Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF
18 lutego 2022
Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.
Układy mikrotubul komórkowych zawierają subpopulacje mikrotubul o odrębnych właściwościach dynamicznych wymaganych do działania. Protokół ten odnosi się do tego, w jaki sposób zbiorowa aktywność regulatorów nadaje subpopulacjom bliższych mikrotubul odrębne właściwości. Ten oddolny test restytucji pozwala nam jednocześnie zwizualizować organizację i dynamikę proksymalnych populacji mikrotubul, takich jak pojedyncze mikrotubule i wiązki, oraz rozszyfrować mechanizmy leżące u podstaw ich samoorganizacji.
Rekonstytucja wieloskładnikowa wymaga optymalizacji parametrów eksperymentalnych, takich jak pH, siła jonowa i stężenie białka, przy jednoczesnym zachowaniu aktywności każdego z nich. Systematyczna analiza poszczególnych składników przed testami wielobiałkowymi jest niezwykle pomocna. Na początek należy odpipetować mieszaninę 4,5 mikrolitra BRB ADDTT w jednym mikrolitrze roztworu mikrotubul na szkiełko mikroskopowe.
Przykryj szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 na 18 milimetrów i uszczelnij krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci lub uszczelniaczem VALAP. Umieścić obiektyw TIRF pod szkiełkiem nakrywkowym. Wizualizuj nowo spolimeryzowane mikrotubule na długości fali odpowiedniej dla fluorescencyjnie znakowanej tubuliny w jasnej mieszance, aby określić, jakie rozcieńczenie mikrotubul zastosować w nadchodzących eksperymentach.
Określ empirycznie intensywność lasera w eksperymencie tak, aby wszystkie białka fluorescencyjne były oświetlone, ale nie były poddawane znacznemu fotowybielaniu w trakcie trwania eksperymentu. Ustaw temperaturę mikroskopu na 28 stopni Celsjusza, aby view dynamiczne mikrotubule. Użyj papieru do soczewek, aby wyczyścić obiektyw 100X z 70% etanolem.
Użyj najlepszej kombinacji kostek filtrujących i filtrów emisyjnych w zależności od kanałów fluorescencyjnych, które mają być zobrazowane. Skonfiguruj sekwencję obrazowania. W przypadku eksperymentu z biotynylowanymi mikrotubulami znakowanymi fluoroforem o długości 647 nanometrów, niebiotynylowanymi mikrotubulami znakowanymi fluoroforem o długości 560 nanometrów w rozpuszczalnej tubulinie i białkiem znakowanym GFP, należy zobrazować kanały o długości 488 nanometrów, 560 nanometrów i 647 nanometrach co 10 sekund przez 20 dowolnych minut.
Aby uchwycić obraz referencyjny wiązek przed dodaniem rozpuszczalnej tubuliny i białka związanego z mikrotubulami, należy ustawić sekwencję z jednym obrazem w kanałach o długości fali 560 nanometrów i 647 nanometrów. Sprawdź położenie wiązki laserowej na suficie nad mikroskopem i wprowadź zmiany w wiązce za pomocą oprogramowania. Upewnij się, że oświetlacz laserowy jest wyrównany.
Przed obrazowaniem dodaj do obiektywu kroplę olejku immersyjnego do mikroskopu. Przygotuj rozpuszczalną mieszaninę tubuliny, trzymając ją na lodzie i odkręć mieszaninę. Aby unieruchomić mikrotubule za pomocą wiązania biotyna-NeutrAwidyna-biotyna, najpierw wlej około 7,5 mikrolitra roztworu NeutrAwidyny, aż komora zostanie napełniona i inkubuj przez pięć minut.
Umyć 10 mikrolitrami MB na zimno. Przelej 7,5 mikrolitra białka blokującego KC i inkubuj przez dwie minuty. Umyć 10 mikrolitrami MB na ciepło, aby przygotować komorę do wprowadzenia mikrotubul.
Rozcieńczyć zapas biotynylowanych mikrotubul w BRB ADDTT i dodać jeden mikrolitr tego rozcieńczenia do dziewięciu mikrolitrów ciepłego MB. Wlej mieszaninę do komory i inkubuj przez 10 minut. Nieunieruchomione mikrotubule zmyć 10 mikrolitrami MB ciepła.
Wlej 7,5 mikrolitra ciepłego KC do komory i inkubuj przez dwie minuty. Podczas inkubacji należy przygotować dwunanomolowy roztwór usieciowania krzyżowego lub białka PRC1 w KC i odwirować roztwór. Przelać 10 mikrolitrów tego roztworu do komory obrazowania i inkubować przez pięć minut.
Aby zrobić wiązki, wlej 10 mikrolitrów niebiotynylowanych mikrotubul do komory i inkubuj przez 10 minut. Umyj komorę dwukrotnie 10 mikrolitrami MB na ciepło. Podczas 10-minutowego czasu inkubacji przygotuj 10 mikrolitrów mieszaniny testowej zawierającej interesujące Cię białka, rozpuszczalną tubulinę, nukleotydy, zmiatacze tlenu i przeciwutleniacze i odwiruj ją.
Trzymaj mieszaninę na lodzie. Załaduj przygotowaną komorę obrazowania przyklejoną taśmą do uchwytu szkiełka obiektywu 100X TIRF. Użyj kanałów 560 nanometrów i 647 nanometrów, aby znaleźć pole widzenia, które zawiera optymalną liczbę i gęstość pojedynczych mikrotubul i wiązek.
Po zidentyfikowaniu pola widzenia wykonaj zdjęcie referencyjne. Ostrożnie wlać mieszaninę testową, nie naruszając pracy komory obrazowania. Uszczelnij otwarte końce komory uszczelniaczem VALAP.
Obserwuj mikrotubule i rozpocznij sekwencję obrazowania. Po unieruchomieniu nasion mikrotubul i wygenerowaniu wiązek uzyskano obrazy fluorescencyjne. Pojedyncze mikrotubule zostały zidentyfikowane na podstawie sygnału fluorescencyjnego w kanale 647 nanometrów, podczas gdy mikrotubule zostały zidentyfikowane jako wstępnie uformowane wiązki, gdy wyświetlały sygnały fluorescencyjne w obu kanałach.
Badano dynamikę pojedynczych mikrotubul i usieciowanych wiązek PRC1 w obecności białek KIF4A i CLASP1, które ujawniły, że pojedyncze mikrotubule wydłużają się w trakcie testu, podczas gdy wzrost usieciowanych mikrotubul jest zahamowany. Należy uważać, aby spolimeryzowane mikrotubule utrzymywały temperaturę pokojową lub wyższą. Rozpuszczalną tubulinę należy przechowywać na lodzie i chronić komorę obrazowania oraz znakowane fluorescencyjnie mikrotubule i białka przed światłem.
Testy te dostarczyły mechanistycznego wglądu w to, w jaki sposób moduł białkowy znajdujący się na wrzecionie mitotycznym może w różny sposób regulować dynamikę dwóch różnych populacji mikrotubul, które współistnieją we wrzecionie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie prezentuje test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF do ilościowego określenia i porównania dynamiki różnych populacji mikrotubul. Metoda ta umożliwia jednoczesne wizualizowanie zbiorczej aktywności białek związanych z mikrotubulami zarówno na pojedynczych mikrotubulach, jak i wiązanych pakietach mikrotubul.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Techniki mikroskopiczne
Tło
- Komórkowe układy mikrotubul składają się z subpopulacji o unikalnych właściwościach dynamicznych.
- Zrozumienie zbiorczej aktywności regulatorów jest kluczowe dla rozszyfrowania zachowania mikrotubul.
- To badanie koncentruje się na mechanizmach samoorganizacji populacji mikrotubul.
- Optymalizacja parametrów eksperymentalnych jest niezbędna dla udanego wieloskładnikowego rekonstytucji.
Cel badania
- Aby wizualizować organizację i dynamikę proksymalnych populacji mikrotubul.
- Aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw samoorganizacji mikrotubul.
- Aby porównać dynamikę różnych populacji mikrotubul.
Stosowane metody
- Mikroskopia TIRF do obserwacji w czasie rzeczywistym.
- Test rekonstytucji in vitro dla dynamiki mikrotubul.
- Optymalizacja pH, siły jonowej i stężenia białka.
- Systematyczna analiza poszczególnych składników przed testami wielobiałkowymi.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacją pojedynczych mikrotubul i pakietów.
- Różne właściwości dynamiczne obserwowane wśród subpopulacji mikrotubul.
- Wgląd w zbiorczą aktywność białek związanych z mikrotubulami.
- Ustanowienie niezawodnego protokołu dla przyszłych badań.
Wnioski
- Test zapewnia potężne narzędzie do badania dynamiki mikrotubul.
- Zrozumienie zachowania mikrotubul jest niezbędne dla wnikliwej analizy funkcji komórkowych.
- Przyszły badania mogą wykorzystywać tę metodologię do eksploracji innych składników komórkowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay enables simultaneous visualization of distinct microtubule subpopulations, providing mechanistic insights into how regulatory proteins differentially modulate microtubule dynamics. The method supports target validation by de-risking mechanistic hypotheses about protein function in cytoskeletal organization. It offers predictive value for screening compounds that influence microtubule stability or bundling in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing how proteins like KIF4A and CLASP1 differentially regulate single versus crosslinked microtubule dynamics.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of protein localization and activity on defined microtubule subsets.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying synergistic or antagonistic effects of protein regulators on microtubule stability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated microtubule systems (single and bundled) for downstream compound screening under identical conditions.
- Quantitative Output: Generates real-time dynamic measurements (elongation, growth stall) enabling dose-response analysis of modulators.
- Reproducibility: Standardized immobilization and imaging protocols ensure consistent visualization of microtubule populations across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models mitotic spindle microtubule subsets, relevant to oncology targets involved in cell division.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to cellular phenotypes by linking protein activity to microtubule network organization.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs preclinical advancement by identifying compounds that selectively alter bundled versus single microtubule dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, enabling mechanistic de-risking before phenotypic screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how regulators organize proximal microtubule populations with distinct dynamics.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative readouts on microtubule elongation and bundling for compound evaluation.
- Analytics: Provides dynamic parameters (growth rates, stall events) that allow comparison of protein or compound effects across conditions.
- Translational Research: Connects molecular mechanism to cellular function by modeling mitotic spindle microtubule subpopulations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying cytoskeletal regulators across multiple targets and protein classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanism by de-risking ambiguous cytoskeletal effects.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized chamber preparation, temperature control, and multi-channel imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing subtype-specific microtubule responses early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on selective effects on bundled versus single microtubules.
Implementation Considerations
- Requires expertise in TIRF microscopy, microtubule purification, and protein labeling techniques.
- Depends on instrumentation capable of multi-color TIRF imaging and environmental control (28°C).
- Necessitates cross-team standardization of microtubule immobilization and buffer conditions for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to other cytoskeletal proteins or crosslinkers beyond PRC1.
- Limited by the need to maintain microtubule stability and prevent photobleaching during extended imaging sessions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:05
Microtubule Visualization via TIRF Microscopy
1:58
Microscope Settings
3:17
Generation of Surface-Immobilized Microtubule Bundles
4:57
Image Microtubule Dynamics
5:53
Results: TIRF Microscopy of Crosslinked and Single Microtubules
6:35
Conclusion
