Wizualizacja powstawania falban błony za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Obecny protokół obrazowania SEM zapewnia narzędzie do wizualizacji i ilościowego określenia powstawania falban błonowych, okrągłych wypukłości i miseczek makropinocytarnych na powierzchni komórki in vitro. SEM zapewnia obrazy powierzchni komórki o wysokiej rozdzielczości, które można wykorzystać do wizualizacji aktywności błony makropinocytarnej. Technika ta może być wykorzystana do odkrycia nowych szlaków sygnałowych regulujących makropinocytozę oraz identyfikacji nowych stymulatorów i inhibitorów mikropinocytozy.

Rozpocznij od umieszczenia sterylnych szklanych szkiełek nakrywkowych w dołkach 24-dołkowej płytki za pomocą autoklawowanych kleszczy. Następnie wysiewaj surowe makrofagi 264,7 na szkiełka nakrywkowe o gęstości od 10 do szóstych komórek na mililitr i inkubuj płytkę przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zastąp pożywkę w każdym dołku 500 mikrolitrami świeżej, kompletnej pożywki, a następnie poddaj makrofagi wstępnej obróbce przez 30 minut za pomocą kontroli nośnika, takiej jak DMSO lub inhibitora makropinocytozy, takiego jak EIPA.

Następnie, aby pobudzić marszczenie błony, potraktuj komórki przez 30 minut stymulatorami makropinocytozy, takimi jak jednomikromolowy roztwór PMA lub 100 nanogramów na mililitr czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów. Aby utrwalić komórki do skaningowej mikroskopii elektronowej, należy odessać pożywkę z dołków i dwukrotnie umyć szkiełka nakrywkowe lodowatym PBS, a następnie inkubować szkiełka nakrywkowe w utrwalaczu przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia, nie naruszając monowarstwy komórek, delikatnie umyć, a następnie inkubować szkiełka nakrywkowe w 500 mikrolitrach 0,1-silnikowego kakodylanu sodu przez 15 minut.

Po dwukrotnym przemyciu 500 mikrolitrami wody destylowanej, przemyć szkiełka nakrywkowe dwukrotnie w 500 mikrolitrach serii klasyfikowanego etanolu z 10-minutową inkubacją w każdym praniu. Aby przeprowadzić suszenie w punkcie krytycznym, umieść szkiełka nakrywkowe w suszarce w punkcie krytycznym i przykryj je 100% etanolem. Następnie naciśnij przycisk zasilania i otwórz zbiornik dwutlenku węgla.

Naciśnij przycisk chłodzenia przez około 30 sekund, aż temperatura spadnie do zera stopni Celsjusza. Następnie naciskaj przycisk napełniania, aż w oknie komory pojawi się bańka. Następnie naciśnij przycisk przedmuchiwania, aż zapach etanolu z wydechu odpowietrzającego zniknie.

Następnie ponownie naciśnij przycisk chłodzenia, aż temperatura spadnie do zera stopni Celsjusza. Ponownie naciśnij przyciski pełnego i czystego, aby je wyłączyć. Następnie zamknij zbiornik dwutlenku węgla.

Ponownie naciśnij chłodne dno, aby je wyłączyć, a następnie naciśnij przycisk podgrzewania. Ustaw temperaturę na 42 stopnie Celsjusza i ciśnienie na 1,200 funtów na cal kwadratowy. Gdy ciśnienie i temperatura ustabilizują się, naciśnij przycisk odpowietrzania, aby ciśnienie powoli spadało.

Gdy ciśnienie w komorze osiągnie 150 funtów na cal kwadratowy, naciśnij dno odpowietrznika i poczekaj, aż ciśnienie spadnie do zera funtów na cal kwadratowy. Wyłącz suszarkę do punktu krytycznego i usuń szkiełka nakrywkowe. Następnie, za pomocą gwintowników z klejem węglowym, zamontuj szkiełka nakrywkowe na aluminiowych mocowaniach próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej, a następnie przystąp do napylania za pomocą złota lub palladu w powlekarce do natryskiwania.

Włącz przycisk zasilania napylarki. Gdy podciśnienie osiągnie 30 militorów, przepłucz komorę, aby usunąć wilgoć i powietrze, wyłączając przełącznik gazu i obracając zawór drobnego gazu w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Gdy podciśnienie wzrośnie do 200 militorów, wyłącz przełącznik gazu i poczekaj, aż podciśnienie osiągnie 30 militorów.

Następnie ponownie przepłucz komorę, aby usunąć wilgoć i powietrze, jak pokazano. Po trzykrotnym przepłukaniu komory popchnij dolny spód timera i wyreguluj pokrętło napięcia, aż miernik wskaże 10 miliamperów. Następnie usuń powlekane szkiełka nakrywkowe z komory.

Aby uwidocznić i określić ilościowo marszczenia membrany, włóż szkiełka pokrywy próbki do komory skaningowego mikroskopu elektronowego, zamknij drzwiczki i naciśnij przycisk evac. Otwórz oprogramowanie operacyjne mikroskopu i ustaw napięcie przyspieszania na 15 kilowoltów, a odległość roboczą na 10 milimetrów. Naciśnij przycisk Współrzędne i poruszaj się po kontrolerze, aż komórki pojawią się na środku ekranu obserwacji.

Ustaw powiększenie na 3 500 X i zobrazuj próbkę, klikając przycisk Zdjęcie. Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy ze skaningowej mikroskopii elektronowej, wykazujące tworzenie się falban błonowych w surowych makrofagach 264,7 po leczeniu PMA i czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów. Wstępne traktowanie makrofagów inhibitorem makropinocytozy EIPA osłabia tworzenie się falban błonowych.

Podczas tworzenia falban błona plazmatyczna przechodzi różne etapy morfologiczne, w tym występ błony przypominający arkusz, falbanie błony w kształcie litery C i miseczkę makropinocytową. Powstawanie falban błony po leczeniu PMA i czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów można określić ilościowo za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, podczas gdy tworzenie makropinosomów można potwierdzić za pomocą alternatywnych technik obrazowania, takich jak mikroskopia konfokalna z użyciem czerwonego dekstranu Texas i FM4-64. Niebieskie strzałki wskazują marszczenie błony, podczas gdy żółte i zielone strzałki wskazują na mikropinosomy.

Wreszcie, makropinocytozę można potwierdzić i określić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluorescencyjnego markera fazy płynnej, takiego jak FITC lub czerwony dekstran Texas. Oprócz SEM można również przeprowadzić obrazowanie żywych komórek i analizę cytometrii przepływowej internalizacji dekstranu znakowanej fluorescencyjnie w celu zbadania i ilościowego określenia makropinocytozy.