, że umożliwia ona obrazowanie mikrotubul bez znaczników jednocześnie z białkami znakowanymi fluorescencyjnie z dużą liczbą klatek na sekundę. Główną zaletą tej techniki jest jej łatwa implementacja i minimalne wymagania dotyczące komponentów optycznych. Omija również potrzebę znakowania mikrotubul fluoro-4.
Na początek należy przygotować polimer PDMS, łącząc utwardzacz i elastomer bazowy w stosunku masowym 1:10. Mieszaj je przez dwie minuty, a następnie odgazowuj mieszaninę w komorze próżniowej, aż wszystkie pęcherzyki znikną. Następnie wylej mieszaninę na formę główną warstwą o grubości około 0,5 centymetra, uważając, aby nie tworzyć bąbelków, i piecz mieszaninę w piekarniku nagrzanym do 70 stopni Celsjusza przez 40 minut.
Następnie wytnij strukturalne obszary polimeru i przebij otwory na każdym końcu kanału za pomocą dziurkacza PDMS. Później oczyść strukturalną stronę bloku PDMS. Następnie spłucz trzykrotnie izopropanolem i metanolem, a następnie ultraczystą wodą i wysusz powierzchnię suszarką.
Następnie należy oczyścić plazmowo PDMS za pomocą plazmy tlenowej lub powietrznej i umieścić oczyszczony plazmowo PDMS na odpowiednio oczyszczonym szkle nakrywkowym. Podgrzej go na płycie grzejnej w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 15 minut. Włóż do otworów rurkę z polietylenu o niskiej gęstości o odpowiedniej wielkości i podłącz rurkę wylotową do strzykawki o pojemności 0,5 mililitra.
Następnie wlej roztwory do mikrokanalików, zanurzając rurkę wlotową w roztworze i pobierając wymaganą objętość za pomocą strzykawki. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i włącz źródło światła epi-illumination do obrazowania IRM. Aby ustawić ostrość mikroskopu, poszukaj właściwej płaszczyzny ogniskowej w pobliżu interfejsu rozwiązania PDMS i wybierz pole widzenia w pobliżu środka kanału.
Następnie należy przygotować 0,1-mikromolowy roztwór mikrogranulek fluorescencyjnych w BRB80 i przepuścić co najmniej jedną objętość kanału roztworu mikrogranulek. Monitoruj reakcję za pomocą IRM lub TIRF. Po osiągnięciu pożądanej gęstości mikrogranulek zmyj nadmiar BRB80.
Przelej rozcieńczone nasiona do komory reakcyjnej i monitoruj reakcję za pomocą IRM. Po osiągnięciu pożądanej gęstości nasion zmyj nadmiar BRB80. Następnie należy przygotować mieszaninę do przedłużania mikrotubul zawierającą 12-mikromolową nieznakowaną tubulinę, jednomilimolową GTP, pięciomilimolową DTT w buforze BRB80.
Następnie przelej co najmniej jedną objętość kanałową mieszaniny przedłużającej, upewniając się, że temperatura reakcji wynosi 28 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć, ustaw ustawienia obrazowania w oprogramowaniu mikroskopu. Rozpocznij obrazowanie i wlej roztwór kinezyny do komory.
Następnie wyobraź sobie niekurczliwe mikrotubule kinezyny 1 oznaczone GFP. Po zakończeniu pomiaru nagraj krótki film, w którym stolik jest powoli przesuwany ruchem okrężnym lub bocznym. Mediana projekcji tego filmu posłuży jako obraz tła i zostanie odjęta od surowych pomiarów.
Utwórz projekcję mediany w ImageJ z nagrania w tle, klikając Obraz. Następnie wybierz opcję Stosy i kliknij Z Project. Następnie odejmij medianę projekcji tła od surowych danych obrazu, klikając Proces, a następnie wybierz opcję Kalkulator obrazu, upewniając się, że zaznaczyłeś opcję 32-bitowego wyniku zmiennoprzecinkowego.
Aby zarejestrować obraz, wybierz kolekcję mikrokulek w pobliżu interesującej nas mikrotubuli i użyj ich do wyrównania obrazów TIRF i IRM. Dla każdego ściegu w tej kolekcji użyj narzędzia do zaznaczania wielopunktowego, aby zaznaczyć przybliżone położenie w kanale TIRF, a następnie odpowiadające mu położenie w kanale IRM. Następnie uruchom dostarczone makro ImageJ.
Mikrogranulki pojawiają się jako ciemne plamy w kanale IRM po prawej stronie i jako jasne punkty w kanale TIRF po lewej stronie. Procedura wyrównywania prawidłowo nakłada się na dwa kanały, lokalizując wybrane koraliki. Przy użyciu tego protokołu uzyskano również kymogram cząsteczek kinezyny znakowanych EGFP poruszających się w kierunku kurczących się końców mikrotubul.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wybrać obiektywy o dużej aperturze numerycznej, aby uzyskać całkowite odbicie wewnętrzne, a także zmaksymalizować wydajność zbierania i kontrast obrazu. Metoda ta może być stosowana do obrazowania w wysokiej rozdzielczości pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych jednocześnie w strukturze makromolekularnej wystarczająco masywnej, aby można ją było uwidocznić za pomocą IRM, takiej jak błona komórkowa lub włókno aktynowe. Protokół ten zapewnia również łatwą do dostosowania procedurę jednoczesnego obrazowania z dowolną kombinacją IRM, TIRF i epifluorescencji.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół implementacji mikroskopii interferencyjno-odbiciowej (IRM) oraz mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i białek związanych z mikrotubulami oznaczonych fluorescencyjnie. Metoda ta umożliwia obrazowanie z wysoką częstotliwością klatek białek bez oznaczenia fluorescencyjnego obok białek fluorescencyjnych, co poprawia badania dynamiki komórkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Techniki mikroskopowe
Tło
- IRM i TIRF to zaawansowane techniki obrazowania stosowane do wizualizacji komponentów komórkowych.
- Mikrotubule odgrywają kluczową rolę w strukturze i funkcji komórki.
- Oznaczanie fluorescencyjne jest powszechnie stosowane do badania białek, ale może komplikować obrazowanie mikrotubul.
- Ten protokół ma na celu uproszczenie procesu obrazowania przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości.
Cel badania
- Dostarczyć niezawodną metodę do jednoczesnego obrazowania mikrotubul i związanych z nimi białek.
- Wykazać zalety stosowania IRM i TIRF w badaniach dynamicznych.
- Ułatwić wysokorozdzielcze obrazowanie bez potrzeby stosowania skomplikowanych technik oznaczania.
Zastosowane metody
- Przygotowanie polimeru PDMS do produkcji mikrokanałów.
- Wprowadzanie roztworów do mikrokanałów w celu obrazowania.
- Ustawianie parametrów obrazowania w mikroskopie dla optymalnych wyników.
- Użycie ImageJ do przetwarzania obrazów i wyrównania obrazów TIRF i IRM.
Główne wyniki
- Udane jednoczesne obrazowanie mikrotubul i białek oznaczonych fluorescencyjnie.
- Wysokorozdzielcze wizualizacje molekuł kinezyny oddziałujących z mikrotubulami.
- Skuteczna rejestracja obrazów TIRF i IRM za pomocą mikroperli.
- Wykazanie adaptacyjności protokołu dla różnych kombinacji obrazowania.
Wnioski
- Protokół oferuje prostą metodę badania dynamiki mikrotubul.
- IRM i TIRF mogą być skutecznie łączone dla zwiększenia możliwości obrazowania.
- Ta metoda może być stosowana do różnych systemów biologicznych w celu szczegółowej analizy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Simultaneous IRM and TIRF microscopy enables high-speed, dual-channel imaging of dynamic microtubules and associated proteins without the need for extensive labeling or complex optical setups. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing quantitative, label-free visualization alongside single-molecule fluorescence detection. The approach streamlines imaging workflows, reduces photobleaching risk, and enhances predictive confidence in cytoskeletal protein studies relevant to biopharma discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein-microtubule interactions for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing dynamic cytoskeletal processes in real time.
- Facilitates hypothesis testing on protein localization and motility without labeling artifacts.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible imaging platform for quantitative analysis of protein dynamics.
- Reduces assay complexity by eliminating the need for dual labeling and additional excitation sources.
- Enables high-throughput screening readiness by imaging both channels on a single camera chip.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by supporting studies of cytoskeletal dynamics implicated in neurodegeneration and oncology.
- Maintains translational continuity by enabling single-molecule resolution in physiologically relevant environments.
- Improves risk-adjusted advancement decisions through robust, quantitative imaging outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-mode imaging method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of microtubule-associated protein function and pathway mapping.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation and phenotypic screening.
- Analytics: Provides high-resolution, synchronized readouts for direct comparison of protein and filament dynamics.
- Translational Research: Enables continuity from in vitro mechanistic studies to disease-relevant model systems.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible imaging platform adaptable to various cytoskeletal and membrane-associated targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Simplifies imaging workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio progression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cytoskeletal targets and associated pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced microscopy and image analysis software such as ImageJ.
- Needs access to high numerical aperture objectives and compatible TIRF/IRM-capable microscopes.
- Demands cross-team standardization for image registration and background correction procedures.
- Adaptable to various model systems, including actin filaments and cell membranes, with minimal protocol changes.
- Practical limitations include the need for careful alignment and potential throughput constraints for large-scale screens.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:29
Preparation of PDMS Channels
2:15
Preparation for Imaging
3:02
Growing Dynamic Guanosine Diphosphate “Extensions”
3:46
Kinesin Motility Assay
4:23
Image Processing and Analysis
5:22
Results: Imaging of Dynamic Microtubules and Fluorescently Labeled Microtubule-Associated Proteins
5:57
Conclusion
