Kwantyfikacja powstawania falban błonowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Zewnętrzne stymulatory aktywują komórki i indukują trójwymiarowe okrągłe wypukłości błony lub tworzenie falban błony, niezbędne dla różnych aktywności komórkowych.

Aby uwidocznić tworzenie się falban błony, zacznij od płytki wielodołkowej zawierającej szkiełko nakrywkowe u podstawy. Wierzchołek szkiełka nakrywkowego ma hodowane makrofagi.

Potraktuj te makrofagi cząsteczkami stymulującymi, które aktywują komórki, ułatwiając reorganizację cytoszkieletu i tworzenie wypukłości błony. Pokryj komórki roztworem utrwalającym, sieciując białka i zachowując strukturę komórkową.

Traktuj utrwalone makrofagi zwiększonym stężeniem alkoholu w celu całkowitego odwodnienia. Wysusz te makrofagi za pomocą suszarki w punkcie krytycznym, eliminując wszelkie ślady wody w celu lepszego obrazowania.

Zamontuj szkiełko nakrywkowe na uchwycie próbki do skaningowej mikroskopii elektronowej lub SEM za pomocą taśmy przewodzącej. Napylanie Powlekaj szkiełko nakrywkowe zawierające makrofagi cienką warstwą metalu, zapewniając dobrą przewodność elektronową podczas obrazowania.

Umieść szkiełko nakrywkowe w komorze SEM. Skoncentruj wiązkę elektronów na szkiełku nakrywkowym. Wiązka elektronów uderza w membranę makrofaga pokrytego metalem, powodując wytwarzanie elektronów wtórnych o niskiej energii z powierzchni membrany.

Trójwymiarowe wypukłości rozpraszają elektrony inaczej niż reszta błony, podkreślając te cechy na powierzchni komórki. Detektor zbiera rozproszone elektrony z różnych obszarów powierzchni komórki, generując kontrastowy obraz.

Na obrazie SEM makrofagi wydają się ciemniejsze z jasnymi okrągłymi wypukłościami na powierzchni, co potwierdza powstawanie falban.

Zacznij od umieszczenia sterylnych szklanych szkiełek nakrywkowych w studzienkach 24-dołkowej płytki za pomocą autoklawowanych kleszczy. Następnie wysiewaj makrofagi RAW 264.7 na szkiełka nakrywkowe o gęstości 10⁶ komórek na mililitr i inkubuj płytkę przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnego dnia zastąp pożywkę w każdym dołku 500 mikrolitrami świeżej, kompletnej pożywki, a następnie poddaj makrofagi wstępnej obróbce przez 30 minut kontrolą nośnika, taką jak DMSO lub inhibitorem makropinocytozy, takim jak EIPA. Następnie, aby pobudzić marszczenie błony, traktuj komórki przez 30 minut stymulatorami makropinocytozy, takimi jak 1-mikromolowy roztwór PMA lub 100 nanogramów na mililitr czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów.

Aby utrwalić komórki do skaningowej mikroskopii elektronowej, odessać pożywkę z dołków i dwukrotnie umyć szkiełka nakrywkowe lodowatym PBS. Następnie inkubować szkiełka nakrywkowe w utrwalaczu przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Następnego dnia, nie naruszając monowarstwy komórek, delikatnie umyj, a następnie inkubuj szkiełka nakrywkowe w 500 mikrolitrach 0,1-molowego kakodylanu sodu przez 15 minut. Po dwóch przemyciach 500 mikrolitrami wody destylowanej, przemyć szkiełka nakrywkowe dwukrotnie w 500 mikrolitrach serii klasyfikowanego etanolu z 10-minutową inkubacją w każdym płukaniu.

Aby przeprowadzić suszenie w punkcie krytycznym, umieść szkiełka nakrywkowe w suszarce do punktów krytycznych i przykryj je 100% etanolem, a następnie naciśnij przycisk zasilania i otwórz zbiornik dwutlenku węgla. Naciśnij przycisk Cool przez około 30 sekund, aż temperatura spadnie do 0 stopni Celsjusza. Następnie naciskaj przycisk Napełnij, aż w oknie komory pojawi się bąbelek.

Następnie naciśnij przycisk Przedmuchiwanie, aż zapach etanolu z wydechu odpowietrzającego zniknie. Następnie ponownie naciśnij przycisk Cool, aż temperatura spadnie do 0 stopni Celsjusza. Naciśnij ponownie przyciski Wypełnij i Usuń, aby je wyłączyć. Następnie zamknij zbiornik dwutlenku węgla. Ponownie naciśnij przycisk Cool, aby go wyłączyć, a następnie naciśnij przycisk Heat. Ustaw temperaturę na 42 stopnie Celsjusza i ciśnienie na 1,200 funtów na cal kwadratowy.

Gdy ciśnienie i temperatura ustabilizują się, naciśnij przycisk odpowietrzania, aby umożliwić powolny spadek ciśnienia. Gdy ciśnienie w komorze osiągnie 150 funtów na cal kwadratowy, naciśnij przycisk Vent i poczekaj, aż ciśnienie spadnie do 0 funtów na cal kwadratowy. Wyłącz suszarkę do punktów krytycznych i usuń szkiełka nakrywkowe.

Następnie, za pomocą wypustek Carbon Adhesive, zamontuj szkiełka nakrywkowe na aluminiowych uchwytach próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej. Następnie przystąp do napylania za pomocą napylania złota lub palladu w powlekarce do napylania.

Włącz przycisk zasilania napylarki. Gdy próżnia osiągnie 30 militorów, przepłucz komorę, aby usunąć wilgoć i powietrze, wyłączając przełącznik gazu i przekręcając zawór Fine Gas w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Gdy podciśnienie wzrośnie do 200 militorów, wyłącz przełącznik gazu i poczekaj, aż próżnia osiągnie 30 militorów, a następnie ponownie przepłucz komorę, aby usunąć wilgoć i powietrze, jak pokazano. Po trzykrotnym przepłukaniu komory naciśnij przycisk Timer i wyreguluj pokrętło Voltage, aż miernik wskaże 10 miliamperów. Następnie należy wyjąć powlekane szkiełka nakrywkowe z komory.

Aby uwidocznić i określić ilościowo marszczenia membrany, włóż szkiełka nakrywkowe próbki do komory skaningowego mikroskopu elektronowego. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk EVAC. Otwórz oprogramowanie operacyjne mikroskopu i ustaw napięcie przyspieszania na 15 kilowoltów, a odległość roboczą na 10 milimetrów. Naciśnij przycisk Współrzędne i poruszaj się po kontrolerze, aż komórki pojawią się na środku ekranu obserwacji. Ustaw powiększenie na 3500x i zobrazuj próbkę, klikając przycisk Zdjęcie.