Name: Mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Poznaj metodę ilościowego określania sił wypukłości generowanych przez podosomy makrofagów przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Technika obejmuje przygotowanie podłoża, przyleganie komórek i analizę odkształceń filmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Annie Labernadie, Guillaume'owi Charrière'owi i Patrickowi Delobelle za ich początkowy wkład w tę pracę oraz Matthieu Sanchezowi i Françoise Viali za pomoc w filmowaniu i edycji. Prace te były wspierane przez l'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan Cancer, Fondation Toulouse Cancer oraz Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).

1. Przygotowanie siatek pokrytych formvarem
<ol>
	<li>Oczyść siatki mikroskopii elektronowej czystym acetonem i wysusz je na bibule filtracyjnej. Następnie wyczyść szkiełko mikroskopowe czystym etanolem, przetrzyj papierem do soczewek i usuń kurz za pomocą gruszki.</li>
	<li>Umieścić szkiełko szklane oczyszczone etanolem pionowo w lejku urządzenia do odlewania folii zawierającego roztwór Formvaru w dolnej części. Przykryj górną część lejka.</li>
	<li>Przepompować 100 ml roztworu Formvaru (0,5% w dichlorku etylenu) za pomocą bańki rozpylacza, aż poziom osiągnie dwie trzecie szkiełka.</li>
	<li>Trzymaj szkiełko w roztworze przez 1 minutę.</li>
	<li>Otwórz zawór urządzenia, aby spuścić roztwór Formvar w stałym strumieniu. Natężenie przepływu od 10 do 15 ml/s pozwoli uzyskać warstwę Formvar o długości fali 30-80 nm. Grubość warstwy zależy od stężenia roztworu Formvaru i szybkości drenażu. 
	UWAGA: Szybkość drenażu można kontrolować, odpowietrzając ciśnienie przez zawór wylotowy powietrza, powoli otwierając zawór. Im szybszy drenaż, tym grubsza folia. W praktyce, ponieważ trudno jest przewidzieć grubość folii na podstawie natężenia przepływu Formvar, przygotowujemy kilka partii folii Formvar i kontrolujemy ich grubość za pomocą AFM (patrz Krok 2).</li>
	<li>Wyjmij szkiełko z komory i delikatnie wysusz je na bibule filtracyjnej, aby usunąć płynny Formvar.</li>
	<li>Wytnij prostokąt o wymiarach 20 mm x 50 mm z folii Formvar za pomocą żyletki.</li>
	<li>Napełnij zlewkę czystą wodą destylowaną i powoli zanurz zjeżdżalnię pionowo w wodzie, aby odpłynęła z folii: folia powinna unosić się na powierzchni wody.</li>
	<li>Umieść suche kratki oczyszczone acetonem na folii, błyszczącą stroną do góry.</li>
	<li>Umieść okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe (Ø 12 mm) na kilku kratkach. Szkiełko nakrywkowe posłuży do pomiaru grubości folii (patrz krok 2).</li>
	<li>Przykryj szkiełko mikroskopowe białą naklejką o zmienionym rozmiarze, aby pasowało do niej. Zanurz szkiełko pionowo na granicy pływającej folii Formvar, aż cała folia przylgnie do szkiełka. Usuń nadmiar wody ze szkiełka za pomocą bibuły filtracyjnej i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
</ol>
2. Pomiar grubości folii
<ol>
	<li>Przetnij Formvar wokół szkiełka nakrywkowego za pomocą pęsety, aby odłączyć go od szkiełka.</li>
	<li>Zaznacz długopisem położenie siatki pod szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Przeciąć Formvar wokół zaznaczonej siatki, aby odłączyć go od szkiełka nakrywkowego. W pozostałym arkuszu Formvar znajdzie się zatem otwór, który pozwoli na zmierzenie grubości folii. Przykryj szkiełko nakrywkowe PBS i umieść je na szklanym szkiełku mikroskopowym.</li>
	<li>Zamontuj wspornik z azotku krzemu na pustaku szklanym AFM, upewniając się, że złoty pasek nie jest zakryty przez końcówkę sprężyny. 
	UWAGA: Czułość i stała sprężystości wspornika powinny być wcześniej skalibrowane w PBS.</li>
	<li>Zamontuj szklany blok na module AFM, a następnie umieść moduł na mikroskopie.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe pokryte Formvarem w komorze obserwacyjnej i przykryć je 500 μl PBS.</li>
	<li>Zeskanuj granicę otworu w arkuszu Formvar za pomocą AFM w trybie kontaktowym i nastawą siły 0.5 nN.</li>
	<li>Użyj powierzchni szkiełka nakrywkowego jako odniesienia dla pomiarów wysokości i oceń grubość Formvar jako wysokość przekroju poprzecznego (wykonaj co najmniej 10 pomiarów na partię Formvar).</li>
</ol>
3. Umieszczanie komórek na siatkach
<ol>
	<li>Pod sterylnym kapturem umieść pasek (12 mm x 3 mm) dwustronnej taśmy klejącej na szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Wytnij pęsetą siatkę pokrytą Formvarem i połóż ją do góry nogami na pasku kleju (do taśmy wystarczy przymocować tylko krawędź siatki). Folia Formvar musi być zwrócona w stronę szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Umieść to urządzenie w kulturze dobrze.</li>
	<li>Umieść 10 μl kropli RPMI bez FCS zawierającej 104 makrofagów różniących się od ludzkich monocytów16. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie dotykać siatki końcówką pipety, aby zapobiec uszkodzeniu powłoki Formvar.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut (37 °C, 5% CO2 ), aby komórki przylegały.</li>
	<li>Napełnij studzienkę 2 ml RPMI zawierającego 10% FCS.</li>
	<li>Inkubować urządzenie przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby komórki przyległy przed obserwacją AFM.</li>
</ol>
4. Pomiary topograficzne deformacji wywołanych przez podosomy
<ol>
	<li>Przyklej dwa paski dwustronnej taśmy klejącej na szklanym dnie szalki Petriego. 
	UWAGA: Odległość między dwoma paskami powinna być mniejsza niż średnica siatki.</li>
	<li>Ostrożnie odłącz siatkę pokrytą makrofagami od taśmy klejącej.</li>
	<li>Odwróć siatkę do góry nogami, aby komórki były skierowane w stronę szkła i przyklej siatkę między dwoma paskami samoprzylepnymi.</li>
	<li>Przymocuj siatkę za pomocą dwóch nowych pasków dwustronnego kleju: siatka zostanie w ten sposób umieszczona między dwoma paskami kleju, pozostawiając środkową część siatki dostępną dla końcówki AFM. 
	UWAGA: Upewnij się, że siatka jest dobrze zamocowana i nie jest skręcona; w przeciwnym razie wspornik AFM może nie być w stanie zbliżyć się do powierzchni Formvar.</li>
	<li>Wypełnić szalkę Petriego 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej o temperaturze 37 °C (RPMI z 10% FCS) uzupełnionej 10 mM HEPES (pH 7,4).</li>
	<li>Umieścić naczynie hodowlane na podgrzewaczu do naczyń o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zamontuj podgrzewacz do naczyń na AFM stage.</li>
	<li>Pozwól, aby system ustabilizował się w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W trybie kontaktowym z siłą 0,5 nN wykonaj pierwszy globalny obraz, aby zlokalizować podosomy, a następnie zeskanuj topografię Formvar przy 3 Hz za pomocą piksela o długości około 20 nm. 
	UWAGA: Unikaj skanowania w pobliżu krawędzi siatki.</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Gilbert, P. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Adaptation+to+Biomechanical+Stress+across+Length+Scales+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Forces+Direct+Stem+Cell+Behaviour+in+Development+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Forces+in+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Forces in Cell Biology.</a> Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).</li>
<li>Labernadie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protrusion+Force+Microscopy+Reveals+Oscillatory+Force+Generation+and+Mechanosensing+Activity+of+Human+Macrophage+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343(2014).</li>
<li>Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+Together%3A+Spatial+Synchrony+in+the+Force+and+Actin+Dynamics+of+Podosome+First+Neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors.</a> ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).</li>
<li>Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Force+and+Spatial+Dynamics+of+Macrophage+Podosomes+by+Multi-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking.</a> Methods. 94, 75-84 (2016).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Migration+of+Macrophages+Requires+Hck+for+Podosome+Organization+and+Extracellular+Matrix+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis.</a> Blood. 115, 1444-1452 (2010).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Leukocytes+and+Macrophages+of+Various+Phenotypes+Have+Distinct+Abilities+to+Form+Podosomes+and+to+Migrate+in+3d+Environments%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments.</a> European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).</li>
<li>Guiet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Mesenchymal+Migration+Requires+Podosome+Stabilization+by+Filamin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).</li>
<li>Maridonneau-Parini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Macrophage+3d+Migration%3A+A+Therapeutic+Challenge+to+Limit+Tissue+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Review%22%5BJournal%5D)">Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration.</a> Immunology Review. 262, 216-231 (2014).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+Phosphorylation+of+Wiskott-Aldrich+Syndrome+Protein+%28Wasp%29+by+Hck+Regulates+Macrophage+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).</li>
<li>Van Goethem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Podosomes+Go+3d%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage Podosomes Go 3d.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).</li>
<li>Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Architecture+Dictates+Three-Dimensional+Migration+Modes+of+Human+Macrophages%3A+Differential+Involvement+of+Proteases+and+Podosome-Like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures.</a> Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).</li>
<li>Verollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiv-1+Reprograms+the+Migration+of+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages.</a> Blood. 125, 1611-1622 (2015).</li>
<li>Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podosome+Force+Generation+Machinery%3A+A+Local+Balance+between+Protrusion+at+the+Core+and+Traction+at+the+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring.</a> ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).</li>
<li>Lizarraga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphanous-Related+Formins+Are+Required+for+Invadopodia+Formation+and+Invasion+of+Breast+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells.</a> Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+Diapedesis+Is+Initiated+by+Invasive+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes.</a> Immunity. 26, 784-797 (2007).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Recognition+Is+Facilitated+by+Invadosome-Like+Protrusions+Formed+by+Memory%2FEffector+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells.</a> Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).</li>
<li>Sens, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Invasive+Podosome-Like+Structure+Promotes+Fusion+Pore+Formation+During+Myoblast+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).</li>
<li>Takito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transient+Appearance+of+Zipper-Like+Actin+Superstructures+During+the+Fusion+of+Osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).</li>
<li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Właściwości materiału
Wybór materiału na membranę odkształcalną, w naszym przypadku Formvar, musi spełniać kilka wymagań. Materiał musi być przezroczysty dla światła widzialnego i wykazywać ograniczoną autofluorescencję, aby umożliwić obserwacje w jasnym polu i mikroskopii fluorescencyjnej. Chropowatość cienkiej warstwy musi być znacznie mniejsza niż 10 nm, aby uniknąć jakiegokolwiek wpływu topograficznego na adhezję komórek i umożliwić wyraźną obserwację wypukłości wywołanych...

Komórki zwierzęce oddziałują fizycznie z matrycą i innymi komórkami, które tworzą ich środowisko1. Jest to konieczne, aby mogły migrować, internalizować ciała, zdobywać informacje zewnętrzne lub różnicować się. W takich procesach komórka musi generować siły mechaniczne i, jak wykazały liczne badania z ostatnich lat, zdolność komórki do generowania sił i sondowania otoczenia wpływa na jej zachowanie biologiczne, kierując np. proliferacją lub różnicowaniem2,3. Z kolei pomiar sił komórkowych jest główną pomocą w badaniu regulacji generowania siły i zrozumieniu jej wpływu na zachowanie komórek i los tkanek 4,5.
Ostatnie lata były świadkami rozwoju licznych technik pomiaru sił, jakie komórka może wywierać na swoje otoczenie6. Większość z nich odegrała zasadniczą rolę w ujawnieniu sił trakcyjnych, jakie wywierają komórki, gdy ciągną ruchome sondy lub odkształcalne podłoże. Jednak siły mechaniczne zaangażowane w wypukłość w środowisko zewnątrzkomórkowe cierpią z powodu braku technik pomiarowych i do tej pory nie są dobrze scharakteryzowane.
Aby przezwyciężyć to ograniczenie, przedstawiamy metodę pomiaru sił wywieranych prostopadle na podłoże. Polega na posiewaniu żywych komórek na cienkim elastycznym arkuszu, który może odkształcać się w kierunku prostopadłym, co umożliwia pomiar deformacji podłoża przez komórki i wydedukowanie zaangażowanych sił. Topografia podłoża jest mierzona z rozdzielczością w nanoskali za pomocą mikroskopii sił atomowych, a ocena sił wynikających z odkształcenia opiera się na wiedzy na temat geometrii wystających struktur komórkowych7,8,9.
Tutaj opisujemy konfigurację i jej zastosowanie do pomiaru sił generowanych przez podosomy, wystające struktury adhezyjne tworzone przez makrofagi do ich mezenchymalnej migracji w środowiskach trójwymiarowych10,11,12,13,14,15,16,17. Wierzymy, że ta technika przyczyni się do lepszego zrozumienia generowania siły i jej regulacji w wielu procesach komórkowych związanych z protruzją.

<table><tbody><tr><td>Siatki niklowe o siatkach 200</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>Białe naklejki 26 x 70 mm</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do odlewania folii z zaworem na wylocie</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>Razorblades</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 0,5% roztwór w dichlorku etylenu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 12 mm</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td> Mikroskop sił atomowych <td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na próbkę z kontrolowaną temperaturą&nbsp;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>Wspornik z azotku krzemu o nominalnej stałej sprężystości 0,01 N/m</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronnie klejąca</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalki Petriego ze szklanym dnem</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

W wielu kontekstach biologicznych, komórki zwierzęce muszą fizycznie oddziaływać ze swoim otoczeniem, rozwijając siły mechaniczne. Wśród nich dobrze scharakteryzowano siły trakcyjne, ale brakuje technik pozwalających na pomiar sił wypukłości wywieranych przez komórki prostopadle do ich podłoża. Zaprojektowaliśmy eksperymentalny układ do pomiaru sił wypukłości wywieranych przez przylegające komórki na ich podłoże. Komórki posiane na podatnym arkuszu Formvar deformują ten substrat, a uzyskana topografia jest mapowana za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) w skali nanometrowej. Wartości sił są następnie pobierane z analizy profilu odkształcenia w oparciu o geometrię wystających struktur komórkowych. W związku z tym siły wywierane przez poszczególne wystające jednostki żywej komórki można mierzyć w czasie. Technika ta umożliwi badanie generowania siły i jej regulacji w wielu procesach komórkowych związanych z wypukłością. Tutaj opisujemy jego zastosowanie do pomiaru sił wystających generowanych przez podosomy utworzone przez ludzkie makrofagi.

Powyższy protokół opisuje sposób przygotowania układu eksperymentalnego do ilościowego oznaczenia sił protruzyjnych wywieranych przez podosomy makrofagów na podłożu z Formvaru. Jest to realizowane przy użyciu AFM i zostało zilustrowane na Rysunku 1.
Podczas analizy obrazu topograficznego wypukłości pod podosomami przy użyciu oprogramowania do przetwarzania danych JPK, z każdej linii skanowania należ...

Tutaj szczegółowo opisujemy techniki eksperymentalne używane do oceny sił wypukłości, które podosomy przykładają do odpowiedniej folii, od przygotowania filmu do automatycznej analizy obrazów topograficznych.

Mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie sił wypukłości za pomocą mikroskopii sił atomowych. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie siatek powlekanych formułą i zmierzenie grubości tej folii. Trzeci etap tego procesu polega na umieszczeniu komórek na siatkach i pozostawieniu ich do przylegania.Ostatnim etapem procedury jest zobrazowanie warstwy formy pod komórkami za pomocą mikroskopii sił atomowych. Podczas przylegania do podłoża mikrofagi tworzą submikrometryczne struktury adhezyjne zwane podosomi. Ostatecznie deformacja folii używanej przez podosomy zostanie określona ilościowo i przekształcona w siły przy użyciu domowego modelu mechanicznego.Umieść lampę z czystego szkła etanolowego w urządzeniu do odlewania folii lejkowej i przykryj górną część lejka. Przesunąć roztwór fomvar w górę do lejka, aż poziom osiągnie dwie trzecie szkiełka. Pozostaw na minutę, a następnie odcedź roztwór formvar stałym strumieniem.Należy pamiętać, że grubość filmu zależy zarówno od szybkości strumienia, jak i od stężenia roztworu formvar. Osusz to światło na ciemno i wytnij prostokąty ostrą żyletką. Zanurz zjeżdżalnię w zlewce wypełnionej wodą destylowaną, aby film fomvar unosił się na powierzchni wody.Ostrożnie umieść na foliach czyste siatki acetonowe, błyszczące stroną do góry z szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 12 milimetrów na niektórych z nich. Zostaną one wykorzystane w eksperymencie oceny grubości. Na koniec zanurz slajd pokryty naklejką, aby odzyskać cały film i siatki.Obrysuj szkiełko pokryte szkłem pęsetą, aby przeciąć formę i odłączyć ją od szkiełka. Zamontuj położenie siatki pod zakrytą folią, a następnie obrysuj siatkę pęsetą, aby ją zdjąć. Utworzony w ten sposób otwór w folii fomvar zostanie zobrazowany w celu zmierzenia jej grubości.Zamontuj ciąg azotanu krzemu w szklanym bloku AFM, upewniając się, że złoty pasek nie znajduje się poniżej końcówki sprężyny. Zamontuj szklany blok na module AFM, a następnie umieść go na stoliku mikroskopu. Umieść szkiełko nakrywkowe pokryte fomvarem na komorze obserwacyjnej z PBS na górze.Zeskanuj granicę między fomvarem a szkłem w trybie kontaktowym i za pomocą punktu 0,5 nanoniutona. W oprogramowaniu do przetwarzania danych użyj powierzchni szkła jako odniesienia wysokości i zmierz grubość fomvar na przekroju poprzecznym. Pod sterylnym kapturem wybierz 12-milimetrowe szkiełko nakrywkowe i przyklej do niego pasek taśmy z otworem.Obrysuj siatkę pokrytą fomavr pęsetą i umieść ją błyszczącą stroną do góry, tak aby tylko jej boki przylegały do kleju. Ma to na celu zapobieżenie rozdarciu fomvaru podczas wyjmowania siatki z taśmy. Umieścić pasek zakrywający na sterylnej płytce sześciodołkowej i umieścić w 10-milimetrowej kropelce pożywki hodowlanej wolnej od surowicy.Powinien zawierać około 10 tys. komórek i w tym przypadku są to mikrofagi zróżnicowane od ludzkich monocytów. Upewnij się, że nie dotykasz przy tym siatki końcówką pipera, aby nie uszkodzić powłoki fomvar. Inkubować przez pół godziny, aby komórki przylegały, następnie napełnić studzienkę pożywką uzupełnioną surowicą i ponownie inkubować przez dwie godziny, przed obserwacją AFM.Umieść dwa równoległe paski taśmy dwustronnej na szalce Petriego ze szklanym dnem, upewniając się, że szerokość między nimi jest nieco mniejsza w porównaniu ze średnicą siatki. Następnie odłącz siatkę wcześniej obsianą komórkami i umieść ją na dwóch paskach taśmy komórkami skierowanymi w dół. Zamocuj siatkę, umieszczając dwa inne paski na poprzednich.Napełnij naczynie podgrzaną pożywką hodowlaną uzupełnioną hepe. Umieść naczynie w podgrzewaczu do naczyń ustawionym wcześniej na 37 stopni Celsjusza. Zainstaluj zestaw na stoliku AFM.Gdy temperatura systemu ustabilizuje się na poziomie 37 stopni Celsjusza, przystąp do skanowania powierzchni fomvar, które należy wykonać w trybie kontaktowym, z nastawą 0,95 nanoniutona i wizualizować deformacje związane z pierwotniakami w oknie widoku danych ugięcia. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki i etapy przetwarzania w celu uzyskania formacji z AFM do pomiarów graficznych. Jak widać na tym obrazie, wykrywane są wybrzuszenia na powierzchni fomvaru.Aby przeliczyć ową informację fotograficzną na wartości siły, konieczne jest najpierw uzyskanie dostępu do lokalnej różnicy wysokiej. W tym celu należy niezależnie odjąć dopasowanie wielomianu trzeciego stopnia od jego linii skanowania. Następnie, zastosowanie dedykowanego algorytmu obrazowania domowej roboty, pozwala na ocenę wartości siły wystającej na podstawie mapy wysokości AFM i mechanicznego modelu wypukłości za pośrednictwem pierwotniaków.Dzięki tej procedurze jesteśmy w stanie zbadać mechanizmy związane z generowaniem siły protruzji u pierwotniaków. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

protrusion-force-microscopy-method-to-quantify-forces-developed-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

W tym protokole opisujemy metodę mikropipet, która bezpośrednio przykłada kontrolowaną siłę do jądra w żywej komórce. Test ten pozwala na zbadanie właściwości mechanicznych jądra w żywej, przylegającej komórce.

Sonda siły bezpośredniej do pomiaru integracji mechanicznej między jądrem a cytoszkieletem

Tutaj prezentujemy protokół oparty na mechanice, który ma na celu zakłócenie połączenia szczelinowego 43 i zmierzenie późniejszego wpływu, jaki ma to na biomechanikę śródbłonka poprzez obserwację trakcji i naprężeń międzykomórkowych.

Zaburzanie biomechaniki śródbłonka poprzez zakłócenie strukturalne Connexin 43

Ten protokół zawiera instrukcje dotyczące implementacji litografii wielofotonowej do wytwarzania trójwymiarowych matryc fluorescencyjnych znaczników referencyjnych osadzonych w hydrożelach na bazie poli(glikolu etylenowego) do wykorzystania jako platformy mikroskopii siły pociągowej bez odniesień. Korzystając z tych instrukcji, pomiar odkształcenia materiału 3D i obliczanie trakcji komórkowych jest uproszczone, aby ułatwić pomiary siły pociągowej o wysokiej przepustowości.

Wykonanie i wdrożenie bezreferencyjnej platformy mikroskopii sił trakcyjnych

Tutaj prezentujemy protokół używany do przeprowadzania eksperymentów z mikroskopią siły trakcyjnej na komórkach B. Opisujemy przygotowanie miękkich żeli poliakrylamidowych i ich funkcjonalizację, a także pozyskiwanie danych pod mikroskopem i podsumowanie analizy danych.

Mikroskopia sił trakcyjnych do badania aktywacji limfocytów B

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Platforma iTACS (Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals) automatyzuje proces jednoczesnego pomiaru szerokiej gamy sygnałów chemicznych i mechanicznych w przylegających komórkach. iTACS został zaprojektowany, aby ułatwić rozwój kierowany przez społeczność i umożliwić naukowcom korzystanie ze wszystkich funkcji platformy, niezależnie od ich wykształcenia.

Zintegrowany zestaw narzędzi do analizy sygnałów komórkowych: sił, ruchu, morfologii i fluorescencji

Ten protokół ma na celu zmierzenie parametrów dynamicznych (wypukłości, retrakcje, falbany) wypukłości na krawędzi komórek rozsiewających.

Pomiar dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Poznaj metodę ilościowego określania sił wypukłości generowanych przez podosomy makrofagów przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Technika obejmuje przygotowanie podłoża, przyleganie komórek i analizę odkształceń filmu.

Mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek

Przeglądaj więcej filmów