Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej
March 5th, 2017
Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja wiązania zewnętrznego białka błonowego na powierzchni błony nanodysku za pomocą mikroskopii elektronowej z ujemnym przebarwieniem, co jest pierwszym krokiem w kierunku określenia struktury białka w wysokiej rozdzielczości. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w kilku dziedzinach badawczych, ponieważ dotyczy aktywności białek zachodzących w błonach komórkowych i na nich. Główną zaletą tej techniki są charakterystyczne stosy nanodysków tworzących się, jeśli białko nie może związać się z błonami.
Stosy te są wyraźnie widoczne w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku opracowywania leków, ponieważ związki można łatwo badać pod kątem zdolności do blokowania lub umożliwiania interakcji białek błonowych. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat optymalnych warunków wiązania białek monotopowych z błoną, zapewnia również strukturę kompleksu nanodysków białkowych o niskiej rozdzielczości.
Aby rozpocząć procedurę, należy stłoczyć i oczyścić białko rusztowania błonowego, takie jak MSP1E3D1. Następnie za pomocą szklanej strzykawki z metalową igłą dozować 305 mikrolitrów po 25 miligramów na mililitr POPC w chloroformie do szklanej kolby okrągłodennej. Odparować chloroform pod delikatnym strumieniem azotu gazowego w dygestorium.
Pozostały lipid wysuszyć przez noc w eksykatorze próżniowym. Następnie wysuszony placek lipidowy rozpuścić w 200 mikrolitrach standardowego buforu MSP wzbogaconego 100 milimolowym cholanem sodu jako detergentem. Zmieszać mieszaninę do momentu przeźroczystości w celu uzyskania zawiesiny 50 milimolowego POPC w buforze.
Następnie umyj pięć gramów kulek hydrofobowych 30 mililitrami 100% metanolu, następnie 40 mililitrami ultraczystej wody, a na końcu 10 mililitrami standardowego buforu MSP. Przechowuj kulki w 15 mililitrach standardowego bufora w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie połącz 190 mikrolitrów 0,124 milimolowego roztworu MSP1E3D1 i 61,5 mikrolitrów 50 milimolowej zawiesiny POPC w buforze, co daje stosunek MSP do POPC od 1 do 130 molów i stężenie cholanu sodu 25 milimolów.
Idealny stosunek lipidów na MSP różni się w zależności od rodzaju lipidu i soczewki MSP i musi być zoptymalizowany, aby uzyskać jednorodny preparat nanodysków. Inkubować mieszaninę na mokrym lodzie przez godzinę. Następnie dodaj roztwór do probówki zawierającej 0,5 grama umytych hydrofobowych ziaren na mililitr mieszaniny do rozpuszczenia, aby zainicjować samoorganizację nanodysku.
Inkubować mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 godzin przy siedmiu do ośmiu obrotach na minutę. Po inkubacji pozwól koralikom osiąść grawitacyjnie. Wyjąć i przechowywać supernatant w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie gotowy do przeprowadzenia chromatografii wykluczającej wielkość osadu.
Przed chromatografią wykluczania wielkości odwirować mieszaninę przy 13 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować supernatant i wyrzucić osad. Zrównoważyć kolumnę chromatografii wykluczania wielkości z buforem wzorcowym MSP, aż linia podstawowa przy 280 nanometrach będzie stabilna.
Wstrzyknąć supernatant do kolumny i zebrać produkt w frakcjach 0,5 mililitra. Zmierzyć absorbancję frakcji w odległości 280 nanometrów za pomocą spektrofotometru UV vis. Oblicz stężenie nanodysków, korzystając ze współczynnika ekstynkcji molowej dla wybranego MSP.
Aby przeprowadzić elektroforezę w żelu niedenaturującym, należy najpierw zmieszać 15 mikrolitrów próbki z pięcioma mikrolitrami odpowiedniego buforu ładującego. Napełnij zbiornik katodowy lekkim buforem katody, a zbiornik anodowy buforem roboczym. Załaduj próbkę na żel Bis-Tris o stężeniu od czterech do 16% i rozpocznij bieg.
Zabarwić żel zgodnie z instrukcjami producenta żelu. Aby rozpocząć przygotowanie monotopowego kompleksu białkowego nanodysku z pięcioma lipooksygenazami jako białkiem, należy przygotować partię standardowego buforu MSP wzbogaconego 1,5 milimolowym chlorkiem wapnia. Ekspresja i oczyszczanie białka 5LO.
Natychmiast przygotować 100 mikrolitrową mieszaninę 0,8 mikromolowych 5LO i 0,8 mikromolowych nanokrążków w standardowym buforze MSP wzbogaconym w wapń. Nasz przykład proteinazy monotopowej z pięcioma lipooksygenazą zależy od ilości wapnia, które wiążą się z błoną. 5LO jest bardzo wrażliwy i musi być zużyty w ciągu kilku godzin od przygotowania.
Inkubuj mieszaninę na lodzie przez 10 minut. Otrzymaną próbkę kompleksu białek nanodyskowych należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca. Aby rozpocząć przygotowania do analizy TEM, rozpuść jeden gram soli fosfotowoldoganowej w 50 mililitrach ultraczystej wody o temperaturze pokojowej.
Doprowadzić pH roztworu do 7,4 za pomocą jednomolowego roztworu wodorotlenku sodu. Przefiltrować roztwór fosfongaianu sodu przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 mikrometra i przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej. Następnie wyładowanie jarzeniowe z siatki miedzianej pokrytej węglem o siatce 400 mesh przez 20 sekund przy 30 miliamperach, aby powierzchnia siatki była hydrofilowa.
Umieścić od 2,5 do pięciu mikrolitrów próbki monotopowego kompleksu białkowego nanodysku na siatce i pozostawić próbkę na 30 sekund. Następnie użyj bibuły filtracyjnej, aby zetrzeć nadmiar roztworu z siatki. Natychmiast nanieść kroplę roztworu fosfongianianu sodu i pozostawić roztwór na 30 sekund.
Zetrzyj nadmiar roztworu i pozostaw siatkę do wyschnięcia na powietrzu. Wykonaj transmisyjną mikroskopię elektronową z przyspieszonym napięciem od 120 do 200 kilowoltów. Wyklucz obrazy z długimi stosami z późniejszego przetwarzania obrazu.
W przypadku wybranych obrazów należy użyć standardowych metod przetwarzania w celu wyznaczenia średnich klas i wygenerowania modelu 3D białka monotopowego nanodysku o niskiej rozdzielczości. Za pomocą tej metody przygotowano puste nanodyski o stosunku 1 do 130 białek rusztowania błonowego do lipidów. Podczas chromatografii wykluczającej wielkość zaobserwowano tylko jeden duży pik i tylko jedno pasmo zaobserwowano w elektroforezie w niebieskim natywnym żelu.
Gdy puste nanodyski zostaną potraktowane roztworem soli fosfonkruszanowej sodu, indukowane jest układanie w stosy. Te długie stosy mogą być następnie obserwowane przez TEM. To układanie nie zostało zakłócone przez włączenie jonów wapnia do roztworu nanodysku przed zastosowaniem roztworu fosfoungianu sodu.
Kiedy białko monotopowe, takie jak pięć lipooksygenaz, jest związane z powierzchnią nanodysku, układanie w stosy jest utrudnione przez niedrożność stearynową przez białko. Obie strony nanodysku są dostępne do wiązania, co pozwala na tworzenie kompleksów nanodysków 5LO jeden do jednego i dwóch do jednego. Próbka dwóch do jednego kompleksów nanodysków 5LO wykazywała mniejsze układanie w stosy niż próbka jeden do jednego.
Wiązanie 5LO wymaga obecności jonów wapnia. Zostało to potwierdzone przez obserwację układania w mieszaninie 5LO i nanodysków bez wapnia, co wskazywało, że 5LO nie wiązało się z powierzchniami membrany. Po przygotowaniu białka monotopowego i nanodysków, ocena wiązania białka z błoną może zostać przeprowadzona w ciągu popołudnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podczas próby tej procedury ważne jest, aby oszacować obszar białka na nanodysku, aby wybrać odpowiednią długość MSP. W przypadku dobrze dopasowanych rozmiarów, maksymalnie dwa białka zewnętrzne mogą wiązać się po jednym z każdej strony dysku. Ważne jest również, aby sól sodowa fosofotungsenu była używana do ujemnego stanowiska, aby zapewnić maksymalne ułożenie w stos, ponieważ wiązanie potwierdza się przez porównanie braku stosów z długimi stosami próbki bez białka monotopowego.
Zastosowanie nanodysków zamiast liposomów umożliwia wykorzystanie dynamicznego rozpraszania światła, rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące jednorodności, wielkości próbki lub struktury molekularnej. Struktura 3D monotopowego białka błonowego o niskiej rozdzielczości połączonego z nanodyskiem może być łatwo dostępnym pierwszym krokiem na drodze do uzyskania struktury o wysokiej rozdzielczości tych związanych białek.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie demonstruje metodę wizualizacji wiązania białek zewnętrznych membranowych z membranami nanodysków za pomocą mikroskopii transmisyjnej z ujemnym barwieniem. Technika ta ujawnia, w jaki sposób wiązanie białek może zapobiegać charakterystycznemu układaniu się nanodysków, dostarczając informacji na temat interakcji białko-membrana.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Biologia strukturalna
Tło
- Białka zewnętrzne odgrywają kluczową rolę w funkcjach błon komórkowych.
- Mikroskopia transmisyjna z ujemnym barwieniem jest cenną techniką obrazowania.
- Nanodysków używa się jako modelowych membran do badania interakcji białek.
- Rozumienie wiązania białek jest niezbędne dla rozwoju leków i biologii strukturalnej.
Cel badania
- Aby wizualizować wiązanie białek zewnętrznych na membranach nanodysków.
- Aby zbadać implikacje interakcji białek dla przesiewowego badania leków.
- Aby dostarczyć strukturę niskiej rozdzielczości kompleksu białko-nanodysk.
Zastosowane metody
- Mikroskopia transmisyjna z ujemnym barwieniem.
- Przygotowanie membran nanodysków.
- Testy wiązania białek zewnętrznych.
- Analiza wzorców układania się nanodysków.
Główne wyniki
- Wiązanie białek zewnętrznych zapobiega tworzeniu się stosów nanodysków.
- Charakterystyczne wzorce układania się są widoczne, gdy białka nie wiążą się.
- Metoda zapewnia informacje na temat optymalnych warunków wiązania białek.
- Podkreśla potencjalne zastosowania w rozwoju leków.
Wnioski
- Ta technika jest skuteczna w badaniu interakcji białko-membrana.
- Oferuje ścieżkę do wyznaczania wysokorozdzielczej struktury.
- Wyniki mają zastosowanie do zrozumienia funkcji białek membranowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables visualization of extrinsic membrane protein binding to nanodiscs via negative stain TEM, where protein binding prevents characteristic nanodisc stacking. It provides a rapid, low-resolution structural readout to de-risk target validation and inform early-stage drug screening for membrane-associated proteins. The approach supports go/no-go decisions by confirming binding under defined lipid and ionic conditions before committing resources to high-resolution structural work.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms membrane binding of extrinsic proteins through direct visualization of inhibited nanodisc stacking.
- Operational Value: Enables rapid assessment of protein-lipid interactions in a controlled membrane mimetic system.
- Predictive Value: Supports target validation by demonstrating binding dependence on cofactors such as calcium ions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Allows screening of compounds that modulate protein-membrane binding by measuring changes in nanodisc stacking patterns.
- Operational Value: Uses accessible negative stain TEM infrastructure for high-contrast imaging without cryo-EM requirements.
- Assay Readiness: Generates samples compatible with downstream structural workflows including single-particle analysis and non-denaturing gels.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides low-resolution structural insights that can guide higher-resolution cryo-EM studies of protein-nanodisc complexes.
- Mechanistic De-risking: Clarifies steric and spatial constraints of protein binding on both sides of the nanodisc.
- Disease-Relevant System: Models peripheral membrane protein interactions relevant to signaling pathways in inflammation and lipid metabolism.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical mechanistic studies, offering a bridge between biochemical binding assays and high-resolution structure determination.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by visualizing whether a protein binds to a membrane surface under defined conditions.
- Screening: Produces quantitative imaging readouts (stacking vs. non-stacking) that can be scored for compound effects on membrane binding.
- Analytics: Enables class averaging and 3D modeling of protein-nanodisc complexes to generate low-resolution structural data for target characterization.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical work by providing structural context for protein function in lipid environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing multiple peripheral membrane proteins across different lipid compositions and buffer conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Direct visualization of binding events and low-resolution structural insights reduce ambiguity in mechanistic models.
- Operational Value: Leverages widely available TEM equipment and standard negative staining protocols for broad accessibility.
- Strategic Value: Increases confidence in target engagement data, reducing failure rates in downstream structural and functional validation.
- Portfolio Impact: Enables early triage of targets based on confirmed membrane binding, improving capital efficiency in discovery pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, nanodisc reconstitution, and negative stain TEM sample preparation.
- Dependent on access to transmission electron microscopy and UV-Vis spectroscopy for nanodisc quantification.
- Necessitates optimization of lipid-to-scaffold ratios and buffer conditions for each protein-lipid system.
- Involves handling of air-sensitive lipids and phosphotungstate stain under controlled conditions.
- Limited to proteins that do not induce stacking themselves; binding is inferred from absence of stacks relative to controls.
