Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Układy mikrotubul komórkowych zawierają subpopulacje mikrotubul o odrębnych właściwościach dynamicznych wymaganych do działania. Protokół ten odnosi się do tego, w jaki sposób zbiorowa aktywność regulatorów nadaje subpopulacjom bliższych mikrotubul odrębne właściwości. Ten oddolny test restytucji pozwala nam jednocześnie zwizualizować organizację i dynamikę proksymalnych populacji mikrotubul, takich jak pojedyncze mikrotubule i wiązki, oraz rozszyfrować mechanizmy leżące u podstaw ich samoorganizacji.

Rekonstytucja wieloskładnikowa wymaga optymalizacji parametrów eksperymentalnych, takich jak pH, siła jonowa i stężenie białka, przy jednoczesnym zachowaniu aktywności każdego z nich. Systematyczna analiza poszczególnych składników przed testami wielobiałkowymi jest niezwykle pomocna. Na początek należy odpipetować mieszaninę 4,5 mikrolitra BRB ADDTT w jednym mikrolitrze roztworu mikrotubul na szkiełko mikroskopowe.

Przykryj szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 na 18 milimetrów i uszczelnij krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci lub uszczelniaczem VALAP. Umieścić obiektyw TIRF pod szkiełkiem nakrywkowym. Wizualizuj nowo spolimeryzowane mikrotubule na długości fali odpowiedniej dla fluorescencyjnie znakowanej tubuliny w jasnej mieszance, aby określić, jakie rozcieńczenie mikrotubul zastosować w nadchodzących eksperymentach.

Określ empirycznie intensywność lasera w eksperymencie tak, aby wszystkie białka fluorescencyjne były oświetlone, ale nie były poddawane znacznemu fotowybielaniu w trakcie trwania eksperymentu. Ustaw temperaturę mikroskopu na 28 stopni Celsjusza, aby view dynamiczne mikrotubule. Użyj papieru do soczewek, aby wyczyścić obiektyw 100X z 70% etanolem.

Użyj najlepszej kombinacji kostek filtrujących i filtrów emisyjnych w zależności od kanałów fluorescencyjnych, które mają być zobrazowane. Skonfiguruj sekwencję obrazowania. W przypadku eksperymentu z biotynylowanymi mikrotubulami znakowanymi fluoroforem o długości 647 nanometrów, niebiotynylowanymi mikrotubulami znakowanymi fluoroforem o długości 560 nanometrów w rozpuszczalnej tubulinie i białkiem znakowanym GFP, należy zobrazować kanały o długości 488 nanometrów, 560 nanometrów i 647 nanometrach co 10 sekund przez 20 dowolnych minut.

Aby uchwycić obraz referencyjny wiązek przed dodaniem rozpuszczalnej tubuliny i białka związanego z mikrotubulami, należy ustawić sekwencję z jednym obrazem w kanałach o długości fali 560 nanometrów i 647 nanometrów. Sprawdź położenie wiązki laserowej na suficie nad mikroskopem i wprowadź zmiany w wiązce za pomocą oprogramowania. Upewnij się, że oświetlacz laserowy jest wyrównany.

Przed obrazowaniem dodaj do obiektywu kroplę olejku immersyjnego do mikroskopu. Przygotuj rozpuszczalną mieszaninę tubuliny, trzymając ją na lodzie i odkręć mieszaninę. Aby unieruchomić mikrotubule za pomocą wiązania biotyna-NeutrAwidyna-biotyna, najpierw wlej około 7,5 mikrolitra roztworu NeutrAwidyny, aż komora zostanie napełniona i inkubuj przez pięć minut.

Umyć 10 mikrolitrami MB na zimno. Przelej 7,5 mikrolitra białka blokującego KC i inkubuj przez dwie minuty. Umyć 10 mikrolitrami MB na ciepło, aby przygotować komorę do wprowadzenia mikrotubul.

Rozcieńczyć zapas biotynylowanych mikrotubul w BRB ADDTT i dodać jeden mikrolitr tego rozcieńczenia do dziewięciu mikrolitrów ciepłego MB. Wlej mieszaninę do komory i inkubuj przez 10 minut. Nieunieruchomione mikrotubule zmyć 10 mikrolitrami MB ciepła.

Wlej 7,5 mikrolitra ciepłego KC do komory i inkubuj przez dwie minuty. Podczas inkubacji należy przygotować dwunanomolowy roztwór usieciowania krzyżowego lub białka PRC1 w KC i odwirować roztwór. Przelać 10 mikrolitrów tego roztworu do komory obrazowania i inkubować przez pięć minut.

Aby zrobić wiązki, wlej 10 mikrolitrów niebiotynylowanych mikrotubul do komory i inkubuj przez 10 minut. Umyj komorę dwukrotnie 10 mikrolitrami MB na ciepło. Podczas 10-minutowego czasu inkubacji przygotuj 10 mikrolitrów mieszaniny testowej zawierającej interesujące Cię białka, rozpuszczalną tubulinę, nukleotydy, zmiatacze tlenu i przeciwutleniacze i odwiruj ją.

Trzymaj mieszaninę na lodzie. Załaduj przygotowaną komorę obrazowania przyklejoną taśmą do uchwytu szkiełka obiektywu 100X TIRF. Użyj kanałów 560 nanometrów i 647 nanometrów, aby znaleźć pole widzenia, które zawiera optymalną liczbę i gęstość pojedynczych mikrotubul i wiązek.

Po zidentyfikowaniu pola widzenia wykonaj zdjęcie referencyjne. Ostrożnie wlać mieszaninę testową, nie naruszając pracy komory obrazowania. Uszczelnij otwarte końce komory uszczelniaczem VALAP.

Obserwuj mikrotubule i rozpocznij sekwencję obrazowania. Po unieruchomieniu nasion mikrotubul i wygenerowaniu wiązek uzyskano obrazy fluorescencyjne. Pojedyncze mikrotubule zostały zidentyfikowane na podstawie sygnału fluorescencyjnego w kanale 647 nanometrów, podczas gdy mikrotubule zostały zidentyfikowane jako wstępnie uformowane wiązki, gdy wyświetlały sygnały fluorescencyjne w obu kanałach.

Badano dynamikę pojedynczych mikrotubul i usieciowanych wiązek PRC1 w obecności białek KIF4A i CLASP1, które ujawniły, że pojedyncze mikrotubule wydłużają się w trakcie testu, podczas gdy wzrost usieciowanych mikrotubul jest zahamowany. Należy uważać, aby spolimeryzowane mikrotubule utrzymywały temperaturę pokojową lub wyższą. Rozpuszczalną tubulinę należy przechowywać na lodzie i chronić komorę obrazowania oraz znakowane fluorescencyjnie mikrotubule i białka przed światłem.

Testy te dostarczyły mechanistycznego wglądu w to, w jaki sposób moduł białkowy znajdujący się na wrzecionie mitotycznym może w różny sposób regulować dynamikę dwóch różnych populacji mikrotubul, które współistnieją we wrzecionie.