Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej
5 marca 2017
Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja wiązania zewnętrznego białka błonowego na powierzchni błony nanodysku za pomocą mikroskopii elektronowej z ujemnym przebarwieniem, co jest pierwszym krokiem w kierunku określenia struktury białka w wysokiej rozdzielczości. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w kilku dziedzinach badawczych, ponieważ dotyczy aktywności białek zachodzących w błonach komórkowych i na nich. Główną zaletą tej techniki są charakterystyczne stosy nanodysków tworzących się, jeśli białko nie może związać się z błonami.
Stosy te są wyraźnie widoczne w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku opracowywania leków, ponieważ związki można łatwo badać pod kątem zdolności do blokowania lub umożliwiania interakcji białek błonowych. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat optymalnych warunków wiązania białek monotopowych z błoną, zapewnia również strukturę kompleksu nanodysków białkowych o niskiej rozdzielczości.
Aby rozpocząć procedurę, należy stłoczyć i oczyścić białko rusztowania błonowego, takie jak MSP1E3D1. Następnie za pomocą szklanej strzykawki z metalową igłą dozować 305 mikrolitrów po 25 miligramów na mililitr POPC w chloroformie do szklanej kolby okrągłodennej. Odparować chloroform pod delikatnym strumieniem azotu gazowego w dygestorium.
Pozostały lipid wysuszyć przez noc w eksykatorze próżniowym. Następnie wysuszony placek lipidowy rozpuścić w 200 mikrolitrach standardowego buforu MSP wzbogaconego 100 milimolowym cholanem sodu jako detergentem. Zmieszać mieszaninę do momentu przeźroczystości w celu uzyskania zawiesiny 50 milimolowego POPC w buforze.
Następnie umyj pięć gramów kulek hydrofobowych 30 mililitrami 100% metanolu, następnie 40 mililitrami ultraczystej wody, a na końcu 10 mililitrami standardowego buforu MSP. Przechowuj kulki w 15 mililitrach standardowego bufora w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie połącz 190 mikrolitrów 0,124 milimolowego roztworu MSP1E3D1 i 61,5 mikrolitrów 50 milimolowej zawiesiny POPC w buforze, co daje stosunek MSP do POPC od 1 do 130 molów i stężenie cholanu sodu 25 milimolów.
Idealny stosunek lipidów na MSP różni się w zależności od rodzaju lipidu i soczewki MSP i musi być zoptymalizowany, aby uzyskać jednorodny preparat nanodysków. Inkubować mieszaninę na mokrym lodzie przez godzinę. Następnie dodaj roztwór do probówki zawierającej 0,5 grama umytych hydrofobowych ziaren na mililitr mieszaniny do rozpuszczenia, aby zainicjować samoorganizację nanodysku.
Inkubować mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 godzin przy siedmiu do ośmiu obrotach na minutę. Po inkubacji pozwól koralikom osiąść grawitacyjnie. Wyjąć i przechowywać supernatant w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie gotowy do przeprowadzenia chromatografii wykluczającej wielkość osadu.
Przed chromatografią wykluczania wielkości odwirować mieszaninę przy 13 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować supernatant i wyrzucić osad. Zrównoważyć kolumnę chromatografii wykluczania wielkości z buforem wzorcowym MSP, aż linia podstawowa przy 280 nanometrach będzie stabilna.
Wstrzyknąć supernatant do kolumny i zebrać produkt w frakcjach 0,5 mililitra. Zmierzyć absorbancję frakcji w odległości 280 nanometrów za pomocą spektrofotometru UV vis. Oblicz stężenie nanodysków, korzystając ze współczynnika ekstynkcji molowej dla wybranego MSP.
Aby przeprowadzić elektroforezę w żelu niedenaturującym, należy najpierw zmieszać 15 mikrolitrów próbki z pięcioma mikrolitrami odpowiedniego buforu ładującego. Napełnij zbiornik katodowy lekkim buforem katody, a zbiornik anodowy buforem roboczym. Załaduj próbkę na żel Bis-Tris o stężeniu od czterech do 16% i rozpocznij bieg.
Zabarwić żel zgodnie z instrukcjami producenta żelu. Aby rozpocząć przygotowanie monotopowego kompleksu białkowego nanodysku z pięcioma lipooksygenazami jako białkiem, należy przygotować partię standardowego buforu MSP wzbogaconego 1,5 milimolowym chlorkiem wapnia. Ekspresja i oczyszczanie białka 5LO.
Natychmiast przygotować 100 mikrolitrową mieszaninę 0,8 mikromolowych 5LO i 0,8 mikromolowych nanokrążków w standardowym buforze MSP wzbogaconym w wapń. Nasz przykład proteinazy monotopowej z pięcioma lipooksygenazą zależy od ilości wapnia, które wiążą się z błoną. 5LO jest bardzo wrażliwy i musi być zużyty w ciągu kilku godzin od przygotowania.
Inkubuj mieszaninę na lodzie przez 10 minut. Otrzymaną próbkę kompleksu białek nanodyskowych należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca. Aby rozpocząć przygotowania do analizy TEM, rozpuść jeden gram soli fosfotowoldoganowej w 50 mililitrach ultraczystej wody o temperaturze pokojowej.
Doprowadzić pH roztworu do 7,4 za pomocą jednomolowego roztworu wodorotlenku sodu. Przefiltrować roztwór fosfongaianu sodu przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 mikrometra i przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej. Następnie wyładowanie jarzeniowe z siatki miedzianej pokrytej węglem o siatce 400 mesh przez 20 sekund przy 30 miliamperach, aby powierzchnia siatki była hydrofilowa.
Umieścić od 2,5 do pięciu mikrolitrów próbki monotopowego kompleksu białkowego nanodysku na siatce i pozostawić próbkę na 30 sekund. Następnie użyj bibuły filtracyjnej, aby zetrzeć nadmiar roztworu z siatki. Natychmiast nanieść kroplę roztworu fosfongianianu sodu i pozostawić roztwór na 30 sekund.
Zetrzyj nadmiar roztworu i pozostaw siatkę do wyschnięcia na powietrzu. Wykonaj transmisyjną mikroskopię elektronową z przyspieszonym napięciem od 120 do 200 kilowoltów. Wyklucz obrazy z długimi stosami z późniejszego przetwarzania obrazu.
W przypadku wybranych obrazów należy użyć standardowych metod przetwarzania w celu wyznaczenia średnich klas i wygenerowania modelu 3D białka monotopowego nanodysku o niskiej rozdzielczości. Za pomocą tej metody przygotowano puste nanodyski o stosunku 1 do 130 białek rusztowania błonowego do lipidów. Podczas chromatografii wykluczającej wielkość zaobserwowano tylko jeden duży pik i tylko jedno pasmo zaobserwowano w elektroforezie w niebieskim natywnym żelu.
Gdy puste nanodyski zostaną potraktowane roztworem soli fosfonkruszanowej sodu, indukowane jest układanie w stosy. Te długie stosy mogą być następnie obserwowane przez TEM. To układanie nie zostało zakłócone przez włączenie jonów wapnia do roztworu nanodysku przed zastosowaniem roztworu fosfoungianu sodu.
Kiedy białko monotopowe, takie jak pięć lipooksygenaz, jest związane z powierzchnią nanodysku, układanie w stosy jest utrudnione przez niedrożność stearynową przez białko. Obie strony nanodysku są dostępne do wiązania, co pozwala na tworzenie kompleksów nanodysków 5LO jeden do jednego i dwóch do jednego. Próbka dwóch do jednego kompleksów nanodysków 5LO wykazywała mniejsze układanie w stosy niż próbka jeden do jednego.
Wiązanie 5LO wymaga obecności jonów wapnia. Zostało to potwierdzone przez obserwację układania w mieszaninie 5LO i nanodysków bez wapnia, co wskazywało, że 5LO nie wiązało się z powierzchniami membrany. Po przygotowaniu białka monotopowego i nanodysków, ocena wiązania białka z błoną może zostać przeprowadzona w ciągu popołudnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podczas próby tej procedury ważne jest, aby oszacować obszar białka na nanodysku, aby wybrać odpowiednią długość MSP. W przypadku dobrze dopasowanych rozmiarów, maksymalnie dwa białka zewnętrzne mogą wiązać się po jednym z każdej strony dysku. Ważne jest również, aby sól sodowa fosofotungsenu była używana do ujemnego stanowiska, aby zapewnić maksymalne ułożenie w stos, ponieważ wiązanie potwierdza się przez porównanie braku stosów z długimi stosami próbki bez białka monotopowego.
Zastosowanie nanodysków zamiast liposomów umożliwia wykorzystanie dynamicznego rozpraszania światła, rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące jednorodności, wielkości próbki lub struktury molekularnej. Struktura 3D monotopowego białka błonowego o niskiej rozdzielczości połączonego z nanodyskiem może być łatwo dostępnym pierwszym krokiem na drodze do uzyskania struktury o wysokiej rozdzielczości tych związanych białek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę wizualizacji wiązania białek błonowych zewnętrznych z błonami nanodysków przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej z barwieniem negatywowym. Technika ta pozwala ukazać, w jaki sposób wiązanie białek może zapobiegać charakterystycznemu piętrzeniu się nanodysków, dostarczając wiedzy na temat oddziaływań białko-błona.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Biologia strukturalna
Wstęp
- Białka zewnętrzne odgrywają kluczową rolę w funkcjach błon komórkowych.
- Transmisyjna mikroskopia elektronowa z barwieniem negatywowym jest cenną techniką obrazowania.
- Nanodyski są wykorzystywane jako błony modelowe do badania oddziaływań białkowych.
- Zrozumienie wiązania białek jest niezbędne dla rozwoju leków oraz biologii strukturalnej.
Cel badania
- W celu wizualizacji wiązania białek zewnętrznych z membranami nanodysków.
- W celu zbadania wpływu oddziaływań białkowych na procesy screeningu leków.
- W celu uzyskania struktury o niskiej rozdzielczości kompleksu białko-nanodysk.
Zastosowane metody
- Transmisyjna mikroskopia elektronowa z barwieniem negatywowym.
- Przygotowanie membran w nanodyskach.
- Testy wiązania dla białek zewnętrznych.
- Analiza wzorców staplowania nanodysków.
Główne wyniki
- Wiązanie białek zewnętrznych zapobiega tworzeniu się stosów nanodysków.
- Charakterystyczne wzory tworzenia stosów są widoczne, gdy białka nie wiążą się.
- Metoda ta pozwala na poznanie optymalnych warunków wiązania białek.
- Wskazano na potencjalne zastosowania w opracowywaniu leków.
Wnioski
- Technika ta jest skuteczna w badaniu oddziaływań białko-błona.
- Stanowi ona drogę do wyznaczania struktur o wysokiej rozdzielczości.
- Uzyskane wyniki mają znaczenie dla zrozumienia funkcji białek błonowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia wizualizację wiązania białek błonowych zewnętrznych z nanodyskami za pomocą TEM z barwieniem negatywowym, w którym wiązanie białka zapobiega charakterystycznemu piętrowaniu się nanodysków. Zapewnia ona szybki odczyt strukturalny o niskiej rozdzielczości w celu ograniczenia ryzyka podczas walidacji celu oraz dostarcza informacji w początkowej fazie przesiewowej leków dla białek związanych z błoną. Podejście to wspiera decyzje typu go/no-go poprzez potwierdzenie wiązania w określonych warunkach lipidowych i jonowych przed przeznaczeniem zasobów na wysokorozdzielcze badania strukturalne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju BioPharma
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Potwierdza wiązanie białek egzogennych z błoną poprzez bezpośrednią wizualizację zahamowanego układania się nanodysków w stosy.
- Wartość operacyjna: Umożliwia szybką ocenę oddziaływań białko-lipid w kontrolowanym systemie mimetycznym błony.
- Wartość prognostyczna: Wspiera walidację celu poprzez wykazanie zależności wiązania od kofaktorów, takich jak jony wapnia.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia przesiewanie związków modulujących wiązanie białek z błoną poprzez pomiar zmian w wzorcach układania się nanodyszczów.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje dostępną infrastrukturę TEM z barwieniem negatywowym do uzyskiwania obrazów o wysokim kontraście bez konieczności stosowania krio-EM.
- Gotowość do analizy: Pozwala na otrzymywanie próbek kompatybilnych z dalszymi etapami analizy strukturalnej, w tym z analizą pojedynczych cząsteczek oraz żelami niedenaturującymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: dostarcza wglądu w strukturę o niskiej rozdzielczości, który może służyć jako wskazówka dla badań kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) o wyższej rozdzielczości w odniesieniu do kompleksów białko-nanodysk.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: wyjaśnia ograniczenia steryczne i przestrzenne wiązania białek po obu stronach nanodysku.
- System istotny w kontekście chorobowym: modeluje interakcje obwodowych białek błonowych istotne dla szlaków sygnalizacyjnych w stanach zapalnych i metabolizmie lipidów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania mechanistyczne, stanowiąc pomost pomiędzy biochemicznymi testami wiązania a wyznaczaniem struktury o wysokiej rozdzielczości.
- Biologia odkrywcza: Pozwala weryfikować hipotezy terapeutyczne poprzez wizualizację wiązania białka z powierzchnią błony w określonych warunkach.
- Screening: Pozwala na uzyskanie ilościowych wyników obrazowania (układanie się vs. brak układania), które można ocenić w celu analizy wpływu związków na wiązanie z błoną.
- Analityka: Umożliwia uśrednianie klas oraz modelowanie 3D kompleksów białko-nanodysk w celu wygenerowania strukturalnych danych o niskiej rozdzielczości do charakterystyki celu.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość prac przedklinicznych, zapewniając kontekst strukturalny dla funkcji białka w środowisku lipidowym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny wielu białek błon obwodowych przy różnych składach lipidowych i warunkach buforowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Bezpośrednia wizualizacja zdarzeń wiązania oraz wgląd w strukturę o niskiej rozdzielczości zmniejszają niejednoznaczność modeli mechanistycznych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystanie powszechnie dostępnego sprzętu TEM oraz standardowych protokołów barwienia negatywowego zapewnia szeroką dostępność metody.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność danych dotyczących oddziaływania z celem, redukując odsetek niepowodzeń w późniejszych etapach walidacji strukturalnej i funkcjonalnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia wczesną selekcję celów na podstawie potwierdzonego wiązania z błoną, co poprawia efektywność kapitałową w procesach odkrywania leków.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w ekspresji białek, rekonstrukcji nanodyszczy oraz przygotowywania próbek do TEM z zastosowaniem barwienia negatywowego.
- Zależne od dostępu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej oraz spektroskopii UV-Vis w celu ilościowego oznaczenia nanodyszczy.
- Wymaga optymalizacji stosunku lipidów do białek rusztowaniowych oraz warunków buforowych dla każdego układu białko-lipid.
- Obejmuje pracę z lipidami wrażliwymi na działanie powietrza oraz barwnikiem z fosfotungstanu w kontrolowanych warunkach.
- Ograniczone do białek, które same w sobie nie indukują tworzenia stosów; wiązanie wnioskuje się na podstawie braku stosów w stosunku do kontroli.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Preparation, Reconstitution, and Analysis of Empty Nanodiscs
5:11
Preparation and Analysis of the Nanodisc-Monotopic Protein Complex
7:56
Results: Monotopic Membrane Protein Binding on the Surfaces of Empty Nanodiscs (NDs)
9:26
Conclusion
