Mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie sił wypukłości za pomocą mikroskopii sił atomowych. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie siatek powlekanych formułą i zmierzenie grubości tej folii. Trzeci etap tego procesu polega na umieszczeniu komórek na siatkach i pozostawieniu ich do przylegania.

Ostatnim etapem procedury jest zobrazowanie warstwy formy pod komórkami za pomocą mikroskopii sił atomowych. Podczas przylegania do podłoża mikrofagi tworzą submikrometryczne struktury adhezyjne zwane podosomi. Ostatecznie deformacja folii używanej przez podosomy zostanie określona ilościowo i przekształcona w siły przy użyciu domowego modelu mechanicznego.

Umieść lampę z czystego szkła etanolowego w urządzeniu do odlewania folii lejkowej i przykryj górną część lejka. Przesunąć roztwór fomvar w górę do lejka, aż poziom osiągnie dwie trzecie szkiełka. Pozostaw na minutę, a następnie odcedź roztwór formvar stałym strumieniem.

Należy pamiętać, że grubość filmu zależy zarówno od szybkości strumienia, jak i od stężenia roztworu formvar. Osusz to światło na ciemno i wytnij prostokąty ostrą żyletką. Zanurz zjeżdżalnię w zlewce wypełnionej wodą destylowaną, aby film fomvar unosił się na powierzchni wody.

Ostrożnie umieść na foliach czyste siatki acetonowe, błyszczące stroną do góry z szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 12 milimetrów na niektórych z nich. Zostaną one wykorzystane w eksperymencie oceny grubości. Na koniec zanurz slajd pokryty naklejką, aby odzyskać cały film i siatki.

Obrysuj szkiełko pokryte szkłem pęsetą, aby przeciąć formę i odłączyć ją od szkiełka. Zamontuj położenie siatki pod zakrytą folią, a następnie obrysuj siatkę pęsetą, aby ją zdjąć. Utworzony w ten sposób otwór w folii fomvar zostanie zobrazowany w celu zmierzenia jej grubości.

Zamontuj ciąg azotanu krzemu w szklanym bloku AFM, upewniając się, że złoty pasek nie znajduje się poniżej końcówki sprężyny. Zamontuj szklany blok na module AFM, a następnie umieść go na stoliku mikroskopu. Umieść szkiełko nakrywkowe pokryte fomvarem na komorze obserwacyjnej z PBS na górze.

Zeskanuj granicę między fomvarem a szkłem w trybie kontaktowym i za pomocą punktu 0,5 nanoniutona. W oprogramowaniu do przetwarzania danych użyj powierzchni szkła jako odniesienia wysokości i zmierz grubość fomvar na przekroju poprzecznym. Pod sterylnym kapturem wybierz 12-milimetrowe szkiełko nakrywkowe i przyklej do niego pasek taśmy z otworem.

Obrysuj siatkę pokrytą fomavr pęsetą i umieść ją błyszczącą stroną do góry, tak aby tylko jej boki przylegały do kleju. Ma to na celu zapobieżenie rozdarciu fomvaru podczas wyjmowania siatki z taśmy. Umieścić pasek zakrywający na sterylnej płytce sześciodołkowej i umieścić w 10-milimetrowej kropelce pożywki hodowlanej wolnej od surowicy.

Powinien zawierać około 10 tys. komórek i w tym przypadku są to mikrofagi zróżnicowane od ludzkich monocytów. Upewnij się, że nie dotykasz przy tym siatki końcówką pipera, aby nie uszkodzić powłoki fomvar. Inkubować przez pół godziny, aby komórki przylegały, następnie napełnić studzienkę pożywką uzupełnioną surowicą i ponownie inkubować przez dwie godziny, przed obserwacją AFM.

Umieść dwa równoległe paski taśmy dwustronnej na szalce Petriego ze szklanym dnem, upewniając się, że szerokość między nimi jest nieco mniejsza w porównaniu ze średnicą siatki. Następnie odłącz siatkę wcześniej obsianą komórkami i umieść ją na dwóch paskach taśmy komórkami skierowanymi w dół. Zamocuj siatkę, umieszczając dwa inne paski na poprzednich.

Napełnij naczynie podgrzaną pożywką hodowlaną uzupełnioną hepe. Umieść naczynie w podgrzewaczu do naczyń ustawionym wcześniej na 37 stopni Celsjusza. Zainstaluj zestaw na stoliku AFM.

Gdy temperatura systemu ustabilizuje się na poziomie 37 stopni Celsjusza, przystąp do skanowania powierzchni fomvar, które należy wykonać w trybie kontaktowym, z nastawą 0,95 nanoniutona i wizualizować deformacje związane z pierwotniakami w oknie widoku danych ugięcia. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki i etapy przetwarzania w celu uzyskania formacji z AFM do pomiarów graficznych. Jak widać na tym obrazie, wykrywane są wybrzuszenia na powierzchni fomvaru.

Aby przeliczyć ową informację fotograficzną na wartości siły, konieczne jest najpierw uzyskanie dostępu do lokalnej różnicy wysokiej. W tym celu należy niezależnie odjąć dopasowanie wielomianu trzeciego stopnia od jego linii skanowania. Następnie, zastosowanie dedykowanego algorytmu obrazowania domowej roboty, pozwala na ocenę wartości siły wystającej na podstawie mapy wysokości AFM i mechanicznego modelu wypukłości za pośrednictwem pierwotniaków.

Dzięki tej procedurze jesteśmy w stanie zbadać mechanizmy związane z generowaniem siły protruzji u pierwotniaków. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.