Wizualizacja powstawania falban błony za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej
27 maja 2021
Makropinocytoza to wysoce konserwatywny proces endocytarny, zainicjowany przez tworzenie bogatych w F-aktynę warstwowych wypustek błonowych, znanych również jako falbany błonowe. Zwiększona szybkość internalizacji substancji rozpuszczonej makropinocytozy jest związana z różnymi stanami patologicznymi. W protokole tym przedstawiono metodę ilościowego określania powstawania falban błonowych in vitro przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej.
Obecny protokół obrazowania SEM zapewnia narzędzie do wizualizacji i ilościowego określenia powstawania falban błonowych, okrągłych wypukłości i miseczek makropinocytarnych na powierzchni komórki in vitro. SEM zapewnia obrazy powierzchni komórki o wysokiej rozdzielczości, które można wykorzystać do wizualizacji aktywności błony makropinocytarnej. Technika ta może być wykorzystana do odkrycia nowych szlaków sygnałowych regulujących makropinocytozę oraz identyfikacji nowych stymulatorów i inhibitorów mikropinocytozy.
Rozpocznij od umieszczenia sterylnych szklanych szkiełek nakrywkowych w dołkach 24-dołkowej płytki za pomocą autoklawowanych kleszczy. Następnie wysiewaj surowe makrofagi 264,7 na szkiełka nakrywkowe o gęstości od 10 do szóstych komórek na mililitr i inkubuj płytkę przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zastąp pożywkę w każdym dołku 500 mikrolitrami świeżej, kompletnej pożywki, a następnie poddaj makrofagi wstępnej obróbce przez 30 minut za pomocą kontroli nośnika, takiej jak DMSO lub inhibitora makropinocytozy, takiego jak EIPA.
Następnie, aby pobudzić marszczenie błony, potraktuj komórki przez 30 minut stymulatorami makropinocytozy, takimi jak jednomikromolowy roztwór PMA lub 100 nanogramów na mililitr czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów. Aby utrwalić komórki do skaningowej mikroskopii elektronowej, należy odessać pożywkę z dołków i dwukrotnie umyć szkiełka nakrywkowe lodowatym PBS, a następnie inkubować szkiełka nakrywkowe w utrwalaczu przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia, nie naruszając monowarstwy komórek, delikatnie umyć, a następnie inkubować szkiełka nakrywkowe w 500 mikrolitrach 0,1-silnikowego kakodylanu sodu przez 15 minut.
Po dwukrotnym przemyciu 500 mikrolitrami wody destylowanej, przemyć szkiełka nakrywkowe dwukrotnie w 500 mikrolitrach serii klasyfikowanego etanolu z 10-minutową inkubacją w każdym praniu. Aby przeprowadzić suszenie w punkcie krytycznym, umieść szkiełka nakrywkowe w suszarce w punkcie krytycznym i przykryj je 100% etanolem. Następnie naciśnij przycisk zasilania i otwórz zbiornik dwutlenku węgla.
Naciśnij przycisk chłodzenia przez około 30 sekund, aż temperatura spadnie do zera stopni Celsjusza. Następnie naciskaj przycisk napełniania, aż w oknie komory pojawi się bańka. Następnie naciśnij przycisk przedmuchiwania, aż zapach etanolu z wydechu odpowietrzającego zniknie.
Następnie ponownie naciśnij przycisk chłodzenia, aż temperatura spadnie do zera stopni Celsjusza. Ponownie naciśnij przyciski pełnego i czystego, aby je wyłączyć. Następnie zamknij zbiornik dwutlenku węgla.
Ponownie naciśnij chłodne dno, aby je wyłączyć, a następnie naciśnij przycisk podgrzewania. Ustaw temperaturę na 42 stopnie Celsjusza i ciśnienie na 1,200 funtów na cal kwadratowy. Gdy ciśnienie i temperatura ustabilizują się, naciśnij przycisk odpowietrzania, aby ciśnienie powoli spadało.
Gdy ciśnienie w komorze osiągnie 150 funtów na cal kwadratowy, naciśnij dno odpowietrznika i poczekaj, aż ciśnienie spadnie do zera funtów na cal kwadratowy. Wyłącz suszarkę do punktu krytycznego i usuń szkiełka nakrywkowe. Następnie, za pomocą gwintowników z klejem węglowym, zamontuj szkiełka nakrywkowe na aluminiowych mocowaniach próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej, a następnie przystąp do napylania za pomocą złota lub palladu w powlekarce do natryskiwania.
Włącz przycisk zasilania napylarki. Gdy podciśnienie osiągnie 30 militorów, przepłucz komorę, aby usunąć wilgoć i powietrze, wyłączając przełącznik gazu i obracając zawór drobnego gazu w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Gdy podciśnienie wzrośnie do 200 militorów, wyłącz przełącznik gazu i poczekaj, aż podciśnienie osiągnie 30 militorów.
Następnie ponownie przepłucz komorę, aby usunąć wilgoć i powietrze, jak pokazano. Po trzykrotnym przepłukaniu komory popchnij dolny spód timera i wyreguluj pokrętło napięcia, aż miernik wskaże 10 miliamperów. Następnie usuń powlekane szkiełka nakrywkowe z komory.
Aby uwidocznić i określić ilościowo marszczenia membrany, włóż szkiełka pokrywy próbki do komory skaningowego mikroskopu elektronowego, zamknij drzwiczki i naciśnij przycisk evac. Otwórz oprogramowanie operacyjne mikroskopu i ustaw napięcie przyspieszania na 15 kilowoltów, a odległość roboczą na 10 milimetrów. Naciśnij przycisk Współrzędne i poruszaj się po kontrolerze, aż komórki pojawią się na środku ekranu obserwacji.
Ustaw powiększenie na 3 500 X i zobrazuj próbkę, klikając przycisk Zdjęcie. Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy ze skaningowej mikroskopii elektronowej, wykazujące tworzenie się falban błonowych w surowych makrofagach 264,7 po leczeniu PMA i czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów. Wstępne traktowanie makrofagów inhibitorem makropinocytozy EIPA osłabia tworzenie się falban błonowych.
Podczas tworzenia falban błona plazmatyczna przechodzi różne etapy morfologiczne, w tym występ błony przypominający arkusz, falbanie błony w kształcie litery C i miseczkę makropinocytową. Powstawanie falban błony po leczeniu PMA i czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów można określić ilościowo za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, podczas gdy tworzenie makropinosomów można potwierdzić za pomocą alternatywnych technik obrazowania, takich jak mikroskopia konfokalna z użyciem czerwonego dekstranu Texas i FM4-64. Niebieskie strzałki wskazują marszczenie błony, podczas gdy żółte i zielone strzałki wskazują na mikropinosomy.
Wreszcie, makropinocytozę można potwierdzić i określić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluorescencyjnego markera fazy płynnej, takiego jak FITC lub czerwony dekstran Texas. Oprócz SEM można również przeprowadzić obrazowanie żywych komórek i analizę cytometrii przepływowej internalizacji dekstranu znakowanej fluorescencyjnie w celu zbadania i ilościowego określenia makropinocytozy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania formowania się fałd membranowych i aktywności makropinocytarnej za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Podkreśla znaczenie makropinocytozy w różnych warunkach patologicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Techniki mikroskopowe
Tło
- Makropinocytoza jest zachowanym procesem endocytozy.
- Wiąże się z tworzeniem fałd membranowych napędzanych przez F-aktynę.
- Zwiększona makropinocytoza jest związana z różnymi chorobami.
- SEM zapewnia wysokiej rozdzielczości obrazy struktur komórkowych.
Cel badania
- Wizualizacja fałd membranowych i miseczek makropinocytarnych.
- Ilościowe określenie formowania się fałd membranowych in vitro.
- Identyfikacja szlaków sygnałowych regulujących makropinocytozę.
Stosowane metody
- Przygotowanie sterylnych szkiełek pokrywowych w płytce 24-dołkowej.
- Wysiew makrofagów RAW 264.7 w określonej gęstości.
- Inkubacja komórek w środowisku skondycjonowanym.
- Wykorzystanie SEM do obrazowania aktywności membranowych.
Główne wyniki
- Uzyskano wysokiej rozdzielczości obrazy fałd membranowych.
- Osiągnięto ilościowe określenie aktywności makropinocytarnej.
- Zidentyfikowano potencjalne szlaki sygnałowe.
- Oceniono wpływ inhibitorów na makropinocytozę.
Wnioski
- SEM jest skutecznym narzędziem do badania makropinocytozy.
- Protokół może pomóc w odkryciu nowych regulatorów tego procesu.
- Rozumienie makropinocytozy może prowadzić do wnikliwszego poznania mechanizmów chorobowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Visualizing membrane ruffle formation via SEM enables direct observation of macropinocytic activity, a key endocytic mechanism implicated in nutrient uptake, antigen presentation, and pathogen invasion. This imaging approach supports target validation by linking morphological changes to pharmacological modulation, aiding in the de-risking of early-stage hypotheses. Quantifiable surface dynamics provide a phenotypic readout for screening modulators of macropinocytosis in disease-relevant models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating stimulator/inhibitor treatment with quantifiable changes in membrane ruffle formation.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible imaging readout for assessing compound effects on macropinocytic activity.
- Predictive Value: Supports lead identification by identifying compounds that attenuate or enhance ruffle formation as a proxy for pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative morphological data (ruffle count, cup formation) suitable for high-content analysis and hit validation.
- Reproducibility: Standardized fixation and imaging protocols enable cross-experiment comparison and assay robustness.
- Scalability: Compatible with multi-well formats, allowing parallel testing of stimulators, inhibitors, or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links macropinocytic activity to physiological and pathological processes, supporting relevance in cancer, inflammation, and infectious disease models.
- Translational Continuity: Enables correlation of SEM-derived morphological data with functional assays (e.g., dextran uptake) for mechanistic validation.
- Risk Mitigation: Reduces ambiguity in target engagement by providing direct visual evidence of pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The SEM-based visualization of membrane ruffles fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and feeding into lead identification through phenotypic screening of macropinocytic modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing the effects of growth factors, cytokines, or pharmacological agents on membrane dynamics.
- Screening: Enables assay development for quantifying ruffle formation as a functional output in compound screening campaigns.
- Analytics: Provides morphometric data (ruffle frequency, cup closure) that can be normalized and compared across conditions to assess bioactive compound effects.
- Translational Research: Connects imaging findings to functional validation via complementary techniques like flow cytometry or confocal microscopy for fluid-phase uptake.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying macropinocytosis across multiple cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct visualization of membrane dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs via fixed protocols for sample preparation, imaging, and quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking compound treatment to observable phenotypic changes in macropinocytic activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated effects on a disease-relevant endocytic pathway.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fixation, and SEM operation for reliable imaging of membrane protrusions.
- Depends on access to SEM, critical point dryer, and sputter coater for sample preparation and imaging.
- Necessitates standardization across teams for consistent stimulation, fixation, and imaging parameters to ensure data comparability.
- Adaptation to primary cells or alternative models may require optimization of seeding density and stimulation conditions.
- Practical limitations include inability to capture dynamic processes in real time and reliance on fixed-cell endpoints.
