Mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek
16 czerwca 2018
Tutaj szczegółowo opisujemy techniki eksperymentalne używane do oceny sił wypukłości, które podosomy przykładają do odpowiedniej folii, od przygotowania filmu do automatycznej analizy obrazów topograficznych.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie sił wypukłości za pomocą mikroskopii sił atomowych. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie siatek powlekanych formułą i zmierzenie grubości tej folii. Trzeci etap tego procesu polega na umieszczeniu komórek na siatkach i pozostawieniu ich do przylegania.
Ostatnim etapem procedury jest zobrazowanie warstwy formy pod komórkami za pomocą mikroskopii sił atomowych. Podczas przylegania do podłoża mikrofagi tworzą submikrometryczne struktury adhezyjne zwane podosomi. Ostatecznie deformacja folii używanej przez podosomy zostanie określona ilościowo i przekształcona w siły przy użyciu domowego modelu mechanicznego.
Umieść lampę z czystego szkła etanolowego w urządzeniu do odlewania folii lejkowej i przykryj górną część lejka. Przesunąć roztwór fomvar w górę do lejka, aż poziom osiągnie dwie trzecie szkiełka. Pozostaw na minutę, a następnie odcedź roztwór formvar stałym strumieniem.
Należy pamiętać, że grubość filmu zależy zarówno od szybkości strumienia, jak i od stężenia roztworu formvar. Osusz to światło na ciemno i wytnij prostokąty ostrą żyletką. Zanurz zjeżdżalnię w zlewce wypełnionej wodą destylowaną, aby film fomvar unosił się na powierzchni wody.
Ostrożnie umieść na foliach czyste siatki acetonowe, błyszczące stroną do góry z szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 12 milimetrów na niektórych z nich. Zostaną one wykorzystane w eksperymencie oceny grubości. Na koniec zanurz slajd pokryty naklejką, aby odzyskać cały film i siatki.
Obrysuj szkiełko pokryte szkłem pęsetą, aby przeciąć formę i odłączyć ją od szkiełka. Zamontuj położenie siatki pod zakrytą folią, a następnie obrysuj siatkę pęsetą, aby ją zdjąć. Utworzony w ten sposób otwór w folii fomvar zostanie zobrazowany w celu zmierzenia jej grubości.
Zamontuj ciąg azotanu krzemu w szklanym bloku AFM, upewniając się, że złoty pasek nie znajduje się poniżej końcówki sprężyny. Zamontuj szklany blok na module AFM, a następnie umieść go na stoliku mikroskopu. Umieść szkiełko nakrywkowe pokryte fomvarem na komorze obserwacyjnej z PBS na górze.
Zeskanuj granicę między fomvarem a szkłem w trybie kontaktowym i za pomocą punktu 0,5 nanoniutona. W oprogramowaniu do przetwarzania danych użyj powierzchni szkła jako odniesienia wysokości i zmierz grubość fomvar na przekroju poprzecznym. Pod sterylnym kapturem wybierz 12-milimetrowe szkiełko nakrywkowe i przyklej do niego pasek taśmy z otworem.
Obrysuj siatkę pokrytą fomavr pęsetą i umieść ją błyszczącą stroną do góry, tak aby tylko jej boki przylegały do kleju. Ma to na celu zapobieżenie rozdarciu fomvaru podczas wyjmowania siatki z taśmy. Umieścić pasek zakrywający na sterylnej płytce sześciodołkowej i umieścić w 10-milimetrowej kropelce pożywki hodowlanej wolnej od surowicy.
Powinien zawierać około 10 tys. komórek i w tym przypadku są to mikrofagi zróżnicowane od ludzkich monocytów. Upewnij się, że nie dotykasz przy tym siatki końcówką pipera, aby nie uszkodzić powłoki fomvar. Inkubować przez pół godziny, aby komórki przylegały, następnie napełnić studzienkę pożywką uzupełnioną surowicą i ponownie inkubować przez dwie godziny, przed obserwacją AFM.
Umieść dwa równoległe paski taśmy dwustronnej na szalce Petriego ze szklanym dnem, upewniając się, że szerokość między nimi jest nieco mniejsza w porównaniu ze średnicą siatki. Następnie odłącz siatkę wcześniej obsianą komórkami i umieść ją na dwóch paskach taśmy komórkami skierowanymi w dół. Zamocuj siatkę, umieszczając dwa inne paski na poprzednich.
Napełnij naczynie podgrzaną pożywką hodowlaną uzupełnioną hepe. Umieść naczynie w podgrzewaczu do naczyń ustawionym wcześniej na 37 stopni Celsjusza. Zainstaluj zestaw na stoliku AFM.
Gdy temperatura systemu ustabilizuje się na poziomie 37 stopni Celsjusza, przystąp do skanowania powierzchni fomvar, które należy wykonać w trybie kontaktowym, z nastawą 0,95 nanoniutona i wizualizować deformacje związane z pierwotniakami w oknie widoku danych ugięcia. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki i etapy przetwarzania w celu uzyskania formacji z AFM do pomiarów graficznych. Jak widać na tym obrazie, wykrywane są wybrzuszenia na powierzchni fomvaru.
Aby przeliczyć ową informację fotograficzną na wartości siły, konieczne jest najpierw uzyskanie dostępu do lokalnej różnicy wysokiej. W tym celu należy niezależnie odjąć dopasowanie wielomianu trzeciego stopnia od jego linii skanowania. Następnie, zastosowanie dedykowanego algorytmu obrazowania domowej roboty, pozwala na ocenę wartości siły wystającej na podstawie mapy wysokości AFM i mechanicznego modelu wypukłości za pośrednictwem pierwotniaków.
Dzięki tej procedurze jesteśmy w stanie zbadać mechanizmy związane z generowaniem siły protruzji u pierwotniaków. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje techniki eksperymentalne wykorzystywane do ilościowego określania sił protruzji wywieranych przez podosome na podatnej błonie z użyciem mikroskopii sił atomowych. Proces obejmuje przygotowanie błony, adhezję komórek oraz obrazowanie w celu analizy deformacji wywołanej przez podosome.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biofizyka
Wprowadzenie
- Podosomy są submikrometrycznymi strukturami adhezyjnymi tworzonymi przez makrofagi.
- Zrozumienie sił wywieranych przez podosomy może dostarczyć cennych informacji na temat mechaniki komórkowej.
- Mikroskopia sił atomowych jest kluczową techniką pomiaru tych sił.
- Celem badania jest opracowanie modelu mechanicznego do ilościowego określania sił na podstawie odkształcenia filmu.
Cel badania
- Aby określić siły wypchnięcia wywierane przez podozomy.
- Aby przeanalizować oddziaływanie między komórkami a podatnymi podłożami.
- Aby pogłębić zrozumienie mechanizmów adhezji komórkowej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie siatek pokrytych formułą.
- Pomiar grubości filmu.
- Osadzanie komórek na siatkach w celu adhezji.
- Obrazowanie filmu pod komórkami przy użyciu mikroskopii sił atomowych.
Główne wyniki
- Ilościowe określenie deformacji błony wywołanej przez podozomy.
- Przeliczenie pomiarów deformacji na wartości siły z wykorzystaniem modelu mechanicznego.
- Wnioski dotyczące właściwości mechanicznych oddziaływań podozomów z podłożami.
- Demonstracja skuteczności mikroskopii sił atomowych w pomiarze sił komórkowych.
Wnioski
- Badanie pomyślnie określa ilościowo siły wypchnięcia generowane przez podosomy.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechaniki i adhezji komórkowej.
- Opracowane metody mogą zostać zastosowane w dalszych badaniach z zakresu biologii komórki.
Często zadawane pytania
Przemysłowe znaczenie praktyczne
Kwantyfikacja sił wypiętrzeń zapewnia bezpośredni odczyt mechanicznej aktywności komórkowej, umożliwiając mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie walidacji celów dla szlaków związanych z makrofagami. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną poprzez powiązanie generowania sił podkomórkowych z fenotypami funkcjonalnymi w zakresie adhezji i migracji. Pozycjonuje ona pomiar siły wypiętrzeń jako translacyjną platformę biomarkerów do redukcji ryzyka w modelach przedklinicznych w programach dotyczących immunologii i stanów zapalnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez kwantyfikację generowanej siły w subkomórkowych strukturach protruzyjnych, takich jak podosomy.
- Wartość operacyjna: Wspiera redukcję ryzyka biologicznego poprzez bezpośredni pomiar funkcji komórkowych zależnych od siły w ludzkich makrofagach.
- Wartość prognostyczna: Łączy dynamikę siły protruzji z wyjaśnianiem szlaków sygnałowych, pomagając w selekcji projektów w ramach walidacji celów mechanosensytywnych.
Przesiew i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na wytwarzanie znormalizowanych, powtarzalnych map topografii w nanoskali z odpowiednich podłoży w celu ilościowego wyznaczenia siły.
- Skalowalność: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych (np. makrofagów tworzących podosomy) do późniejszego screeningu związków.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Ułatwia wiarygodną ocenę związków poprzez dostarczenie odczytu fenotypu mechanicznego ortogonalnego względem analiz biochemicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy pomiary siły wypychania na etapie odkrywania z walidacją przedkliniczną za pomocą modeli makrofagów istotnych dla danej choroby.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Koncentruje się na wartości predykcyjnej poprzez kwantyfikację generowania siły jako funkcjonalnego wyniku aktywności podosomów.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez korelację modulacji siły wypychania z zaangażowaniem celu w szlakach adhezyjnych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta włącza się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego – zapewniając ilościowy, oparty na mechanizmach odczyt dynamiki wypustek komórkowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez pomiar generowanej siły z określonych struktur protrusyjnych.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne mapy wysokości z obrazowania AFM, które umożliwiają ilościowe porównanie sił protrusyjnych w różnych warunkach.
- Analityka: Generuje wartości siły poprzez konwersję profili deformacji za pomocą modelu mechanicznego, co umożliwia statystyczne porównanie aktywności protrusyjnej.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną, wykorzystując podosomy pochodzące z ludzkich makrofagów jako system istotny dla przebiegu choroby w celu uzyskania wglądu w mechanizmy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalną możliwość badania mechanobiologii w odniesieniu do celów związanych z odpornością, nowotworami i stanami zapalnymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w procesach napędzanych przez wypustki komórkowe.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki mapowaniu odkształceń w nanoskali za pomocą AFM oraz kontrolowanemu przygotowaniu podłoża.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną biologiczną redukcję ryzyka w przypadku celów zaangażowanych w generowanie sił w strukturach komórkowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez kwantyfikację siły wypustek jako funkcjonalnego biomarkera modulacji celu.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w obsłudze mikroskopii sił atomowych, przygotowywaniu podatnych filmów polimerowych oraz hodowli makrofagów.
- Zależy od instrumentacji umożliwiającej mapowanie wysokości w skali nanometrycznej oraz pozyskiwanie krzywych siły w środowisku ciekłym.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji pomiaru grubości filmu, gęstości wysiewu komórek oraz siły set-point AFM w celu zapewnienia powtarzalnej detekcji wypustek.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy zastosowaniu w innych typach komórek niż makrofagi lub w przypadku alternatywnych struktur wypustkowych innych niż podosomy.
- Ograniczone przez potrzebę uzyskania jednorodnych, wolnych od defektów podatnych filmów oraz dokładnego modelowania mechanicznego oddziaływań między wypustką a podłożem.
