Name: Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Poznaj metodę łączącą mikroskopię IRM i TIRF do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek. Technika umożliwia badanie interakcji kinezyny z mikrotubulami bez konieczności znakowania fluoroforami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy laboratorium Thierry'ego Emoneta za udostępnienie sprzętu do pomieszczeń czystych. Dziękujemy Yin-Wei Kuo za przygotowanie oczyszczonej eGFP-kinezyny użytej w tym badaniu. Y.T. dziękuje za wsparcie Fundacji Alexandra von Humboldta za pośrednictwem stypendium badawczego Feodora Lynena. Praca ta była wspierana przez NIH Grant R01 GM139337 (dla J.H.).

1. Przygotowanie komór przepływowych
UWAGA: Mikroprzepływowe komory przepływowe zostaną zbudowane poprzez przyklejenie mikrokanalików polidimetylosiloksanu (PDMS) do oczyszczonego i funkcjonalizowanego szkła nakrywkowego. Mikrokanaliki zostaną odlane w formie wzorcowej.
<ol>
	<li>Przygotowanie kanałów PDMS
	<ol>
		<li>Przygotować oczyszczone i/lub funkcjonalizowane szkła nakrywkowe o składzie chemicznym powierzchni odpowiednim do konkretnego obrazowanego testu. 
		UWAGA: Do testów ruchliwości kinezyny stosuje się silanizowane szkła nakrywkowe oczyszczone piranią. Są one przygotowywane zgodnie z opisem w Gell et. al.1 Alternatywnie, prostszą procedurą jest sonikacja szkieł nakrywkowych w izopropanolu, a następnie metanolu przez 3 cykle po 20 minut.</li>
		<li>Aby przygotować formę główną, przytnij paski jednostronnej taśmy stacjonarnej do żądanego rozmiaru kanału przepływowego. Przyklej paski do dna 10 cm szalki Petriego, układając je na boki z zachowaniem co najmniej 1 cm odstępu między paskami. 
		UWAGA: Jeśli wymagane są dokładne wymiary kanału, forma może być wykonana na płytkach krzemowych za pomocą fotolitografii14.</li>
		<li>Aby przygotować polimer PDMS, należy połączyć utwardzacz i elastomer bazowy w stosunku masowym 1:10. Mieszaj przez 2 min. 
		UWAGA: Ten stosunek mieszania można zmieniać, aby dostroić sztywność polimeru. Wyższy stosunek bazy do utwardzacza skutkuje bardziej miękkim polimerem.</li>
		<li>Odgazuj mieszaninę w komorze próżniowej, aż wszystkie pęcherzyki znikną.</li>
		<li>Wylej mieszaninę na formę wzorcową warstwą o grubości ~0,5 cm, uważając, aby nie tworzyć bąbelków.</li>
		<li>Piecz masę w piekarniku nagrzanym do 70 °C przez 40 min. 
		UWAGA: Może być wymagany dłuższy czas utwardzania, jeśli blok PDMS jest gruby (>1 cm). Kontynuuj podgrzewanie w odstępach 5-minutowych, aż do całkowitego utwardzenia.</li>
		<li>Wytnij strukturalne obszary polimeru. Przebij otwory na każdym końcu kanału za pomocą dziurkacza PDMS. 
		UWAGA: W tym protokole średnica otworu jest ustawiona na 0,75 mm i można ją regulować zgodnie z wymaganymi natężeniami przepływu. Kanały PDMS mogą być przechowywane w suchym środowisku przez dłuższy czas, ale należy je wyczyścić przed użyciem.</li>
		<li>Oczyść strukturalną stronę bloku PDMS. Użyj taśmy stacjonarnej, aby usunąć duże cząstki. Spłucz izopropanolem, a następnie metanolem. Powtórz te płukania 3 razy, spłucz ultraczystą wodą i wysusz powierzchnię suszarką.</li>
		<li>Plazma oczyść PDMS za pomocą tlenu lub plazmy powietrznej. 
		UWAGA: W tym protokole używana jest plazma powietrzna o mocy 18 W.</li>
		<li>Umieść oczyszczony plazmowo PDMS na odpowiednio oczyszczonej szkle nakrywkowej i podgrzewaj na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C przez 15 min. 
		UWAGA: Żywicę epoksydową można nakładać na boki bloku PDMS, aby lepiej przylegać do szkła osłonowego.</li>
		<li>Włóż do otworów rurki z polietylenu o niskiej gęstości (LDPE) o odpowiedniej wielkości. Podłącz rurkę wylotową do strzykawki 0.5 ml. 
		UWAGA: W tym protokole rurki o średnicy wewnętrznej 0,023 cala są połączone z PDMS za pomocą metalowego adaptera o średnicy zewnętrznej 0,025 cala.</li>
		<li>Wlać roztwory do mikrokanalików, zanurzając rurkę wlotową w roztworze i pobierając wymaganą objętość za pomocą strzykawki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Konfiguracja optyczna
<ol>
	<li>Modyfikacja mikroskopu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
	<ol>
		<li>Zmodyfikuj mikroskop TIRF, aby włączyć obrazowanie IRM13. Wymień rozdzielacz wiązki 50/50 (Odbicie (R)/Transmisja (T)) używany w kole filtrów mikroskopu na rozdzielacz wiązki 10/90 (R/T).</li>
		<li>Wstaw rozdzielacz obrazu między aparatem a mikroskopem.</li>
		<li>W kostce filtra rozdzielacza obrazu wstaw rozdzielacz wiązki 10/90 (R/T). Umieść filtr długoprzepustowy o długości fali 600 nm przed wiązką odbitą, a odpowiedni filtr emisji fluorescencji przed wiązką transmitowaną. 
		UWAGA: Rozdzielacze wiązki o różnych współczynnikach R/T mogą być używane do dostrajania frakcji zbieranego światła emisyjnego IRM i TIRF.</li>
		<li>Wyrównaj rozdzielacz obrazu zgodnie ze specyfikacją producenta, aby przestrzennie oddzielić sygnały TIRF i IRM na chipie aparatu. 
		UWAGA: Przestrzenna separacja sygnałów jest wymagana, ponieważ sygnał TIRF typowych fluoroforów jest znacznie słabszy niż sygnał IRM mikrotubuli i nie byłby wykrywalny, gdyby te dwa sygnały zostały nałożone</li> na siebie.
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie dynamicznych mikrotubul i pojedynczych cząsteczek kinezyny
<ol>
	<li>Funkcjonalizacja i pasywacja powierzchni
	<ol>
		<li>Przelać bufor BRB80 (80 mM Na-PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, miareczkowany do pH 7,8 za pomocą NaOH) do komory reakcyjnej.</li>
		<li>Przepływowy roztwór antybiotyny rozcieńczony do 0,025 mg/ml w BRB80 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Umyj kanał za pomocą BRB80.</li>
		<li>Przepłynąć w roztworze F-127 (1% Pluronic F-127 (w/v) rozpuszczony w BRB80 przez noc) i inkubować przez co najmniej 20 minut w celu pasywacji powierzchniowej. 
		UWAGA: Jeśli zamiast silanizowanych szkieł nakrywkowych stosuje się łatwe do czyszczenia szkła nakrywkowe, pasywację przy użyciu 2 mg/ml kazeiny w BRB80 przez >20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj kanał za pomocą BRB80.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do obrazowania
	<ol>
		<li>Jeśli wymagana jest regulacja temperatury, użyj grzejnika obiektywowego i ustaw go na odpowiednią temperaturę. 
		UWAGA: W tym protokole wszystkie eksperymenty są wykonywane w temperaturze 28 °C.</li>
		<li>Umieścić próbkę na stoliku mikroskopu i włączyć źródło światła epiiluminacji (>600 nm) do obrazowania IRM. 
		UWAGA: W tym protokole używane jest białe źródło światła LED z filtrem długoprzepustowym 600 nm.</li>
		<li>Ustaw ostrość mikroskopu na powierzchni próbki. Poszukaj właściwej płaszczyzny ogniskowej w pobliżu interfejsu rozwiązania PDMS. 
		UWAGA: W IRM wodne wnętrze kanału powinno wydawać się znacznie jaśniejsze niż polimer PDMS.</li>
		<li>Wybierz pole widzenia w pobliżu środka kanału.</li>
		<li>Przygotować roztwór 0,1 μm fluorescencyjnych mikrokulek w BRB80 (gęstość: 109 kulek/ml, co odpowiada 200-krotnemu rozcieńczeniu kulek stosowanych w tym protokole).</li>
		<li>Przepływ w co najmniej jednej objętości kanału roztworu mikrogranulek.</li>
		<li>Monitorowanie reakcji za pomocą usługi IRM. Poczekaj, aż mikrogranulki stopniowo "wylądują" na powierzchni. Po osiągnięciu pożądanej gęstości mikrogranulek zmyj nadmiar BRB80.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uprawa biotynylowanych nasion mikrotubul stabilizowanych 5'-α,β-metylenodifosfonianem guanylylu (GMPCPP)
	<ol>
		<li>W probówce wirówkowej o pojemności 0,6 ml przygotuj 50 μl roztworu zawierającego 1 mM GMPCPP, 1 mM MgCl2 i 2 μM biotynylowanej tubuliny (5-10% oznaczania stechiometrii) w BRB80. 
		UWAGA: Prawidłową stechiometrię znakowania można uzyskać, łącząc biotynylowaną tubulinę o dużej gęstości z nieznakowaną tubuliną bydlęcą w odpowiednim stosunku.</li>
		<li>Inkubować roztwór na lodzie przez 5 minut, następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 12,5 min. 
		UWAGA: Długość nasion można kontrolować, dostrajając czas polimeryzacji.</li>
		<li>Zatrzymaj polimeryzację, dodając 100 μl BRB80 o temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odwirować roztwór w ultrawirówce w temperaturze pokojowej (126 000 x g, 5 min). Odrzucić supernatant za pomocą pipety w celu usunięcia niespolimeryzowanej tubuliny. 
		UWAGA: W tym protokole używana jest ultrawirówka napędzana powietrzem.</li>
		<li>Do granulatu dodać 200 μl BRB80 o temperaturze pokojowej. Zawiesić osad przez delikatne, ale dokładne pipetowanie. Użyj pipety o pojemności 200 μl z odciętą końcówką, aby zmniejszyć ścinanie mikrotubul.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rosnące dynamiczne "rozszerzenia" tubuliny difosforanu guanozyny (GDP) 
	UWAGA: Nasiona zostaną unieruchomione na powierzchni antybiotyny kanału przepływowego. Dynamiczne "przedłużenia" GTP/GDP będą wyrastać z końców unieruchomionych nasion.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć nasiona 20x w BRB80. Przelej rozcieńczone nasiona do komory reakcyjnej.</li>
		<li>Monitorowanie reakcji za pomocą usługi IRM. Poczekaj, aż nasiona stopniowo "wylądują" na powierzchni i zwiążą się z nią. Po osiągnięciu pożądanej gęstości nasion zmyj nadmiar BRB80.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę do przedłużania mikrotubul: 12 μM nieznakowanej tubuliny, 1 mM GTP, 5 mM ditiotreitolu (DTT) w buforze BRB80.</li>
		<li>Przepływ w co najmniej jednej objętości kanału mieszaniny przedłużającej. Upewnić się, że temperatura reakcji wynosi 28 °C.</li>
		<li>Poczekaj, aż z czasem z nasion wyrosną rozszerzenia mikrotubul. 
		UWAGA: Długość w stanie ustalonym jest zwykle osiągana w czasie krótszym niż 20 minut.</li>
		<li>Użyj dynamicznych mikrotubul do obrazowania. Dodaj i zwizualizuj fluorescencyjne MAP na mikrotubulach, jak opisano w kroku 3.5 dla kinesin-1. 
		UWAGA: Ponieważ mikrotubule są związane z powierzchnią, są łatwo widoczne dla TIRF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test ruchliwości kinezyny 
	UWAGA: W tym kroku opisano protokół wizualizacji ruchliwej kinezyny-1 znakowanej zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) na kurczących się mikrotubulach. Skrócony konstrukt kinezyny-1 szczura połączony z eGFP (rKin430-eGFP) został poddany ekspresji i oczyszczeniu, jak opisano wcześniej15,16.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor do pomiaru ruchliwości: 1 mM ATP i 0,2 mg/ml kazeiny w BRB80.</li>
		<li>Rozcieńczyć kinezynę-eGFP w buforze ruchliwości do 10 nM.</li>
		<li>Przygotuj 2x roztwór pochłaniacza tlenu, aby przeciwdziałać oksydacyjnemu fotowybielaniu (80 mM glukozy, 80 mg/ml oksydazy glukozowej, 32 mg/ml katalazy, 0,2 mg/ml kazeiny, 20 mM DTT) uzupełniony 2 mM ATP.</li>
		<li>Połącz 10 części pochłaniacza tlenu, 9 części BRB80 i 1 część 10 nM kinezyny-eGFP, aby uzyskać końcowe stężenie kinezyny 0,5 nM. 
		UWAGA: Całkowita głośność powinna być co najmniej 1.5 raza większa niż głośność kanału.</li>
		<li>Skonfiguruj ustawienia obrazowania w oprogramowaniu mikroskopu. 
		UWAGA: W tym protokole filmy są nagrywane z szybkością 10 kl./s i czasem naświetlania 100 ms. Natężenie lasera wynosi ~0,05 kW/cm2.</li>
		<li>Rozpocznij obrazowanie i wlej roztwór kinezyny do komory.</li>
		<li>Po zakończeniu pomiaru nagraj krótki (~5 s) film, w którym stolik jest powoli przesuwany ruchem okrężnym lub bocznym. Użyj mediany projekcji tego filmu jako obrazu tła i odejmij ją od surowych pomiarów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie i analiza obrazu
UWAGA: Przetwarzanie obrazu zostało przeprowadzone przy użyciu NIH ImageJ2 (imagej.nih.gov/ij/). Opracowano makro w celu zautomatyzowania dzielenia i wyrównywania kanałów TIRF i IRM. To makro wymaga zainstalowania wtyczki GaussFit_OnSpot (dostępnej w repozytorium wtyczek ImageJ).
<ol>
	<li>Z nagrania w tle utwórz projekcję mediany w ImageJ, klikając Obraz | Stosy | Projekt Z.</li>
	<li>Odejmij medianę projekcji tła od surowych danych obrazu, klikając Procesowy | Kalkulator obrazów. 
	UWAGA: Upewnij się, że zaznaczyłeś opcję "Wynik 32-bitowy (zmiennoprzecinkowy)".</li>
	<li>Aby zarejestrować obraz, wybierz kolekcję mikrokulek w pobliżu interesującej nas mikrotubuli i użyj ich do wyrównania obrazów TIRF i IRM.</li>
	<li>Dla każdego ściegu w tej kolekcji użyj narzędzia do zaznaczania wielopunktowego, aby zaznaczyć przybliżone położenie w kanale TIRF, a następnie odpowiadające mu położenie w kanale IRM. 
	UWAGA: Na przykład, jeśli istnieją dwa koraliki (1 i 2), zaznaczenie wielopunktowe będzie miało cztery punkty w następującej kolejności: (1) koralik 1 w TIRF, (2) koralik 1 w IRM, (3) koralik 2 w TIRF, (4) koralik 2 w IRM.</li>
	<li>Uruchom dostarczone makro ImageJ (ImageSplitterRegistration.ijm). 
	UWAGA: Automatyzuje to następujące kroki: i) oszacowanie środkowego położenia każdego ściegu poprzez dopasowanie do gaussa; ii) dla każdego koralika, obliczając wektor przemieszczenia oddzielający środek w kanale TIRF od środka w kanale IRM; iii) uśrednienie tego wektora przemieszczenia na wszystkich koralikach; iv) rozdzielenie kanałów TIRF i IRM na osobne obrazy; v) przełożenie obrazu TIRF za pomocą średniego wektora przemieszczenia obliczonego w punkcie iii; vi) nakładanie obrazów TIRF i IRM na wielokanałowy plik .tiff.</li>
</ol>

<ol><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7%3A+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li>
<li>Kuo, Y. -W., Trottier, O., Mahamdeh, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spastin+is+a+dual-function+enzyme+that+severs+microtubules+and+promotes+their+regrowth+to+increase+the+number+and+mass+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5533-5541 (2019).</li>
<li>Hinrichs, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+protein+diffuses+along+the+microtubule+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tau protein diffuses along the microtubule lattice.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 38559-38568 (2012).</li>
<li>Al-Hiyasat, A., Tuna, Y., Kuo, Y. -W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herding+of+proteins+by+the+ends+of+shrinking+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%3A%22%5BJournal%5D)">Herding of proteins by the ends of shrinking polymers.</a> arXiv:. , (2021).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+dynamics+of+breakage+of+fluorescent+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanism and dynamics of breakage of fluorescent microtubules.</a> Biophysical Journal. 90 (6), 2093-2098 (2006).</li>
<li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li>
<li>Taylor, R. W., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+RW+%22Interferometric+scattering+%28iSCAT%29+microscopy+and+related+techniques.+in+Label-free+super-resolution+microscopy%22">Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques. in Label-free super-resolution microscopy</a>. Astratov, V. , Springer. Cham. 25-65 (2019).</li>
<li>Young, G., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+scattering+microscopy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interferometric scattering microscopy).</a> Annual Review of Physical Chemistry. 70 (1), 301-322 (2019).</li>
<li>Koch, M. D., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+and+bending+analysis+of+microtubules+by+ROCS+microscopy+and+optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging and bending analysis of microtubules by ROCS microscopy and optical trapping.</a> Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).</li>
<li>Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+single+microtubule+dynamics+using+spatial+light+interference+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of single microtubule dynamics using spatial light interference microscopy.</a> ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).</li>
<li>Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+high-speed+wide-field+imaging+of+single+microtubules+using+interference+reflection+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy.</a> Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).</li>
<li>Mahamdeh, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+interference+reflection+microscopy+for+label-free%2C+high-speed+imaging+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59520(2019).</li>
<li>Voldman, J., Gray, M. L., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microfabrication in biology and medicine.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 1, 401-425 (1999).</li>
<li>Rogers, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF1D+is+a+fast+non-processive+kinesin+that+demonstrates+novel+K-loop-dependent+mechanochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry.</a> The EMBO Journal. 20 (18), 5101-5113 (2001).</li>
<li>Leduc, C., Ruhnow, F., Howard, J., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+fractional+steps+in+cargo+movement+by+the+collective+operation+of+kinesin-1+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 10847-10852 (2007).</li>
<li>Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+microtubules+and+associated+proteins+by+Simultaneous+Interference-Reflection+and+Total-Internal-Reflection-Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic microtubules and associated proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy.</a> arXiv. , (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Badanie regulacji dynamiki mikrotubul przez białka związane z mikrotubulami (MAP) często wymaga jednoczesnego obrazowania mikrotubul i MAP. W tym celu zwykle stosuje się techniki mikroskopii fluorescencyjnej, takie jak TIRF. Są one jednak ograniczone wadami obrazowania fluorescencyjnego, do których należą fotowybielanie, fotouszkodzenia i konieczność znakowania fluoroforowego. Metody bezznacznikowe, takie jak IRM, są odpowiednie do wizualizacji mikrotubul, ale nie są w stanie obrazować pojedynczych fluoroforów. Protokół ten łączy bezznacznikowe obrazowanie IRM i mikroskopię TIRF w celu jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i MAP.
Konfiguracja IRM wykorzystuje źródło oświetlenia LED filtrowane do >600 nm, podczas gdy konfiguracja TIRF wykorzystuje laser 488 nm. Użyliśmy niedrogiego rozdzielacza wiązki płytkowej, aby odbić światło świetlne na próbkę i przesłać zebrany sygnał do detektora (ilustracja 1). Wybrano rozdzielacz wiązki o 10% współczynniku odbicia i 90% transmisji, aby zminimalizować straty sygnału pojedynczej cząsteczki. Utrata 90% natężenia światła oświetleniowego jest kompensowana poprzez zwiększenie mocy lasera oświetleniowego i diody LED. 
Separację spektralną sygnałów uzyskano za pomocą rozdzielacza wiązki 90/10 (R/T) oraz dwóch filtrów spektralnych (długoprzepustowy 600 nm dla IRM i pasmowo-przepustowy 535/50 nm dla TIRF). Oddzielone spektralnie sygnały IRM i TIRF są rzutowane na dwie połówki pojedynczego układu kamery za pomocą zespołu rozdzielacza obrazu. Zastosowanie rozdzielacza wiązki 90/10 poświęca 90% sygnału IRM, ale jest to kompensowane poprzez zwiększenie intensywności źródła oświetlenia LED. Lustro dichroiczne może być również wykorzystane do skuteczniejszego oddzielania sygnałów IRM i TIRF. Mikrogranulki fluorescencyjne zawarte w testach umożliwiają dokładne wyrównanie obrazów TIRF i IRM oraz służą jako punkt odniesienia przy ustawianiu ostrości obiektywu.
Najbardziej krytycznym elementem optycznym w tym protokole jest obiektyw o dużej aperturze numerycznej (NA). Jest to niezbędne nie tylko do uzyskania całkowitego odbicia wewnętrznego, ale także do maksymalizacji wydajności zbierania i kontrastu obrazu. Jakość uzyskanych obrazów zależy również od czystości powierzchni szkła i uzyskania wyraźnego obrazu tła w celu skorygowania nierównomiernego oświetlenia i usunięcia cech statycznych. Do obrazowania IRM zalecamy stosowanie oświetlenia o dużej długości fali (>600 nm), aby zminimalizować fotouszkodzenia mikrotubul i białek. Jest to szczególnie ważne, jeśli używane jest białe źródło światła LED, w którym to przypadku należy dołączyć filtr długoprzepustowy, aby usunąć wszelkie światło UV. 
Protokół ten pozwala na bezznacznikowe, szybkie obrazowanie dynamicznych mikrotubul i jednoczesną wizualizację fluorescencyjnych map o wysokiej rozdzielczości17. W porównaniu z techniką przełączania kostek filtrujących, która naprzemiennie przechwytuje obrazy mikrotubul i map, ta konfiguracja jest w stanie uzyskać znacznie większą liczbę klatek na sekundę, ponieważ nie zależy od fizycznego obrotu kostki filtra. W porównaniu z dwukolorowymi technikami obrazowania TIRF, technika ta wykorzystuje mniej wymagającą konfigurację optyczną i omija potrzebę znakowania mikrotubul fluoroforem. Podstawowe ograniczenia tej konfiguracji wynikają z obrazowania TIRF MAPów; Liczba klatek na sekundę jest ograniczona przez czas ekspozycji fluoroforu, a fotowybielanie fluoroforów pozostaje możliwe. Niemniej jednak protokół ten ulepsza istniejące techniki, ponieważ wykorzystuje TIRF tylko wtedy, gdy jest to konieczne (tj. do wizualizacji MAP, ale nie mikrotubul) i osiąga najwyższą możliwą prędkość w granicach TIRF. Dalsze ulepszenia są możliwe tylko wtedy, gdy zarówno mikrotubule, jak i MAP są wizualizowane za pomocą techniki interferometrycznej, ale wymaga to znakowania MAP nanocząstkami metali, co ma swoje ograniczenia i wyzwania eksperymentalne.
Aby zademonstrować możliwości tej techniki, jednocześnie zwizualizowaliśmy dwa szybkie procesy dynamiczne za pomocą IRM i TIRF: kurczenie się mikrotubuli i chodzenie fluorescencyjnej cząsteczki kinezyny. Technika ta była wcześniej stosowana do wizualizacji szybkiej dyfuzji spadyny na kurczących się mikrotubulach5. Poza tym zastosowaniem do MAT i mikrotubul, protokół ten może być używany do wizualizacji pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych jednocześnie o dowolnej strukturze makromolekularnej wystarczająco masywnej, aby można ją było uwidocznić za pomocą IRM, takiej jak błona komórkowa lub włókno aktynowe.

Mikroskopia TIRF (Total-internal-reflection-fluorescence) jest powszechnie stosowana do wizualizacji pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych. W porównaniu z obrazowaniem epifluorescencyjnym, TIRF osiąga lepszą supresję tła, umożliwiając lokalizację i śledzenie pojedynczych fluoroforów w wysokiej rozdzielczości. Z tego powodu TIRF jest preferowaną metodą wizualizacji znakowanych fluorescencyjnie białek związanych z mikrotubulami i jest często używana do obrazowania mikrotubul1,2.
Aby zbadać regulację dynamiki mikrotubul przez MAP, często konieczne jest jednoczesne obrazowanie zarówno mikrotubul, jak i MAP. Większość istniejących metod do tego celu jest kosztowna lub ma wady techniczne. Na przykład jednoczesny dwukolorowy TIRF wymaga dwóch laserów wzbudzających i dwóch kamer. Oprócz wysokich kosztów, konieczność stosowania oddzielnych kamer stwarza problemy z synchronizacją klatek i rejestracją obrazu. Tę potrzebę można obejść, jeśli obracająca się kostka filtrująca jest używana do fizycznego przełączania między laserami wzbudzenia w kolejnych klatkach3. W takiej konfiguracji można użyć pojedynczego układu kamery, a klatki naprzemiennie zmieniają się między obrazami mikrotubul i MAP. Ta technika jest jednak ograniczona przez szybkość wymiany filtra, która zazwyczaj ogranicza liczbę klatek na sekundę do mniej niż 0,5 klatki na sekundę3 (fps). Taka liczba klatek na sekundę jest niewystarczająca do rozwiązania szybkich procesów dynamicznych, takich jak kurczenie się mikrotubuli zachodzące z prędkością do 500 nm/s, chodzenie kinezyny z prędkością rzędu 800 nm/s, czy dyfuzja MAP zachodząca ze współczynnikami dyfuzji przekraczającymi 0,3 μm2/s4. Jest to szczególnie problematyczne podczas śledzenia względnych pozycji dwóch ruchomych celów w każdym kanale, takich jak położenie MAP względem położenia ruchomej końcówki mikrotubul5.
Oprócz tych ograniczeń optycznych, dwukolorowa mikroskopia TIRF wymaga, aby MAP i mikrotubule były oznaczone różnymi fluoroforami, których widma emisyjne są wystarczająco oddzielone. Fluorescencyjne znakowanie tubuliny może zmienić dynamikę mikrotubul6, a fotowybielanie fluoroforów ogranicza szybkość obrazowania7. Z powodu tych problemów opracowano techniki obrazowania bez znaczników w celu wizualizacji mikrotubul. Należą do nich: interferometryczna mikroskopia rozpraszania (iSCAT)8,9, mikroskopia rotaccyjno-koherentno-rozpraszająca (ROCS)10, przestrzenna mikroskopia interferencyjna światła (SLIM)11, oraz mikroskopia interferencyjna (IRM)12,13. Techniki te umożliwiają szybkie obrazowanie mikrotubul bez znaczników bez wad obrazowania fluorescencyjnego, ale nie można ich używać do wizualizacji pojedynczych MAP.
Spośród tych technik bez etykiet, IRM wyróżnia się niskim kosztem i skromnymi wymaganiami dotyczącymi oprzyrządowania. Niedawno zaprezentowaliśmy protokół łączenia IRM z komercyjnym mikroskopem TIRF, umożliwiający obrazowanie mikrotubul i fluorescencyjnych MAP w naprzemiennych ramkach3,13. W tym artykule przedstawiono protokół modyfikacji tej konfiguracji w celu jednoczesnego przechwytywania obrazów TIRF i IRM na jednym chipie kamery. Polega to na dodaniu niedrogiego rozdzielacza wiązki na ścieżce wzbudzenia, aby jednocześnie oświetlić próbkę za pomocą lasera TIRF i źródła światła LED IRM. Zmodyfikowany komercyjny rozdzielacz obrazu służy do spektralnego oddzielania sygnałów TIRF i IRM i rzutowania ich na oddzielne połówki tego samego układu kamery. Stosujemy również system mikroprzepływowy, który pozwala na szybką wymianę odczynników podczas obrazowania. Ten protokół opisuje, w jaki sposób ta konfiguracja może być używana do obrazowania dynamicznych mikrotubul i MAP. Możliwości aparatu zostały zademonstrowane poprzez przedstawienie pierwszej wizualizacji białek kinezyny-1 chodzących po kurczących się mikrotubulach, która jest rejestrowana z szybkością 10 klatek na sekundę.

<table><tbody><tr><td>Rozdzielacz wiązki 10/90 (R/T)</td><td>Thorlabs</td><td>BSN10R</td><td>Płaski rozdzielacz wiązki stosowany w ścieżce wiązki wzbudzenia</td></tr><tr><td>Rozdzielacz wiązki 90/10 (R/T)</td><td>Thorlabs</td><td>BSX10R</td><td>Płaski rozdzielacz wiązki stosowany w rozdzielaczu obrazu</td></tr><tr><td>Przeciwciało antybiotynowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3640</td><td>Służy do funkcjonalizacji powierzchni do klejenia biotynylowanych mikrotubul</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FLAAS</td><td>Służy do przygotowania bufora ruchliwości</td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Newport</td><td>HPM535-50</td><td>Filtr pasmowy z twardą powłoką jest używany w rozdzielaczu obrazu do obrazowania sygnału GFP</td></tr><tr><td>Biotynylowany cytoszkielet tubuliny</td><td>, Inc.</td><td>T333P-A</td><td>Służy do wiązania nasion mikrotubul z powierzchnią kanału przepływowego</td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8654</td><td>Kazeina służy do blokowania oddziaływań niespecyficznych</td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td>Służy do przygotowania roztworu pochłaniacza tlenu</td></tr><tr><td>Komora eksykatora</td><td>Southern Labware</td><td>55207</td><td>Eksykator służy do odgazowywania żywicy</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>Służy do przygotowania roztworu pochłaniacza tlenu</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Służy do przygotowania buforu BRB80</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>Służy do przygotowania roztworu pochłaniacza tlenu</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7016</td><td>Służy do przygotowania roztworu pochłaniacza tlenu</td></tr><tr><td>Nukleotydy</td> <td>GMPCPPJena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td>Służy do polimeryzacji stabilizowanych mikrotubul</td></tr><tr><td>Rozdzielacz obrazu</td><td>Teledyne-Photometrics Imaging</td><td>OptoSplit II</td><td>Rozdzielacz obrazu służy do przestrzennego dzielenia obrazów. Kupując, upewnij się o kompatybilności z mikroskopem</td></tr><tr><td>ImajeJ2</td><td>NIH</td><td></td><td>ImageJ2 służy do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Kinezyna</td><td></td><td></td><td>przygotowana we własnym zakresie (patrz referencje w tekście)</td></tr><tr><td>Rurki LDPE Thomas</td><td>Scientific</td><td>9565S22</td><td>Nietoksyczna rurka z polietylenu o mniejszej gęstości z mikrootworem służy do przenoszenia płynów</td></tr><tr><td>Źródło światła LED</td><td>Lumencor</td><td>Lumencor sola silnik świetlny</td><td>Używany do obrazowania IRM</td></tr><tr><td>Filtry długoprzepustowe</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0600</td><td>Filtry długoprzepustowe z twardą powłoką. Jeden jest używany jako filtr wzbudzenia, drugi jest używany w rozdzielaczu obrazu do obrazowania sygnału IRM</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td>Służy do przygotowania bufora BRB80</td></tr><tr><td>Grzałka obiektywu mikoskopowego</td><td>OKOLAB</td><td>H401-T-DUAL-BL</td><td>Służy do utrzymywania stałej temperatury próbki poprzez ogrzewanie obiektywu</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td>Odwrócony mikroskop, który jest używany w eksperymentach</td></tr><tr><td>Na-PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2949</td><td>Służy do przygotowania bufora BRB80</td></tr><tr><td>Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Obiektyw olejowy</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>Obiektyw do obrazowania ma aperturę numeryczną 1,49</td></tr><tr><td>PDMS i utwardzacz</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>Sylgard 184 (24236-10)</td><td>Służy do konstruowania kanałów przepływowych</td></tr><tr><td>Dziurkacz PDMS</td><td>World Precision Instruments LLC</td><td>504529</td><td>Służy do wybijania otworów w PDMS</td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmowego</td><td>Harrick Plasma</td><td>DPC-32G</td><td>Plazma powietrzna służy do usuwania zanieczyszczeń organicznych z powierzchni PDMS</td></tr><tr><td>Poloxamer 407 (nazwa handlowa Pluronic F-127)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2443</td><td>Służy do pasywacji powierzchni kanału w celu zminimalizowania niespecyficznego wiązania</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td>Używany do przygotowania Bufor BRB80</td></tr><tr><td>Stabilizowane mikrotubule</td><td></td><td></td><td>przygotowane we własnym zakresie (patrz referencje w tekście)</td></tr><tr><td>Ultrawirówka stołowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>340400</td><td>Służy do odkręcania nasion mikrotubul</td></tr><tr><td>Koraliki TetraSpeck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T7279</td><td>Używany jako odniesienie do wyrównywania obrazów</td></tr><tr><td>Aparat fotograficzny Zyla 4.2</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2</td><td>Naukowa kamera CMOS ze specyfikacją: 2048 x 2048 pikseli (6,5 &mu; m rozmiar piksela) z wydajnością kwantową 72% i 16-bitowym zakresem dynamiki</td></tr></tbody></table>

mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Zastosowano kilka technik do bezpośredniej wizualizacji włókien cytoszkieletu i związanych z nimi białek. Mikroskopia TIRF (Total internal-reflection-fluorescence) ma wysoki stosunek sygnału do tła, ale cierpi z powodu fotowybielania i fotouszkodzenia białek fluorescencyjnych. Techniki bezznacznikowe, takie jak mikroskopia interferencyjna i refleksyjna (IRM) i interferometryczna mikroskopia rozpraszania (iSCAT), omijają problem fotowybielania, ale nie są w stanie łatwo uwidocznić pojedynczych cząsteczek. W artykule przedstawiono protokół łączenia IRM z komercyjnym mikroskopem TIRF do jednoczesnego obrazowania białek związanych z mikrotubulami (MAP) i dynamicznych mikrotubul in vitro. Protokół ten pozwala na szybką obserwację MAP oddziałujących z dynamicznymi mikrotubulami. Stanowi to ulepszenie istniejących dwukolorowych konfiguracji TIRF, eliminując zarówno potrzebę znakowania mikrotubul, jak i potrzebę stosowania kilku dodatkowych komponentów optycznych, takich jak drugi laser wzbudzający. Oba kanały są obrazowane na tym samym chipie kamery, aby uniknąć problemów z rejestracją obrazu i synchronizacją klatek. Ten układ jest demonstrowany poprzez wizualizację pojedynczych cząsteczek kinezyny chodzących po dynamicznych mikrotubulach.

Układ optyczny przedstawiono schematycznie na Rysunku 1. Zarówno światło oświetlające w trybie IRM, jak i światło wzbudzające w trybie TIRF są kierowane na tylną aperturę obiektywu (100x, NA: 1.49) za pomocą dzielnika wiązki 10/90 (R/T) (BS1). Emitowany sygnał przechodzi przez ten sam dzielnik wiązki (BS1) i jest odbijany do dzielnika obrazu za pomocą lustra (M1). Elementy dzielnika obrazu (obwiedzione przerywanymi liniami na Rysunku 1) oddzielają sygnały IRM i TIRF za pomocą dzielnika wiązki 90/10 (R/T) (BS2) wraz z odpowiednimi filtrami spektralnymi. Ostatecznie rozdzielone obrazy są rzutowane na matrycę kamery w celu wizualizacji. Ustawienie dzielnika obrazu jest takie, że sygnały TIRF i IRM są rzutowane na oddzielne połowy matrycy.
W prawidłowo skalibrowanym mikroskopie obraz z kamery powinien być podzielony na pół, jak przedstawiono na Rysunku 2. Mikrotubule związane z powierzchnią powinny być wyraźnie widoczne w kanale IRM13, natomiast fluorescencyjna kinezyna powinna być widoczna w kanale TIRF.
Mikrokulki użyte do wyrównania i rejestracji dwóch kanałów pojawiają się jako jasne punkty na obrazach TIRF i ciemne punkty na obrazach IRM. Chociaż kulki są widoczne w surowych danych, odjęcie tła znacząco poprawia kontrast (Rysunek 2). Obraz tła wykorzystany do odjęcia jest medianą czasową filmu zarejestrowanego przy przesuwającym się stoliku. Zgodnie z opisem w protokole, wyrównanie obrazów wykonano poprzez wybranie grupy kulek w pobliżu obszaru zainteresowania i uruchomienie dostarczonego makra (imageSplitterRegistration.ijm). Makro dopasowuje punkty do rozkładów Gaussa i wyrównuje obrazy poprzez minimalizację średniej odległości między punktami centralnymi dopasowań w każdym kanale. Proces ten przedstawiono na Rysunku 2, który ukazuje prawidłowe wyrównanie fluorescencyjnych mikrokulek (zielone w kanale TIRF, czarne w kanale IRM).
Wreszcie możliwości tej konfiguracji obrazowania symultanicznego zostały zademonstrowane poprzez obserwację pojedynczych cząsteczek kinezyny poruszających się w kierunku kurczących się końców mikrotubul. Rysunek 3 przedstawia kymograf cząsteczek kinezyny znakowanych eGFP (zielone) poruszających się po kurczącej się mikrotubuli (szara). Przedstawiono również serię klatek z nagrania, na podstawie którego wygenerowano kymograf.
<img alt="Układ mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem do badania ruchliwości mikrotubul; schemat optyczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przedstawienie układu optycznego do jednoczesnego obrazowania IRM i TIRF ruchliwości kinezyny. Epiiluminacja ze źródła światła LED przechodzi przez przysłonę apertury i dociera do dzielnika wiązki (BS1) 10/90 (R/T). Dzielnik wiązki częściowo odbija czerwone światło iluminacyjne IRM oraz światło wzbudzenia TIRF o długości 488 nm w stronę obiektywu w celu oświetlenia próbki. Sygnał z próbki jest zbierany przez ten sam obiektyw i kierowany do zespołu rozdzielającego obraz, gdzie obrazy IRM i TIRF są rozdzielone przestrzennie przez dzielnik wiązki (BS2) 90/10 (R/T). Sygnały są następnie filtrowane spektralnie przed dotarciem do matrycy kamery. Skróty: IRM = mikroskopia refleksyjna interferencyjna; TIRF = fluorescencja z całkowitym wewnętrznym odbiciem; LED = dioda emitująca światło; ITIRF = iluminacja TIRF; IGFP = fluorescencja GFP; Iinc = iluminacja IRM; Iref = światło rozproszone na granicy szkło/woda; Iscat = światło rozproszone przez mikrotubulę; IIRM = sygnał IRM (interferencja Iref i Iscat); R/T = odbite/przeszkolone; LP600: filtr długoprzepustowy (600 nm); DM = lustro dichroiczne; BS1 i BS2 = dzielniki wiązki 1 i 2; M1, M2, M3, M4 = lustra; BP535/50 = filtr pasmowy (535/50 nm); GFP = zielone białko fluorescencyjne; GMPCPP = guanylylowy 5'-α,β-metylenodifosfonian; GDP = guanozynodifosforan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces kamery TIRF-IRM, od obrazu surowego do wyrównanego, skupienie na odejmowaniu tła, analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Odejmowanie tła i wyrównanie obrazów. Obrazy TIRF (lewa połowa) i IRM (prawa połowa) pojawiają się jednocześnie na dwóch połowach tej samej matrycy kamery (obraz z kamery). Czasowa mediana odejmowania tła zwiększa kontrast kulek (obraz z odjętym tłem), które w obrazach IRM są ciemne, a w obrazach TIRF jasne. Obrazy IRM i TIRF są wyrównywane poprzez translację (po prawej) na podstawie lokalizacji wybranych kulek (białe prostokąty). Paski skali = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat kymografu; analiza ruchu komórki w czasie z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Kymograf i migawki ruchu kinezyn podczas skracania się mikrotubul. Kymograf (po lewej) przedstawia eGFP-kinezynę-1 (kolor zielony) poruszającą się w stronę końca plus mikrotubuli (ciemnoszary). Po prawej przedstawiono migawki z odpowiadającej im serii czasowej. Białe strzałki wskazują pojedyncze cząsteczki kinezyny-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Plik ImageSplitterRegistration: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/ImageSplitterRegistration.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Znaczenie tej metody polega na tym, że umożliwia ona obrazowanie mikrotubul bez znaczników jednocześnie z białkami znakowanymi fluorescencyjnie z dużą liczbą klatek na sekundę. Główną zaletą tej techniki jest jej łatwa implementacja i minimalne wymagania dotyczące komponentów optycznych. Omija również potrzebę znakowania mikrotubul fluoro-4.Na początek należy przygotować polimer PDMS, łącząc utwardzacz i elastomer bazowy w stosunku masowym 1:10. Mieszaj je przez dwie minuty, a następnie odgazowuj mieszaninę w komorze próżniowej, aż wszystkie pęcherzyki znikną. Następnie wylej mieszaninę na formę główną warstwą o grubości około 0,5 centymetra, uważając, aby nie tworzyć bąbelków, i piecz mieszaninę w piekarniku nagrzanym do 70 stopni Celsjusza przez 40 minut.Następnie wytnij strukturalne obszary polimeru i przebij otwory na każdym końcu kanału za pomocą dziurkacza PDMS. Później oczyść strukturalną stronę bloku PDMS. Następnie spłucz trzykrotnie izopropanolem i metanolem, a następnie ultraczystą wodą i wysusz powierzchnię suszarką.Następnie należy oczyścić plazmowo PDMS za pomocą plazmy tlenowej lub powietrznej i umieścić oczyszczony plazmowo PDMS na odpowiednio oczyszczonym szkle nakrywkowym. Podgrzej go na płycie grzejnej w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 15 minut. Włóż do otworów rurkę z polietylenu o niskiej gęstości o odpowiedniej wielkości i podłącz rurkę wylotową do strzykawki o pojemności 0,5 mililitra.Następnie wlej roztwory do mikrokanalików, zanurzając rurkę wlotową w roztworze i pobierając wymaganą objętość za pomocą strzykawki. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i włącz źródło światła epi-illumination do obrazowania IRM. Aby ustawić ostrość mikroskopu, poszukaj właściwej płaszczyzny ogniskowej w pobliżu interfejsu rozwiązania PDMS i wybierz pole widzenia w pobliżu środka kanału.Następnie należy przygotować 0,1-mikromolowy roztwór mikrogranulek fluorescencyjnych w BRB80 i przepuścić co najmniej jedną objętość kanału roztworu mikrogranulek. Monitoruj reakcję za pomocą IRM lub TIRF. Po osiągnięciu pożądanej gęstości mikrogranulek zmyj nadmiar BRB80.Przelej rozcieńczone nasiona do komory reakcyjnej i monitoruj reakcję za pomocą IRM. Po osiągnięciu pożądanej gęstości nasion zmyj nadmiar BRB80. Następnie należy przygotować mieszaninę do przedłużania mikrotubul zawierającą 12-mikromolową nieznakowaną tubulinę, jednomilimolową GTP, pięciomilimolową DTT w buforze BRB80.Następnie przelej co najmniej jedną objętość kanałową mieszaniny przedłużającej, upewniając się, że temperatura reakcji wynosi 28 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć, ustaw ustawienia obrazowania w oprogramowaniu mikroskopu. Rozpocznij obrazowanie i wlej roztwór kinezyny do komory.Następnie wyobraź sobie niekurczliwe mikrotubule kinezyny 1 oznaczone GFP. Po zakończeniu pomiaru nagraj krótki film, w którym stolik jest powoli przesuwany ruchem okrężnym lub bocznym. Mediana projekcji tego filmu posłuży jako obraz tła i zostanie odjęta od surowych pomiarów.Utwórz projekcję mediany w ImageJ z nagrania w tle, klikając Obraz. Następnie wybierz opcję Stosy i kliknij Z Project. Następnie odejmij medianę projekcji tła od surowych danych obrazu, klikając Proces, a następnie wybierz opcję Kalkulator obrazu, upewniając się, że zaznaczyłeś opcję 32-bitowego wyniku zmiennoprzecinkowego.Aby zarejestrować obraz, wybierz kolekcję mikrokulek w pobliżu interesującej nas mikrotubuli i użyj ich do wyrównania obrazów TIRF i IRM. Dla każdego ściegu w tej kolekcji użyj narzędzia do zaznaczania wielopunktowego, aby zaznaczyć przybliżone położenie w kanale TIRF, a następnie odpowiadające mu położenie w kanale IRM. Następnie uruchom dostarczone makro ImageJ.Mikrogranulki pojawiają się jako ciemne plamy w kanale IRM po prawej stronie i jako jasne punkty w kanale TIRF po lewej stronie. Procedura wyrównywania prawidłowo nakłada się na dwa kanały, lokalizując wybrane koraliki. Przy użyciu tego protokołu uzyskano również kymogram cząsteczek kinezyny znakowanych EGFP poruszających się w kierunku kurczących się końców mikrotubul.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wybrać obiektywy o dużej aperturze numerycznej, aby uzyskać całkowite odbicie wewnętrzne, a także zmaksymalizować wydajność zbierania i kontrast obrazu. Metoda ta może być stosowana do obrazowania w wysokiej rozdzielczości pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych jednocześnie w strukturze makromolekularnej wystarczająco masywnej, aby można ją było uwidocznić za pomocą IRM, takiej jak błona komórkowa lub włókno aktynowe. Protokół ten zapewnia również łatwą do dostosowania procedurę jednoczesnego obrazowania z dowolną kombinacją IRM, TIRF i epifluorescencji.

simultaneous-interference-reflection-total-internal-reflection

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii interferencyjnej (IRM) do wizualizacji mikrotubul rosnących na powierzchni szkiełka nakrywkowego w obecności odpowiedniego bufora. Po oświetleniu padającym światłem, interfejs szkiełko nakrywkowe-bufor i interfejs bufor-mikrotubula odbijają światło, które łączy się, tworząc wzór interferencyjny, umożliwiając wizualizację mikrotubul jako obrazów o wysokim kontraście na jasnym tle.

Interferencyjna mikroskopia refleksyjna do bezznacznikowej wizualizacji dynamiki mikrotubul

Źródło: Winkle, C. C., et al. Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia mikroskopię fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych w neuronach korowych. Wrażliwy na pH marker białka zielonej fluorescencji (GFP) fluoryzuje po fuzji pęcherzyków, z selektywnym wzbudzeniem TIRF wychwytującym egzocytozę...

Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego odbicia wewnętrznego do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych 

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Ten protokół jest przewodnikiem do implementacji mikroskopii odbicia interferencyjnego na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym do bezznacznikowego, kontrastowego, szybkiego obrazowania mikrotubul przy użyciu testów powierzchni in vitro.

Implementacja mikroskopii interferencyjnej odbiciowej do bezznacznikowego, szybkiego obrazowania mikrotubul

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Poznaj metodę łączącą mikroskopię IRM i TIRF do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek. Technika umożliwia badanie interakcji kinezyny z mikrotubulami bez konieczności znakowania fluoroforami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek (Wideo) | JoVE Journal

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Przeglądaj więcej filmów