Implementacja mikroskopii interferencyjnej odbiciowej do bezznacznikowego, szybkiego obrazowania mikrotubul

Znaczenie tego protokołu polega na tym, że wprowadza on technikę obrazowania bez etykiet, zdolną do pozyskiwania obrazów o wysokim kontraście przy dużej liczbie klatek na sekundę, która jest prostsza i tańsza niż inne techniki, takie jak DIC i ciemne pole. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa do wdrożenia i łatwa w użyciu. Jest niedrogi i można go łatwo łączyć z mikroskopami fluorescencyjnymi.

Metoda została opracowana z myślą o wizualizacji pojedynczych mikrotubul. Ma potencjał do wykorzystania do wizualizacji dużych kompleksów białkowych i nanocząstek. Główną trudnością jest energia aktywacji potrzebna do majstrowania przy kostce filtra, aby dodać pół srebrne lustro.

Moja rada dla kogoś, kto próbuje tej techniki po raz pierwszy, to po prostu to zrób. Na początek włóż lustro 50/50 do koła filtrów mikroskopu fluorescencyjnego za pomocą odpowiedniej kostki filtrującej. Z lustrem należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ często mają one kod antyrefleksyjny

Zwróć się do obiektywu o dużym powiększeniu, który ma również dużą aperturę numeryczną. Ten pokazany tutaj to obiektyw olejowy 100x z aperturą numeryczną 1,3. Następnie użyj żyletki i szkiełka mikroskopowego jako prostej krawędzi, aby wyciąć paski plastikowej folii parafinowej o szerokości trzech milimetrów.

Umieść dwa plastikowe paski folii parafinowej w odległości trzech milimetrów od siebie na czystym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 na 22 milimetry, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 na 18 milimetrów na wierzchu pasków, aby utworzyć kanał. Przenieś szkiełko nakrywkowe do bloku grzewczego o temperaturze 100 stopni Celsjusza na 10 do 30 sekund, aby folia parafinowa utworzyła uszczelniony kanał. Za pomocą pipety wprowadzić 50 mikrogramów na mililitr przeciwciała anty-rodaminowego przez perfuzję i inkubować szkiełko przez 10 minut.

Po inkubacji przemyć kanał pięciokrotnie przy użyciu przefiltrowanego BRB80, a następnie przepuścić 1% Poloxameru 407 do przefiltrowanego BRB80, aby zablokować powierzchnię przed niespecyficznym wiązaniem i inkubować szkiełko przez 10 minut. Ponownie umyj kanał pięć razy za pomocą filtrowanego BRB80. Aby zapobiec wysychaniu próbki, dodaj dwie kropelki przefiltrowanego BRB80 na końcach kanału i w razie potrzeby dodaj więcej buforu.

Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i włącz źródło światła epi-illumination. Skoncentruj się na krawędzi folii parafinowej, aby znaleźć powierzchnię próbki, a następnie przesuń pole, aby ustawić widok na środku komory. Będziesz obserwować wiele powierzchni, gdy obiektyw jest przesuwany w górę iw dół z powodu wstecznego odbicia światła od układu optycznego w obrębie ścieżki optycznej.

Następnie wyśrodkuj membranę polową w polu view, zamykając ją do połowy i używając regulacyjnych. Gdy membrana zostanie prawidłowo ustawiona, otwórz ją ponownie. Następnie wsuń soczewkę Bertranda, aby view tylna płaszczyzna ogniskowa, znana również jako źrenica wyjściowa obiektywu.

Zamknij przysłonę przysłony poza krawędziami źrenicy wyjściowej i użyj regulacyjnych, aby wyśrodkować przysłonę przysłony w stosunku do źrenicy wyjściowej. Sprawdź dokładnie, otwierając przysłonę przysłony i dopasowując jej krawędzie do krawędzi źrenicy wyjściowej. Następnie ustaw przysłonę przysłony na około dwie trzecie apertury numerycznej obiektywu.

Aby rozpocząć, ustaw czas naświetlania aparatu na 10 milisekund i dostosuj oświetlenie, aby prawie nasycić zakres dynamiczny aparatu. Następnie za pomocą pipety przelej 10 mikrolitrów mikrotubul stabilizowanych GMPCPP w filtrze BRB80 o wielkości 0,22 mikrometra. Monitorować wiązanie mikrotubul na obrazowaniu powierzchni.

Gdy 10 do 20 mikrotubul znajdzie się w polu widzenia, należy dwukrotnie przepłukać próbkę przefiltrowanym BRB80. Uzyskaj 10 obrazów mikrotubul, ustawiając film poklatkowy z 10-milisekundową ekspozycją i jednosekundowym okresem opóźnienia, co daje łącznie 10 sekund. Następnie uzyskaj obrazy tła, przesuwając stolik za pomocą kontrolera sceny wzdłuż długiej osi kanału, uzyskując 100 obrazów bez opóźnień.

Aby zobrazować dynamikę mikrotubul za pomocą tubuliny mózgowej, zacznij od ustawienia temperatury podgrzewacza próbki na 37 stopni Celsjusza. Za pomocą pipety wlej 10 mikrolitrów nasion mikrotubul stabilizowanych GMPCPP i monitoruj ich wiązanie z powierzchnią, obrazując powierzchnię na żywo. Gdy 10 do 20 nasion zostanie związanych w polu widzenia, umyj próbkę przy użyciu podwójnej objętości kanału wstępnie podgrzanego i przefiltrowanego BRB80.

Następnie wlej 10 mikrolitrów mieszanki polimeryzacyjnej. Aby zmierzyć wzrost mikrotubul, ustaw upływ czasu za pomocą oprogramowania do akwizycji, aby uzyskać obraz co pięć sekund przez 15 minut. Zwiększ kontrast, uzyskując uśredniony obraz 10 w każdym punkcie czasowym.

Uzyskaj obrazy tła, jak pokazano w poprzedniej sekcji. Oblicz medianę, przechodząc do obrazu, wybierając stos, następnie projekt Z, a następnie medianę. Odejmij odpowiednie tło, przechodząc do przetwarzania, przechodząc do kalkulatora obrazów i wybierając opcję odejmij z menu rozwijanego.

Upewnij się, że zaznaczona jest opcja 32-bitowego wyniku zmiennoprzecinkowego. W przypadku skurczu mikrotubul pozyskuj obrazy z prędkością 100 klatek na sekundę, ustawiając opóźnienie czasowe na zero i utrzymując czas ekspozycji na poziomie 10 milisekund. Ważnym czynnikiem przy uzyskiwaniu obrazów o wysokim kontraście za pomocą mikroskopii indukcyjnej interferencyjnej jest prawidłowe ustawienie apertury numerycznej oświetlenia.

Można to zrobić, kierując rozmiar wiązki świetlnej na źrenicę wyjściową obiektywu, która jest kontrolowana przez rozmiar przysłony. Używając próbki stabilizowanych mikrotubul znakowanych fluorescencyjnie, ustaw ostrość mikrotubul za pomocą pokrętła ostrości mikroskopu, jednocześnie obrazując je fluorescencyjnie. Ustaw ekspozycję aparatu na 10 milisekund i przymknij przysłonę do najmniejszego otworu.

Dostosuj także oświetlenie, aby prawie nasycić zakres dynamiczny kamery lub do momentu osiągnięcia maksimum. Uzyskaj 10 obrazów, przesyłając strumieniowo pole widzenia zawierające 10 lub więcej mikrotubul. Następnie uzyskaj obraz tła.

Zmień rozmiar przysłony i dostosuj intensywność oświetlenia do tego, która została wcześniej określona. Zdobądź 10 nowych obrazów i nowe tło. Powtarzaj ten proces, aż cały zakres membrany zostanie zakończony.

Dla każdego uzyskanego pola widzenia odejmij odpowiednie tło i uśrednij wynikowe odjęte obrazy tła, jak pokazano wcześniej. Następnie oblicz średni stosunek sygnału do szumu tła mikrotubul dla każdego rozmiaru otworu. Ustaw rozmiar membrany na taki, który wytwarza najwyższy stosunek sygnału do szumu tła.

Możliwe, że istnieje szereg rozmiarów, które dają porównywalny kontrast, jak pokazano tutaj. Przy dobrze ustawionym mikroskopie mikrotubule powinny być widoczne bez odejmowania tła. Odjęcie tła zwiększa jednak kontrast mikrotubul.

Aby jeszcze bardziej zwiększyć kontrast, można zastosować uśrednianie, filtrowanie 4a lub kombinację obu. Pokazane tutaj skany liniowe opisują stopniową poprawę jakości obrazu. Opisują one zauważalną redukcję szumów tła na każdym etapie przetwarzania.

Dynamika mikrotubul może być opisana w kinografach, które są generowane na podstawie filmów poklatkowych. Przykładowy kinograf uzyskany z szybkością 0,2 klatki na sekundę jest pokazany tutaj. Przerywane linie oznaczają nasiona.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować z obiektywami o dużej aperturze numerycznej. Ważne jest również, aby prawidłowo wyrównać i ustawić rozmiar ramki o średnicy przysłony. Łatwo jest połączyć IRM z obrazowaniem fluorescencyjnym, aby zbadać na przykład białka wiążące mikrotubule i sposób, w jaki modyfikują one dynamikę mikrotubul.

Technika ta znacznie zmniejsza uszkodzenia zdjęć i pozwala na akwizycję z większą liczbą klatek na sekundę, ułatwiając badanie znakowanych biopolimerów, takich jak mikrotubule, przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością czasową i dobrą precyzją śledzenia.