Name: Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Poznaj metodę TIRF do jednoczesnej wizualizacji dynamiki pojedynczych mikrotubul i wiązek in vitro. Ta technika pozwala badać mechanizmy samoorganizacji mikrotubul i aktywność białek związanych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem z NIH (nr 1DP2GM126894-01) oraz funduszami z Pew Charitable Trusts i Smith Family Foundation dla R.S. Autorzy dziękują dr Shuo Jiangowi za jego wkład w rozwój i optymalizację protokołów.

<ol><li>Subramanian, R., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+complexity%3A+insights+into+self-organized+assembly+of+microtubule-based+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures.</a> Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).</li>
<li>Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+properties+of+neuronal+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Stability properties of neuronal microtubules.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).</li>
<li>Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+determine+and+maintain+Drosophila+bristle+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape.</a> Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).</li>
<li>Foe, V. E., von Dassow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+dynamic+microtubules+coordinately+shape+the+myosin+activation+zone+during+cytokinetic+furrow+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).</li>
<li>Pous, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+of+stable+and+dynamic+microtubules+in+protein+traffic+in+WIF-B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells.</a> The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).</li>
<li>Uehara, R., Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+central+spindle+assembly+requires+de+novo+microtubule+generation+in+the+interchromosomal+region+during+anaphase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+microtubule+plus-end+tracking+system+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro.</a> Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).</li>
<li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li>
<li>Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pushing+and+braking+forces+generated+by+ensembles+of+Kinesin-5+crosslinking+two+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules.</a> Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).</li>
<li>Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+single+microtubules+and+bundles+by+a+three-protein+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module.</a> Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).</li>
<li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GTP+hydrolysis+in+microtubule+dynamics%3A+information+from+a+slowly+hydrolyzable+analogue%2C+GMPCPP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).</li>
<li>Subramanian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+antiparallel+microtubule+crosslinking+by+PRC1%2C+a+conserved+nonmotor+microtubule+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein.</a> Cell. 142 (3), 433-443 (2010).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Wijeratne, S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+of+antiparallel+microtubule+bundles+regulates+relative+sliding+and+stalling+by+PRC1+and+Kif4A%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A.</a> eLife. 7, 32595(2018).</li>
<li>Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micron-scale+geometrical+features+of+microtubules+as+regulators+of+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization.</a> eLife. 10, 63880(2021).</li>
<li>Freal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback-driven+assembly+of+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Feedback-driven assembly of the axon initial segment.</a> Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).</li>
<li>Ledbetter, M., Porter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bmicrotubule%26%2334%3B+in+plant+cell+fine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A &#34;microtubule&#34; in plant cell fine structure.</a> The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).</li>
<li>Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+reveals+distinct+protofilament-scale+structural+dynamics+in+depolymerizing+microtubule+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119(2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Opisany tutaj eksperyment znacznie rozszerza zakres i złożoność konwencjonalnych testów rekonstytucji mikrotubul, które tradycyjnie wykonuje się na pojedynczych mikrotubulach lub na jednym typie matrycy. Obecny test zapewnia metodę jednoczesnego ilościowego określania i porównywania regulacyjnej aktywności MAP w dwóch populacjach, a mianowicie pojedynczych mikrotubulach i usieciowanych wiązkach. Co więcej, test ten pozwala na zbadanie dwóch rodzajów wiązek: tych, które są wstępnie uformowane ze stabilnych nasion przed za...

Mikrotubule to biopolimery, które tworzą strukturalne rusztowania niezbędne dla wielu procesów komórkowych, począwszy od transportu wewnątrzkomórkowego i pozycjonowania organelli, a skończywszy na podziale i wydłużaniu komórek. Aby wykonać te różnorodne funkcje, poszczególne mikrotubule są zorganizowane w układy o wielkości mikronów, takie jak wrzeciona mitotyczne, aksonemy rzęskowe, wiązki neuronalne, układy międzyfazowe i układy korowe roślin. Wszechobecnym motywem architektonicznym występującym w tych strukturach jest wiązka mikrotubul usieciowanych na całej ich długości1. Intrygującą cechą kilku struktur opartych na mikrotubulach jest współistnienie mikrotubul wiązkowych i nieusieciowanych pojedynczych mikrotubul w bliskiej odległości przestrzennej. Te subpopulacje mikrotubul mogą wykazywać wyraźnie różną dynamikę polimeryzacji od siebie, w zależności od potrzeb ich prawidłowego funkcjonowania2,3,4,5. Na przykład w obrębie wrzeciona mitotycznego stabilne usieciowane wiązki i dynamiczne pojedyncze mikrotubule są obecne w obszarze skali mikronowej w centrum komórki6. Badanie, w jaki sposób określa się właściwości dynamiczne współistniejących populacji mikrotubul, ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia budowy i funkcji struktur opartych na mikrotubulach.
Mikrotubule to dynamiczne polimery, które cyklicznie przechodzą między fazami polimeryzacji i depolimeryzacji, przełączając się między dwiema fazami w zdarzeniach znanych jako katastrofa i ratunek7. Dynamika mikrotubul komórkowych jest regulowana przez niezliczone białka związane z mikrotubulami (MAP), które modulują szybkość polimeryzacji i depolimeryzacji mikrotubul oraz częstotliwość katastrof i zdarzeń ratunkowych. Badanie aktywności MAP na przestrzennie proksymalnych układach w komórkach jest trudne ze względu na ograniczenia rozdzielczości przestrzennej w mikroskopii świetlnej, zwłaszcza w obszarach o dużej gęstości mikrotubul. Co więcej, obecność wielu MAP w tym samym regionie komórkowym utrudnia interpretację badań biologicznych komórek. Testy rekonstytucji in vitro, wykonywane w połączeniu z mikroskopią fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), pozwalają uniknąć wyzwań związanych z badaniem mechanizmów, za pomocą których określone podzbiory MAP regulują dynamikę proksymalnych macierzy mikrotubul komórkowych. W tym przypadku dynamika mikrotubul złożonych in vitro jest badana w obecności jednego lub więcej rekombinowanych MAP w kontrolowanych warunkach8,9,10. Jednak konwencjonalne testy rekonstytucji są zwykle wykonywane na pojedynczych mikrotubulach lub na jednym typie matrycy, co wyklucza wizualizację współistniejących populacji.
Tutaj prezentujemy testy rekonstytucji in vitro, które umożliwiają jednoczesną wizualizację dwóch populacji mikrotubul w tych samych warunkach roztworu11. Opisujemy metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu MAP na pojedynczych mikrotubulach i na wiązkach mikrotubul usieciowanych przez białko związane z wrzecionem mitotycznym PRC1. Białko PRC1 preferencyjnie wiąże się na nakładaniu się antyrównoległych mikrotubul, sieciując je9. W skrócie, protokół ten składa się z następujących etapów: (i) przygotowanie roztworów podstawowych i odczynników, (ii) czyszczenie i obróbka powierzchni szkiełek nakrywkowych używanych do stworzenia komory obrazowania do eksperymentów mikroskopowych, (iii) przygotowanie stabilnych "zarodków" mikrotubul, z których inicjowana jest polimeryzacja podczas eksperymentu, (iv) specyfikacja ustawień mikroskopu TIRF w celu wizualizacji dynamiki mikrotubul, (v) immobilizacja zarodków mikrotubul i wytwarzanie usieciowanych wiązek mikrotubul w komorze obrazowania oraz (vi) wizualizacja dynamiki mikrotubul w komorze obrazowania za pomocą mikroskopii TIRF, po dodaniu rozpuszczalnej tubuliny, MAP i nukleotydów. Testy te umożliwiają jakościową ocenę i ilościowe badanie lokalizacji MAP i jej wpływu na dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Ponadto ułatwiają one ocenę synergicznego wpływu wielu MAP na te populacje mikrotubul w szerokim zakresie warunków eksperymentalnych.

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy kwas (Trolox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>1,4-piperazynodienasulfonowy kwas (PIPES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>18x18 mm #1.5 szkiełka nakrywkowe&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>63787</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-6250</td><td></td></tr><tr><td>24x60 mm #1.5 szkiełka nakrywkowe</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>405/488/560/647 nm Laser Quad Band&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>TRF89901-NK</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320110</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyno-5'-trifosforan sól disodowa hydrat (ATP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>Avidin, NeutrAvidin&reg; Białko wiążące biotynę (sondy molekularne&reg;)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator do kąpieli: Branson 2800 Cleaner</td><td>Branson</td><td>CPX2800H</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Rury grubościenne z poliwęglanu, 11 x 34 mm</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td></td><td></td>343778</tr><tr><td>Beckman Coulter Rury grubościenne z poliwęglanu, 8 x 34 mm</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td></td><td></td>343776</tr><tr><td>Biotyna-PEG-SVA, MW 5,000</td><td>Laysan Bio</td><td>#Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2905</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Mini mikrowirówka Corning LSE, AC100-240V</td><td>Corning</td><td>6670</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki do delikatnych zadań</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotriitol (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny</td><td>Chroma</td><td>ET610/75m</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (200-proof)</td><td>Decon Labs</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>Kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Bioscience&nbsp;</td><td>NU-405</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli sodowej 5'-trifosforanu guanozyny (GTP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III detergent&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z805939</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny, typ A</td><td>Fisher Scientific</td><td>77010</td><td></td></tr><tr><td>Kappa-kazeina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Lanolina</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25376</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczka do czyszczenia soczewek</td><td>ThorLabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 16 Wirówka stołowa</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, szkło diamentowo-białe, 25 x 75mm, 90&deg; Szlifowane krawędzie, BIAŁY matowy</td><td>globus Scientific</td><td>1380-50W</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-Walerianian sukcynimidylu, MW 5,000&nbsp;</td><td>Laysan Bio</td><td>#NH2-PEG-VA-5K</td><td></td></tr><tr><td>Optima&handel; Ultrawirówka stołowa Max-XP</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td></td><td></td>393315</tr><tr><td>Paraffin</td><td>Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Rewers (samozamykający), Drobna pęseta</td><td>Ted Pella</td><td>5377-NM</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina, Biała</td> Myjka plazmowa <td>Fisher Scientific</td><td>18-605-050</td><td></td></tr><tr><td>, 115V</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Thermal-Lok 1-pozycyjna sucha kąpiel cieplna</td><td>USA Scientific</td><td>2510-1101</td><td></td></tr><tr><td>Blok termiczny Lok do probówek 1,5 i 2,0 ml</td><td>USA Scientific</td><td>2520-0000</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; Pierce&trade; Łamacz obligacji i handel; Roztwór TCEP, neutralne pH; 500mM</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>PI-77720</td><td></td></tr><tr><td>TIRF 100X NA 1.49 Obiektyw olejowy</td><td>Nikon</td><td>CFI Apochromat TIRF 100XC Olej Mikroskop</td><td></td></tr><tr><td>TIRF</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>TLA 120.1 wirnik</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td></td><td></td>362224</tr><tr><td>Wirnik TLA 120.2</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td></td><td></td>357656</tr><tr><td>Białko tubuliny (>99% czystości): mózg świni</td><td>Cytoszkielet</td><td>T240</td><td></td></tr><tr><td>Białko tubuliny (biotyna):</td><td>cytoszkielet</td> mózgu świni <td>T333P</td><td></td></tr><tr><td>Białko tubuliny (fluorescencyjne HiLyte 647):</td><td>cytoszkielet</td> mózgu świni <td>TL670M</td><td></td></tr><tr><td>Białko tubuliny (X-rodamina): mózg bydlęcy</td><td>Cytoszkielet</td><td>TL620M</td><td></td></tr><tr><td>VECTABOND&reg; Odczynnik, wektor adhezji przekroju tkankowego</td><td>Biolabs</td><td>SP-1800-7</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Inkubator osobisty, 120 V, 50/60 Hz, 0,6 A</td><td>VWR</td><td>97025-630</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii tirf

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Mikrotubule to polimery heterodimerów αβ-tubuliny, które organizują się w odrębne struktury w komórkach. Architektury i sieci oparte na mikrotubulach często zawierają podzbiory macierzy mikrotubul, które różnią się właściwościami dynamicznymi. Na przykład w dzielących się komórkach stabilne wiązki usieciowanych mikrotubul współistnieją w bliskim sąsiedztwie dynamicznych mikrotubul nieusieciowanych. Badania rekonstytucji in vitro oparte na mikroskopii TIRF umożliwiają jednoczesną wizualizację dynamiki tych różnych układów mikrotubul. W tym teście komora obrazowania jest składana z mikrotubul unieruchomionych powierzchniowo, które są albo obecne jako pojedyncze włókna, albo zorganizowane w usieciowane wiązki. Wprowadzenie tubuliny, nukleotydów i regulatorów białek umożliwia bezpośrednią wizualizację powiązanych białek oraz właściwości dynamicznych mikrotubul pojedynczych i usieciowanych. Co więcej, zmiany, które zachodzą, gdy dynamiczne pojedyncze mikrotubule organizują się w wiązki, mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym. Opisana tutaj metoda pozwala na systematyczną ocenę aktywności i lokalizacji poszczególnych białek, a także synergicznego działania regulatorów białek na dwa różne podzbiory mikrotubul w identycznych warunkach eksperymentalnych, dostarczając tym samym mechanistycznych spostrzeżeń, które są niedostępne innymi metodami.

Opisany powyżej eksperyment przeprowadzono z użyciem biotynilowanych mikrotubul znakowanych fluoroforem 647 nm, niebiotynilowanych mikrotubul znakowanych fluoroforem 560 nm oraz mieszaniny rozpuszczalnej tubuliny znakowanej fluoroforem 560 nm. Mikrotubule powiązano za pomocą białka sieciującego PRC1 (znakowanego GFP). Po wytworzeniu unieruchomionych na powierzchni wiązek i pojedynczych mikrotubul (krok 5.11), komorę obrazującą zamontowano na obiektywie olejowym TIRF 100X 1,49 NA i obserwowano w kanałach fluorescencji 560...

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Układy mikrotubul komórkowych zawierają subpopulacje mikrotubul o odrębnych właściwościach dynamicznych wymaganych do działania. Protokół ten odnosi się do tego, w jaki sposób zbiorowa aktywność regulatorów nadaje subpopulacjom bliższych mikrotubul odrębne właściwości. Ten oddolny test restytucji pozwala nam jednocześnie zwizualizować organizację i dynamikę proksymalnych populacji mikrotubul, takich jak pojedyncze mikrotubule i wiązki, oraz rozszyfrować mechanizmy leżące u podstaw ich samoorganizacji.Rekonstytucja wieloskładnikowa wymaga optymalizacji parametrów eksperymentalnych, takich jak pH, siła jonowa i stężenie białka, przy jednoczesnym zachowaniu aktywności każdego z nich. Systematyczna analiza poszczególnych składników przed testami wielobiałkowymi jest niezwykle pomocna. Na początek należy odpipetować mieszaninę 4,5 mikrolitra BRB ADDTT w jednym mikrolitrze roztworu mikrotubul na szkiełko mikroskopowe.Przykryj szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 na 18 milimetrów i uszczelnij krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci lub uszczelniaczem VALAP. Umieścić obiektyw TIRF pod szkiełkiem nakrywkowym. Wizualizuj nowo spolimeryzowane mikrotubule na długości fali odpowiedniej dla fluorescencyjnie znakowanej tubuliny w jasnej mieszance, aby określić, jakie rozcieńczenie mikrotubul zastosować w nadchodzących eksperymentach.Określ empirycznie intensywność lasera w eksperymencie tak, aby wszystkie białka fluorescencyjne były oświetlone, ale nie były poddawane znacznemu fotowybielaniu w trakcie trwania eksperymentu. Ustaw temperaturę mikroskopu na 28 stopni Celsjusza, aby view dynamiczne mikrotubule. Użyj papieru do soczewek, aby wyczyścić obiektyw 100X z 70% etanolem.Użyj najlepszej kombinacji kostek filtrujących i filtrów emisyjnych w zależności od kanałów fluorescencyjnych, które mają być zobrazowane. Skonfiguruj sekwencję obrazowania. W przypadku eksperymentu z biotynylowanymi mikrotubulami znakowanymi fluoroforem o długości 647 nanometrów, niebiotynylowanymi mikrotubulami znakowanymi fluoroforem o długości 560 nanometrów w rozpuszczalnej tubulinie i białkiem znakowanym GFP, należy zobrazować kanały o długości 488 nanometrów, 560 nanometrów i 647 nanometrach co 10 sekund przez 20 dowolnych minut.Aby uchwycić obraz referencyjny wiązek przed dodaniem rozpuszczalnej tubuliny i białka związanego z mikrotubulami, należy ustawić sekwencję z jednym obrazem w kanałach o długości fali 560 nanometrów i 647 nanometrów. Sprawdź położenie wiązki laserowej na suficie nad mikroskopem i wprowadź zmiany w wiązce za pomocą oprogramowania. Upewnij się, że oświetlacz laserowy jest wyrównany.Przed obrazowaniem dodaj do obiektywu kroplę olejku immersyjnego do mikroskopu. Przygotuj rozpuszczalną mieszaninę tubuliny, trzymając ją na lodzie i odkręć mieszaninę. Aby unieruchomić mikrotubule za pomocą wiązania biotyna-NeutrAwidyna-biotyna, najpierw wlej około 7,5 mikrolitra roztworu NeutrAwidyny, aż komora zostanie napełniona i inkubuj przez pięć minut.Umyć 10 mikrolitrami MB na zimno. Przelej 7,5 mikrolitra białka blokującego KC i inkubuj przez dwie minuty. Umyć 10 mikrolitrami MB na ciepło, aby przygotować komorę do wprowadzenia mikrotubul.Rozcieńczyć zapas biotynylowanych mikrotubul w BRB ADDTT i dodać jeden mikrolitr tego rozcieńczenia do dziewięciu mikrolitrów ciepłego MB. Wlej mieszaninę do komory i inkubuj przez 10 minut. Nieunieruchomione mikrotubule zmyć 10 mikrolitrami MB ciepła.Wlej 7,5 mikrolitra ciepłego KC do komory i inkubuj przez dwie minuty. Podczas inkubacji należy przygotować dwunanomolowy roztwór usieciowania krzyżowego lub białka PRC1 w KC i odwirować roztwór. Przelać 10 mikrolitrów tego roztworu do komory obrazowania i inkubować przez pięć minut.Aby zrobić wiązki, wlej 10 mikrolitrów niebiotynylowanych mikrotubul do komory i inkubuj przez 10 minut. Umyj komorę dwukrotnie 10 mikrolitrami MB na ciepło. Podczas 10-minutowego czasu inkubacji przygotuj 10 mikrolitrów mieszaniny testowej zawierającej interesujące Cię białka, rozpuszczalną tubulinę, nukleotydy, zmiatacze tlenu i przeciwutleniacze i odwiruj ją.Trzymaj mieszaninę na lodzie. Załaduj przygotowaną komorę obrazowania przyklejoną taśmą do uchwytu szkiełka obiektywu 100X TIRF. Użyj kanałów 560 nanometrów i 647 nanometrów, aby znaleźć pole widzenia, które zawiera optymalną liczbę i gęstość pojedynczych mikrotubul i wiązek.Po zidentyfikowaniu pola widzenia wykonaj zdjęcie referencyjne. Ostrożnie wlać mieszaninę testową, nie naruszając pracy komory obrazowania. Uszczelnij otwarte końce komory uszczelniaczem VALAP.Obserwuj mikrotubule i rozpocznij sekwencję obrazowania. Po unieruchomieniu nasion mikrotubul i wygenerowaniu wiązek uzyskano obrazy fluorescencyjne. Pojedyncze mikrotubule zostały zidentyfikowane na podstawie sygnału fluorescencyjnego w kanale 647 nanometrów, podczas gdy mikrotubule zostały zidentyfikowane jako wstępnie uformowane wiązki, gdy wyświetlały sygnały fluorescencyjne w obu kanałach.Badano dynamikę pojedynczych mikrotubul i usieciowanych wiązek PRC1 w obecności białek KIF4A i CLASP1, które ujawniły, że pojedyncze mikrotubule wydłużają się w trakcie testu, podczas gdy wzrost usieciowanych mikrotubul jest zahamowany. Należy uważać, aby spolimeryzowane mikrotubule utrzymywały temperaturę pokojową lub wyższą. Rozpuszczalną tubulinę należy przechowywać na lodzie i chronić komorę obrazowania oraz znakowane fluorescencyjnie mikrotubule i białka przed światłem.Testy te dostarczyły mechanistycznego wglądu w to, w jaki sposób moduł białkowy znajdujący się na wrzecionie mitotycznym może w różny sposób regulować dynamikę dwóch różnych populacji mikrotubul, które współistnieją we wrzecionie.

simultaneous-visualization-dynamics-crosslinked-single-microtubules

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii interferencyjnej (IRM) do wizualizacji mikrotubul rosnących na powierzchni szkiełka nakrywkowego w obecności odpowiedniego bufora. Po oświetleniu padającym światłem, interfejs szkiełko nakrywkowe-bufor i interfejs bufor-mikrotubula odbijają światło, które łączy się, tworząc wzór interferencyjny, umożliwiając wizualizację mikrotubul jako obrazów o wysokim kontraście na jasnym tle.

Interferencyjna mikroskopia refleksyjna do bezznacznikowej wizualizacji dynamiki mikrotubul

Endocytoza za pośrednictwem klatryny, szybki i bardzo dynamiczny proces internalizuje wiele białek, w tym receptory sygnałowe. Opisany tutaj protokół bezpośrednio wizualizuje kinetykę poszczególnych zdarzeń endocytarnych. Ma to zasadnicze znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób rdzeniowi członkowie maszynerii endocytarnej koordynują się ze sobą i jak ładunek białka wpływa na ten proces.

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Ten protokół jest przewodnikiem do implementacji mikroskopii odbicia interferencyjnego na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym do bezznacznikowego, kontrastowego, szybkiego obrazowania mikrotubul przy użyciu testów powierzchni in vitro.

Implementacja mikroskopii interferencyjnej odbiciowej do bezznacznikowego, szybkiego obrazowania mikrotubul

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Poznaj metodę TIRF do jednoczesnej wizualizacji dynamiki pojedynczych mikrotubul i wiązek in vitro. Ta technika pozwala badać mechanizmy samoorganizacji mikrotubul i aktywność białek związanych.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Przeglądaj więcej filmów