Name: Wizualizacja powstawania falban błony za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji i ilościowej oceny powstawania falban błonowych oraz aktywności makropinocytozy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej w makrofagach RAW 264.7.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Libby Perry (Augusta University) za pomoc w przygotowaniu próbki SEM. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) i K99HL146954 (B.S.)] oraz American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].

UWAGA: Poniżej znajduje się ogólny protokół używany do ilościowego określania powstawania falban błonowych w makrofagach RAW 264.7 za pomocą mikroskopii SEM. Optymalizacja może być wymagana dla różnych typów komórek.
1. Linia komórkowa i hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hoduj makrofagi RAW 264.7 w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% (vol/vol) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 IU / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Wymieniaj pożywkę wzrostową co drugi dzień.</li>
	<li>Gdy komórki zlewają się w 80%, umyj płytkę dwa razy za pomocą sterylnego PBS.</li>
	<li>Odłączyć komórki, dodając 1 000 μl 0,5% trypsyny-EDTA i inkubować płytkę do hodowli komórkowej przez 3-5 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zbadaj płytkę pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić dysocjację komórek. Dodaj 10 ml pożywki wzrostowej zawierającej 10% FBS, aby dezaktywować trypsynę.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie zawiesić komórki w kompletnym pożywce do hodowli komórkowych i określić liczbę komórek oraz żywotność za pomocą barwienia błękitem trypanowym (0,4%). 
	UWAGA: Zalecana minimalna żywotność komórek w tym eksperymencie wynosi >90%.</li>
	<li>Umieść sterylne szklane szkiełka nakrywkowe w dołkach na 24-dołkowej płytce za pomocą autoklawowanych kleszczy. Komórki nasienne na szkiełkach nakrywkowych o gęstości 1 x 106 komórek/ml i inkubować płytkę przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Przed zabiegiem należy wymienić pożywkę z każdej studzienki na świeżą, kompletną pożywkę o pojemności 500 μl. Wstępnie potraktuj makrofagi nośnikiem (DMSO lub innymi rozpuszczalnikami używanymi do rozpuszczania EIPA) lub inhibitorem makropinocytozy 5-(N-etylo-N-izopropylo)-amilorydem (EIPA, 25 μM21) przez 30 minut.</li>
	<li>Traktuj komórki nośnikiem i stymulatorami makropinocytozy, aby promować marszczenie błony: 12-mirystynianianu 13-octanu forbolu (PMA, 1 μM, 30 min21) i czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF, 100 ng/mL, 30 min3). 
	UWAGA: Alternatywne inhibitory makropinocytozy [np. latrunkulina A (1 μM, 30 min) lub cytochalazyna D (1 μM, 30 min)] i stymulatory [np. naskórkowy czynnik wzrostu (EGF, 100 ng/ml, 10 min) lub płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF, 100 ng/mL, 15 min)] makropinocytozy mogą być również stosowane do charakteryzowania makropinocytozy w makrofagach i innych typach komórek16, 27,28,29. Komórki mogą wymagać głodzenia surowicy przez noc przed leczeniem fizjologicznymi stymulatorami makropinocytozy. Ważne jest, aby pamiętać, że najskuteczniejsze stężenia i czasy inkubacji będą musiały zostać określone, aby stymulować makropinocytozę w innych typach komórek.</li>
</ol>
2. Utrwalenie SEM
<ol>
	<li>Po zabiegu odessać pożywkę ze studzienek i dwukrotnie zmyć szkiełka nakrywkowe lodowatym PBS.</li>
	<li>Utrwalić komórki (4% paraformaldehydu i 2% aldehydu glutarowego w 0,1 M kakodylanu sodu) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przez noc inkubować w utrwalaczu w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Delikatnie przemyć i inkubować szkiełka nakrywkowe za pomocą 500 μl następujących odczynników, nie naruszając monowarstwy komórek.
	<ol>
		<li>Przemyć raz w 0,1 M kakodylan sodu i inkubować przez 15 minut.</li>
		<li>Przemyć dwukrotnie dH2O z 10 minutową inkubacją w każdym praniu.</li>
		<li>Przemyć dwukrotnie 25% etanolem w 10 minutowej inkubacji w każdym praniu.</li>
		<li>Przemyć dwukrotnie 50% etanolem w 10 minutowej inkubacji w każdym praniu.</li>
		<li>Przemyć dwukrotnie 75% etanolem w 10-minutowej inkubacji w każdym praniu.</li>
		<li>Przemyć dwukrotnie 80% etanolem w 10 minutowej inkubacji w każdym praniu.</li>
		<li>Przemyć dwukrotnie 95% etanolem w 10 minutowej inkubacji w każdym praniu.</li>
		<li>Umyć dwukrotnie 100% etanolem. Wykonuj 10 minut inkubacji w każdym praniu. 
		UWAGA: Wymiana/wymiana odczynników powinna odbywać się szybko, aby zapobiec wysuszeniu komórek powietrzem. Szkiełka nakrywkowe można pozostawić w 100% etanolu na kilka dni w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania należy dodać dodatkowe 100% etanolu i przykryć studzienki parafilmem, aby zapobiec wysuszeniu próbki na powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Suszenie w punkcie krytycznym
<ol>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe w suszarce w punkcie krytycznym i przykryj 100% etanolem. Naciśnij przycisk zasilania i otwórz zbiornik CO2 .</li>
	<li>Naciskać przycisk Cool przez około 30 s, aż temperatura spadnie do 0 °C. Naciskaj przycisk Fill, aż w okienku komory pojawi się bańka.</li>
	<li>Naciskaj przycisk Przedmuchiwanie, aż zniknie zapach etanolu z wydechu odpowietrzającego. Naciśnij ponownie przycisk Chłodzenie, aż temperatura spadnie do 0 °C.</li>
	<li>Ponownie naciśnij przyciski napełniania i oczyszczania, aby je wyłączyć i zamknąć zbiornik CO2. Ponownie naciśnij przycisk Chłodzenie, aby go wyłączyć, a następnie naciśnij przycisk podgrzewania.</li>
	<li>Ustawić temperaturę na 42 °C, a ciśnienie na 1 200 psi. Gdy ciśnienie i temperatura ustabilizują się, naciśnij przycisk odpowietrzania, aby umożliwić powolny spadek ciśnienia.</li>
	<li>Gdy ciśnienie w komorze osiągnie 150 psi, naciśnij przycisk Vent i poczekaj, aż ciśnienie spadnie do 0 psi. Wyłącz suszarkę do punktu krytycznego i usuń szkiełka nakrywkowe.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na próbkach aluminiowych SEM za pomocą zakładek Carbon Adhesive i poddaj powłoce napylającej za pomocą złota/palladu w powlekarce napylającej.</li>
	<li>Włącz przycisk zasilania i poczekaj, aż podciśnienie osiągnie 30 mTorr. Przepłucz komorę, aby usunąć wilgoć i powietrze, wyłączając przełącznik gazu i obracając zawór gazu Fine w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.</li>
	<li>Gdy podciśnienie wzrośnie do 200 mTorr, wyłącz przełącznik gazu i poczekaj, aż podciśnienie osiągnie 30 mTorr. Powtórz ten krok 3 razy.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Timer i wyreguluj Voltage pokrętło, aż miernik wskaże 10 mA. Usunąć powlekane szkiełka nakrywkowe z komory. 
	UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wykonać suszenie w punkcie krytycznym i napylanie próbki .</li>
</ol>
4. Obrazowanie i kwantyfikacja
<ol>
	<li>Włóż szkiełka nakrywkowe z próbką do komory skaningowego mikroskopu elektronowego. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk EVAC.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie operacyjne SEM. Ustaw napięcie przyspieszania na 15 kv i odległość roboczą na 10 mm.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Współrzędne i poruszaj się po kontrolerze, aż komórki pojawią się na środku ekranu obserwacji. Ustaw powiększenie na 3,500x i zobrazuj próbkę, klikając przycisk Zdjęcie. 
	UWAGA: Użyj wyższego poziomu powiększenia (od 8 500x do 16 000x), aby pokazać błonę plazmatyczną z większą szczegółowością.</li>
	<li>Rób zdjęcia z co najmniej 10 losowych miejsc na szkiełkach nakrywkowych, upewniając się, że każde pole mikroskopowe zawiera wiele komórek. Zapisuj obrazy jako pliki .tif.</li>
	<li>Na obrazach zlokalizuj falbanki błony, zdefiniowane jako wystające fałdy błony plazmatycznej przypominające koc, o rozmiarze większym niż 500 nm (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Policz liczbę falban na komórkę. 
	UWAGA: Falbany w kształcie litery C zostały zidentyfikowane jako zakrzywione wypukłości membranowe, które nie zrosły się na swoich bocznych końcach [(<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1 (leczenie M-CSF) i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2B]. Stopione okrągłe falbany błonowe, przed ich zamknięciem, zostały zidentyfikowane jako miseczki makropinocytotyczne (<silna klasa="xfig">Ryc. 2C).</li>
	<li>Znormalizuj liczbę zmarszczek błony do całkowitej liczby komórek w ocenianym polu mikroskopowym. Powtórzyć tę analizę dla próbek z każdej grupy.</li>
</ol>

<ol><li>Bohdanowicz, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phospholipids+in+endocytosis%2C+phagocytosis%2C+and+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).</li>
<li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis%3A+New+Insights+Into+Its+Underappreciated+Role+in+Innate+Immune+Cell+Surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2286(2018).</li>
<li>Racoosin, E. L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF-induced+macropinocytosis+increases+solute+endocytosis+but+not+receptor-mediated+endocytosis+in+mouse+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages.</a> Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+signaling+during+macropinocytosis+in+response+to+M-CSF+and+PMA+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages.</a> Frontiers in Physiology. 6, 8(2015).</li>
<li>Ghoshal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2-Mediated+PI3K+and+Cofilin+Activation+Confers+Alternate+Redox+Control+of+Macrophage+Pinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidant+and+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis.</a> Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).</li>
<li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+induces+macropinocytosis+and+SNX1-modulated+recycling+of+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin.</a> Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).</li>
<li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).</li>
<li>Hagiwara, M., Nakase, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+induced+macropinocytosis+directs+branch+formation+of+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).</li>
<li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li>
<li>Bosedasgupta, S., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+stimuli+reprogram+macrophage+phagocytosis+to+macropinocytosis+for+the+rapid+elimination+of+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens.</a> PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879(2014).</li>
<li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+in+phagocytes%3A+Regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1(2015).</li>
<li>Zeineddine, R., Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macropinocytosis+in+the+propagation+of+protein+aggregation+associated+with+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Physiology. 6, 277(2015).</li>
<li>Yerbury, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregates+stimulate+macropinocytosis+facilitating+their+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation.</a> Prion. 10 (2), 119-126 (2016).</li>
<li>Jayashankar, V., Edinger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+confers+resistance+to+therapies+targeting+cancer+anabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism.</a> Nature Communication. 11 (1), 1121(2020).</li>
<li>Kanlaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+is+the+major+mechanism+for+endocytosis+of+calcium+oxalate+crystals+into+renal+tubular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).</li>
<li>Csanyi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD47+and+Nox1+mediate+dynamic+fluid-phase+macropinocytosis+of+native+LDL%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).</li>
<li>Francis, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruffles+induced+by+Salmonella+and+other+stimuli+direct+macropinocytosis+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria.</a> Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).</li>
<li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+entry+by+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).</li>
<li>Liu, X., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+nanoparticle+delivery+by+oncogenic+KRAS-mediated+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).</li>
<li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156(2019).</li>
<li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+macropinocytosis+inhibitors+using+a+rational+screen+of+Food+and+Drug+Administration-approved+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).</li>
<li>Singla, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC%CE%B4-Mediated+Nox2+Activation+Promotes+Fluid-Phase+Pinocytosis+of+Antigens+by+Immature+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 537(2018).</li>
<li>Ivanov, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+endocytic+pathways%3A+is+it+specific+enough+to+be+useful%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).</li>
<li>Araki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+3-methyladenine+on+the+fusion+process+of+macropinosomes+in+EGF-stimulated+A431+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells.</a> Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).</li>
<li>Koivusalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).</li>
<li>Fischer, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).</li>
<li>Nakase, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+macropinocytosis+induction+by+stimulation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+oncogenic+Ras+expression+potentiates+cellular+uptake+efficacy+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes.</a> Science Reports. 5, 10300(2015).</li>
<li>Gold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clathrin+independent+macropinocytosis-like+entry+mechanism+used+by+bluetongue+virus-1+during+infection+of+BHK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells.</a> PLoS One. 5 (6), 11360(2010).</li>
<li>Mishra, R., Bhowmick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Macropinocytosis+in+Prostate+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts.</a> Bio- Protocols. 9 (10), (2019).</li>
<li>Gordon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy%3A+A+brief+history+and+review+of+current+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).</li>
<li>Mahankali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+cell+membrane+ruffling+relies+on+a+phospholipase+D2+%28PLD2%29%2C+Grb2+and+Rac2+association%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signaling%22%5BJournal%5D)">The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association.</a> Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Obecny protokół obrazowania SEM zapewnia narzędzie do wizualizacji i ilościowego określenia powstawania falban błonowych, okrągłych wypukłości i miseczek makropinocytarnych na powierzchni komórki in vitro. Chociaż obecny protokół koncentruje się na makrofagach, badania wykazały, że tworzenie się falban błonowych występuje również na różnych innych typach komórek, w tym komórkach dendrytycznych, fibroblastach, neuronach i komórkach rakowych 11,12,14,21,30.</sup...

Makropinocytoza to proces endocytarny odpowiedzialny za internalizację dużej ilości płynu pozakomórkowego i jego zawartości poprzez tworzenie dynamicznych i napędzanych aktyną wypukłości błony plazmatycznej zwanych falbankami błonowymi1. Wiele z tych falban błony tworzy miseczki, które zamykają się i łączą z powrotem w komórce i oddzielają się od błony plazmatycznej jako duże, heterogeniczne endosomy wewnątrzkomórkowe, znane również jako makropinosomy1. Chociaż makropinocytoza jest indukowana przez czynniki wzrostu, takie jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) w szerokim zakresie typów komórek, w wrodzonych komórkach odpornościowych zaobserwowano również dodatkowy, unikalny, zależny od wapnia proces znany jako konstytutywna makropinocytoza2,3,4,5,6,7,8.
Wykazano, że zdolność komórek do internalizacji materiału zewnątrzkomórkowego poprzez makropinocytozę odgrywa ważną rolę w różnych procesach fizjologicznych, począwszy od pobierania składników odżywczych, a skończywszy na wychwytywaniu patogenów i prezentacji antygenów9,10,11. Ponieważ jednak proces ten jest nieselektywny i indukowalny, jest również związany z wieloma stanami patologicznymi. Rzeczywiście, wcześniejsze badania sugerowały, że makropinocytoza odgrywa ważną rolę w chorobie Alzheimera, chorobie Parkinsona, raku, kamicy nerkowej i miażdżycy12,13,14,15,16. Co więcej, wykazano, że niektóre bakterie i wirusy wykorzystują makropinocytozę, aby dostać się do komórek gospodarza i wywołać infekcję17,18. Co ciekawe, stymulacja makropinocytozy może być również wykorzystana do celowanego dostarczania środków terapeutycznych w różnych stanach chorobowych19,20.
Poprzednie badania badały makropinocytozę poprzez ilościowe określanie zinternalizowanych, fluorescencyjnie znakowanych markerów fazy płynnej przy braku i obecności środków farmakologicznych hamujących makropinocytozę za pomocą cytometrii przepływowej i obrazowania konfokalnego21,22. Obecnie dostępne narzędzia farmakologiczne hamujące makropinocytozę ograniczają się do 1) inhibitorów polimeryzacji aktyny (cytochalazyna D i latrunkuliny), 2) blokerów PI3K (LY-290042 i wortmanniny) oraz 3) inhibitorów wymieniaczy wodoru sodu (NHE) (amiloryd i EIPA)5,14,15,23,24,25. Ponieważ jednak inhibitory te mają działanie niezależne od endocytozy, trudno jest selektywnie określić udział makropinocytozy w wychwytywaniu substancji rozpuszczonej i patogenezie choroby, zwłaszcza in vivo21.
Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) to rodzaj mikroskopu elektronowego, który tworzy obrazy komórek o ultrawysokiej rozdzielczości za pomocą skupionej wiązki elektronów26. W badaniach nad makropinocytozą obrazowanie SEM jest uważane za złoty standard techniki wizualizacji cech topograficznych i morfologicznych błony plazmatycznej, ilościowego określania powstawania falban błony i badania ich postępu w kierunku internalizacji makropinosomów. Co więcej, skaningowa mikroskopia elektronowa w połączeniu z ilościowym oznaczaniem wychwytu substancji rozpuszczonej, w obecności i bez blokerów makropinocytozy, zapewnia wiarygodną strategię badania internalizacji substancji rozpuszczonej makropinocytozy in vitro. W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół przygotowania komórek do SEM, wizualizacji powierzchni komórki, ilościowego określenia powstawania falban i zbadania ich postępów w kierunku zamknięcia miseczki i internalizacji makropinosomów.

<table><tbody><tr><td>0,5% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>2% Aldehyd glutarowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>16320</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>281692</td><td></td></tr><tr><td>5-(N-etylo-N-izopropylo)-amiloryd</td><td>Sigma Life Science</td><td>A3085</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Cytometr</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>przepływowyZakładki z klejem węglowym</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>77825-09</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek Corning</td><td></td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle Medium</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gemini Bio</td><td>900-108</td><td></td></tr><tr><td>FitC-dekstran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 HERAcell 150i</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>Hummer Model 6.2 Napylarka napylana</td><td>Anatech USA</td><td>58565</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop</td><td></td><td></td> <td>elektronowy JSM-IT500HR</td></tr><tr><td>Szklana osłona mikroskopu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>forbol 12-mirystynian 13-octan</td><td>Millipore Sigma</td><td>524400</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 makrofag</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Samdri-790 Suszarka do punktów krytycznych</td><td>Tousimis Research Corporation</td><td>8778B</td><td></td></tr><tr><td>SEM Aluminiowe mocowania próbek</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>75220</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>kakodylanu sodu</td> Sciences <td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Texas red-dextra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1864</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr>Mikroskop <td></td><td></td><td></td><td>konfokalny Zeiss LSM 780</td></tr></tbody></table>

wizualizacja powstawania falban błony za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Visualizing Membrane Ruffle Formation using Scanning Electron Microscopy

Zmarszczenie błony to tworzenie ruchliwych wypukłości błony plazmatycznej zawierających siatkę nowo spolimeryzowanych włókien aktynowych. Falbany błonowe mogą tworzyć się spontanicznie lub w odpowiedzi na czynniki wzrostu, cytokiny zapalne i estry forbolu. Niektóre z wypukłości błony mogą reorganizować się w okrągłe falbany błony, które łączą się na swoich dystalnych brzegach i tworzą miseczki, które zamykają się i rozdzielają w cytoplazmie jako duże, niejednorodne wakuole zwane makropinosomami. Podczas tego procesu falbany zatrzymują płyn zewnątrzkomórkowy i substancje rozpuszczone, które internalizują się w makropinosomach. Skaningowa mikroskopia elektronowa o wysokiej rozdzielczości (SEM) jest powszechnie stosowaną techniką obrazowania do wizualizacji i ilościowego określania powstawania falban błonowych, okrągłych wypukłości i zamkniętych miseczek makropinocytycznych na powierzchni komórki. Poniższy protokół opisuje warunki hodowli komórkowej, stymulację tworzenia się falban błony in vitro oraz sposób utrwalania, odwadniania i przygotowania komórek do obrazowania za pomocą SEM. Opisano również ilościowe oznaczanie marszczenia błony, normalizację danych oraz stymulatory i inhibitory powstawania falbowania błony. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli makropinocytozy w procesach fizjologicznych i patologicznych, zbadać nowe cele regulujące powstawanie falban błonowych oraz zidentyfikować jeszcze niescharakteryzowane stymulatory fizjologiczne, a także nowe farmakologiczne inhibitory makropinocytozy.

W niniejszej pracy opisujemy wyniki uzyskane przy zastosowaniu przedstawionej techniki. Reprezentatywne obrazy SEM przedstawione na Ryc. 1 wykazują tworzenie się fałdów błonowych w makrofagach RAW 264.7 po traktowaniu PMA i M-CSF. Obrazy zostały najpierw zarejestrowane przy powiększeniu 3 500x w celu ilościowego oznaczenia, a następnie przy większych powiększeniach (od 8 500x do 16 000x), aby ukazać błonę plazmatyczną w większych szczegółach. Wstępne traktowanie makrofagów inhibitorem makrop...

Makropinocytoza to wysoce konserwatywny proces endocytarny, zainicjowany przez tworzenie bogatych w F-aktynę warstwowych wypustek błonowych, znanych również jako falbany błonowe. Zwiększona szybkość internalizacji substancji rozpuszczonej makropinocytozy jest związana z różnymi stanami patologicznymi. W protokole tym przedstawiono metodę ilościowego określania powstawania falban błonowych in vitro przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej.

Wizualizacja powstawania falban błony za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Membrane ruffling is the formation of motile plasma membrane protrusions containing a meshwork of newly polymerized actin filaments. Membrane ruffles may ...

Obecny protokół obrazowania SEM zapewnia narzędzie do wizualizacji i ilościowego określenia powstawania falban błonowych, okrągłych wypukłości i miseczek makropinocytarnych na powierzchni komórki in vitro. SEM zapewnia obrazy powierzchni komórki o wysokiej rozdzielczości, które można wykorzystać do wizualizacji aktywności błony makropinocytarnej. Technika ta może być wykorzystana do odkrycia nowych szlaków sygnałowych regulujących makropinocytozę oraz identyfikacji nowych stymulatorów i inhibitorów mikropinocytozy.Rozpocznij od umieszczenia sterylnych szklanych szkiełek nakrywkowych w dołkach 24-dołkowej płytki za pomocą autoklawowanych kleszczy. Następnie wysiewaj surowe makrofagi 264,7 na szkiełka nakrywkowe o gęstości od 10 do szóstych komórek na mililitr i inkubuj płytkę przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zastąp pożywkę w każdym dołku 500 mikrolitrami świeżej, kompletnej pożywki, a następnie poddaj makrofagi wstępnej obróbce przez 30 minut za pomocą kontroli nośnika, takiej jak DMSO lub inhibitora makropinocytozy, takiego jak EIPA.Następnie, aby pobudzić marszczenie błony, potraktuj komórki przez 30 minut stymulatorami makropinocytozy, takimi jak jednomikromolowy roztwór PMA lub 100 nanogramów na mililitr czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów. Aby utrwalić komórki do skaningowej mikroskopii elektronowej, należy odessać pożywkę z dołków i dwukrotnie umyć szkiełka nakrywkowe lodowatym PBS, a następnie inkubować szkiełka nakrywkowe w utrwalaczu przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia, nie naruszając monowarstwy komórek, delikatnie umyć, a następnie inkubować szkiełka nakrywkowe w 500 mikrolitrach 0,1-silnikowego kakodylanu sodu przez 15 minut.Po dwukrotnym przemyciu 500 mikrolitrami wody destylowanej, przemyć szkiełka nakrywkowe dwukrotnie w 500 mikrolitrach serii klasyfikowanego etanolu z 10-minutową inkubacją w każdym praniu. Aby przeprowadzić suszenie w punkcie krytycznym, umieść szkiełka nakrywkowe w suszarce w punkcie krytycznym i przykryj je 100% etanolem. Następnie naciśnij przycisk zasilania i otwórz zbiornik dwutlenku węgla.Naciśnij przycisk chłodzenia przez około 30 sekund, aż temperatura spadnie do zera stopni Celsjusza. Następnie naciskaj przycisk napełniania, aż w oknie komory pojawi się bańka. Następnie naciśnij przycisk przedmuchiwania, aż zapach etanolu z wydechu odpowietrzającego zniknie.Następnie ponownie naciśnij przycisk chłodzenia, aż temperatura spadnie do zera stopni Celsjusza. Ponownie naciśnij przyciski pełnego i czystego, aby je wyłączyć. Następnie zamknij zbiornik dwutlenku węgla.Ponownie naciśnij chłodne dno, aby je wyłączyć, a następnie naciśnij przycisk podgrzewania. Ustaw temperaturę na 42 stopnie Celsjusza i ciśnienie na 1,200 funtów na cal kwadratowy. Gdy ciśnienie i temperatura ustabilizują się, naciśnij przycisk odpowietrzania, aby ciśnienie powoli spadało.Gdy ciśnienie w komorze osiągnie 150 funtów na cal kwadratowy, naciśnij dno odpowietrznika i poczekaj, aż ciśnienie spadnie do zera funtów na cal kwadratowy. Wyłącz suszarkę do punktu krytycznego i usuń szkiełka nakrywkowe. Następnie, za pomocą gwintowników z klejem węglowym, zamontuj szkiełka nakrywkowe na aluminiowych mocowaniach próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej, a następnie przystąp do napylania za pomocą złota lub palladu w powlekarce do natryskiwania.Włącz przycisk zasilania napylarki. Gdy podciśnienie osiągnie 30 militorów, przepłucz komorę, aby usunąć wilgoć i powietrze, wyłączając przełącznik gazu i obracając zawór drobnego gazu w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Gdy podciśnienie wzrośnie do 200 militorów, wyłącz przełącznik gazu i poczekaj, aż podciśnienie osiągnie 30 militorów.Następnie ponownie przepłucz komorę, aby usunąć wilgoć i powietrze, jak pokazano. Po trzykrotnym przepłukaniu komory popchnij dolny spód timera i wyreguluj pokrętło napięcia, aż miernik wskaże 10 miliamperów. Następnie usuń powlekane szkiełka nakrywkowe z komory.Aby uwidocznić i określić ilościowo marszczenia membrany, włóż szkiełka pokrywy próbki do komory skaningowego mikroskopu elektronowego, zamknij drzwiczki i naciśnij przycisk evac. Otwórz oprogramowanie operacyjne mikroskopu i ustaw napięcie przyspieszania na 15 kilowoltów, a odległość roboczą na 10 milimetrów. Naciśnij przycisk Współrzędne i poruszaj się po kontrolerze, aż komórki pojawią się na środku ekranu obserwacji.Ustaw powiększenie na 3 500 X i zobrazuj próbkę, klikając przycisk Zdjęcie. Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy ze skaningowej mikroskopii elektronowej, wykazujące tworzenie się falban błonowych w surowych makrofagach 264,7 po leczeniu PMA i czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów. Wstępne traktowanie makrofagów inhibitorem makropinocytozy EIPA osłabia tworzenie się falban błonowych.Podczas tworzenia falban błona plazmatyczna przechodzi różne etapy morfologiczne, w tym występ błony przypominający arkusz, falbanie błony w kształcie litery C i miseczkę makropinocytową. Powstawanie falban błony po leczeniu PMA i czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów można określić ilościowo za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, podczas gdy tworzenie makropinosomów można potwierdzić za pomocą alternatywnych technik obrazowania, takich jak mikroskopia konfokalna z użyciem czerwonego dekstranu Texas i FM4-64. Niebieskie strzałki wskazują marszczenie błony, podczas gdy żółte i zielone strzałki wskazują na mikropinosomy.Wreszcie, makropinocytozę można potwierdzić i określić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluorescencyjnego markera fazy płynnej, takiego jak FITC lub czerwony dekstran Texas. Oprócz SEM można również przeprowadzić obrazowanie żywych komórek i analizę cytometrii przepływowej internalizacji dekstranu znakowanej fluorescencyjnie w celu zbadania i ilościowego określenia makropinocytozy.

visualizing-membrane-ruffle-formation-using-scanning-electron

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film pokazuje przygotowanie próbki, utrwalenie i obrazowanie komórki makrofagowej, która wykazuje zmarszczki błony za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, SEM. Szczegółowe informacje na temat morfologii i organizacji błony są kluczowe dla zrozumienia stanu fizjologicznego komórek.

Kwantyfikacja powstawania falban błonowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Opisano podstawowe techniki i udoskonalenia przetwarzania próbek biologicznych i nanomateriałów do badania metodą zamrażania i pękania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika ta jest preferowaną metodą ujawniania cech ultrastrukturalnych i specjalizacji błon biologicznych oraz uzyskiwania danych wymiarowych i przestrzennych na poziomie ultrastrukturalnym w materiałoznawstwie i produktach nanotechnologii.

Podstawowe elementy techniczne zamrażania-pękania/wytrawiania przez zamrożenie w biologicznej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Dwuwarstwowe membrany fosfolipidowe (DLBM) z solidnym wsparciem, wolne od białek, mogą być przekształcane w złożone i dynamiczne sieci nanorurek lipidowych i mogą służyć jako oddolne modele 2D retikulum endoplazmatycznego.

Spontaniczne powstawanie i rearanżacja sztucznych sieci nanorurek lipidowych jako model oddolny retikulum endoplazmatycznego

Opisujemy przygotowanie wstęg odcinków szeregowych i ich zbieranie na dużym nośniku transferu do użycia jako próbki tomografii matrycowej, wraz z automatycznymi procedurami obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym. Protokół umożliwia badania przesiewowe, wyszukiwanie i ukierunkowane obrazowanie miejscowych, rzadkich zdarzeń oraz pozyskiwanie dużych ilości danych.

Tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Septyny to białka cytoszkieletu. Oddziałują z błonami lipidowymi i mogą wykrywać, ale także generować krzywiznę błony w skali mikronów. W tym protokole opisujemy oddolne metodologie in vitro do analizy deformacji błony, wrażliwego na krzywiznę wiązania septyny i ultrastruktury włókien septyny.

Oddolne metody in vitro do oznaczania organizacji ultrastrukturalnej, kształtowania błony i zachowania wrażliwości na krzywiznę septyn

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Poznaj metodę wizualizacji i ilościowej oceny powstawania falban błonowych oraz aktywności makropinocytozy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej w makrofagach RAW 264.7.

Wizualizacja powstawania falban błony za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów