Name: Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji wiązania białek zewnętrznych z nanodyskami za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika ta umożliwia badanie interakcji białko-błona i ma zastosowanie w rozwoju leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Szwedzkiej Radzie ds. Badań Naukowych, Radzie Hrabstwa Sztokholm i funduszom KI za wsparcie. Ekspresję i oczyszczanie MSP przeprowadzono w Karolinska Institutet/SciLifeLab Protein Science Core Facility (http://PSF.ki.se). Autorzy pragną również podziękować dr Pasi Purhonen i dr Mathildzie Sjöberg za podzielenie się swoją wiedzą techniczną i za szybką pomoc.

1. Przygotowanie Nanodysków
<ol>
	<li>Ekspresja i oczyszczanie białka rusztowania błonowego8,35
	<ol>
		<li>Wyrazić MSP1E3D1 znakowaną His w szczepie E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 w kolbach. Przygotuj 50 ml nocnej kultury starterowej z pożywką LB uzupełnioną 50 μg/ml kanamycyny w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć nocną kulturę starterową w 2 litrach wspaniałej pożywki bulionowej uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny.</li>
		<li>Hodować komórki w temperaturze 37 °C, aż gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) osiągnie około 3. Indukować ekspresję białka za pomocą 0,5 mM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) przez 3 godziny w temperaturze 18 °C.</li>
		<li>Przygotować bufor do lizy (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl; i 10% glicerolu). Dodaj 1 mM TCEP bezpośrednio przed użyciem.</li>
		<li>Po 3 godzinach indukcji w temperaturze 18 °C, zebrać komórki przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 4 500 x g i w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, zważyć pobrane komórki i ponownie zawiesić je w buforze do lizy w proporcji 2 ml buforu do lizy na g komórek.</li>
		<li>Lizuj komórki za pomocą pulsacyjnej sonikacji (częstotliwość powtarzania: 4 s WŁ., 4 s WYŁ.) przez 3 minuty przy amplitudzie 80%.</li>
		<li>Odwirować lizaty przez 20 minut w temperaturze 49 000 x g i temperaturze 4 °C. Wyrzucić osad z tego wirowania.</li>
		<li>Wstrzyknąć supernatant do 5 ml kolumny chelatującej Ni+ połączonej z automatycznym systemem chromatografii cieczowej, najlepiej utrzymywanym w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przed etapem elucji (etap 1.1.9) przemyć kolumnę 1 - 3 poniżej, aby usunąć wszystkie białka z wyjątkiem MSP znakowanego His. Monitorować zawartość białka przy długości fali 280 nm, aby śledzić proces oczyszczania; zapis UV przy 280 nm powinien wracać do wartości wyjściowej po każdym praniu.
		<ol>
			<li>Przemyć buforem płuczącym 1: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu i 1% Tritonem, pH 8,0.</li>
			<li>Przemyć buforem do przemywania 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu i 50 mM cholanu sodu, pH 8,0.</li>
			<li>Przemyć buforem do przemywania 3: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl i 50 mM imidazolu, pH 8,0.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Eluować MSP za pomocą 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl i 500 mM imidazolu, pH 8,0.</li>
		<li>Zmień bufor na standardowy bufor MSP (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; i 0,5 mM EDTA) przez filtrację żelową8,35; wydajność na partię powinna wynosić około 7 mg L-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego fosfolipidów
	<ol>
		<li>Dodać 305 μl 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (POPC) rozpuszczonej w chloroformie o stężeniu 25 mg/ml do szklanej zlewki i odparować chloroform, przepłukując go delikatnym strumieniem azotu. Wysuszyć lipid przez noc w eksykatorze próżniowym. UWAGA: Ten krok jest wykonywany w celu usunięcia rozpuszczalnika z lipidu, który pozostawia cienką warstwę lipidu na dnie szklanej zlewki.</li>
		<li>Zawiesić placek lipidowy w 200 μl standardowego buforu MSP zawierającego 100 mM cholanu sodu, wirując probówkę, aż roztwór stanie się przezroczysty; zapewni to roztwór o stężeniu POPC 50 mM. 
		UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, stosunek molowy lipidów do detergentu w tym momencie powinien wynosić 1:2 (lipid:detergent)8. Ta mieszanka lipidów i detergentów może być przechowywana w temperaturze -80 °C przez prawie 2 miesiące.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kulek hydrofobowych do usuwania detergentu
	<ol>
		<li>Umieść 5 g kulek (w suchej masie) w probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Umyj kulki 30 ml 100% metanolu, a następnie 40 ml ultraczystej wody.</li>
		<li>Umyj kulki 10 ml standardowego buforu MSP. Na koniec przechowywać kulki w 15 ml buforu wzorcowego MSP w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rekonstytucja Nanodisc
	<ol>
		<li>Dozować 190 μl MSP1E3D1 (0,124 mM) do probówki do mikrofuge i dodać 61,5 μl podstawowego roztworu fosfolipidów (50 mM POPC) do tej samej probówki. Mieszaninę do rozpuszczenia należy inkubować na mokrym lodzie przez 1 godzinę. UWAGA: Odpowiada to stosunkowi molowemu 1:130 (MSP1E3D1: POPC).</li>
		<li>Dodać kulki hydrofobowe w stężeniu 0,5 g kulek na ml mieszaniny do rozpuszczenia, aby rozpocząć proces samoorganizacji. Inkubować w inkubatorze obrotowym przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po inkubacji odwirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 x g i temperaturze 4 °C w celu usunięcia osadów i agregatów. Wyrzucić osad i zachować supernatant.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę chromatografii wykluczającej wielkość (zamontowaną na zautomatyzowanym systemie chromatografii cieczowej) z buforem wzorcowym MSP, aż absorbancja przy 280 nm będzie stabilna. Wstrzyknąć supernatant do kolumny i zebrać frakcje szczytowe.</li>
		<li>Zmierzyć stężenia nanodysków we frakcjach pikowych przy 280 nm. Do obliczenia stężenia nanodysku należy użyć współczynnika ekstynkcji molowej wynoszącego MSP1E3D1 (ε = 29,910 cm-1 M-1). UWAGA: Liczba lipidów na nanodysk może być mierzona przez kombinację lipidów znakowanych radioaktywnie i analizy fosforanów4 lub przez samą analizę fosforanów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie 5-lipooksygenazy białkowej monotopowej35
<ol>
	<li>Przygotuj kulturę starterową na noc. Uzupełnij 50 ml pożywki LB 100 μg/ml ampicyliny. Zaszczepić pożywkę bakterią E. coli BL21 (DE3) zawierającą plazmid genu 5-lipooksygenazy (ALOX5). Rozcieńczyć całonocną kulturę starterową w pożywce ekspresyjnej zawierającej 42 mM Na2HPO4, 24 mM KH2PO4, 9 mM NaCl, 19 mM NH4Cl, 1 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, 0,2% D-glukozy, 0,1%, 5 μMFeSO4 i 100 μg/ml ampicyliny. Hoduj komórki, aż OD600 wyniesie ~ 0,5 w 25 °C. Indukuj ekspresję białka za pomocą 0,2 mM IPTG przez 16 godzin w 20 °C35.</li>
	<li>Zbierać przez odwirowywanie przez 10 minut w temperaturze 7 000 x g i temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zważyć osad znajdujący się na dnie probówki zawierającej pobrane komórki i ponownie zawiesić zebrane komórki w buforze do lizy (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM NaCl; 10% glicerolu; i 1 mM TCEP) zawierającym inhibitor proteazy i 0,5 mg/ml35 lizozymu w proporcji 2 ml buforu do lizy na g komórek.</li>
	<li>Lizować komórki przez sonikację przez 5 x 15 s przy 80% amplitudzie. Usunąć resztki komórek przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 7 000 x g i 4 °C. Przeprowadzić wytrącanie siarczanu amonu do 30 - 60% nasycenia, aby wytrącić białka w roztworze35. Wirować przez 15 minut w temperaturze 16 000 x g i 4 °C. UWAGA: Granulat 5LO można szybko zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	<li>Zawiesić osad z 20 ml buforu do lizy i odwirować na 15 minut w temperaturze 40 000 x g i 4 °C.</li>
	<li>Inkubować supernatant na kolumnie z agarozą ATP w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przemyć kolumnę raz jedną objętością kolumny buforu do lizy zawierającego 0,5 M NaCl. Eluować 5LO za pomocą 20 mM ATP w buforze do lizy zawierającym 10 μM FeSO4 i 20 μg/ml katalazy. Przeprowadzić chromatografię z filtracją żelową, aby usunąć ATP35. 
	UWAGA: 5LO jest niestabilny i powinien być używany natychmiast po oczyszczeniu. W przeciwnym razie zaleca się zatrzymanie na etapie wytrącania siarczanu amonu (patrz uwaga po etapie 2.1.3).</li>
</ol>
3. Przygotowanie kompleksu białkowego Nanodisc
<ol>
	<li>Przygotować całkowitą objętość 100 μl kompleksu. Zmieszać 0,8 μM ND i 0,8 μM 5LO z 1 mM Ca2+ obecnym w buforze wzorcowym MSP (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,5 mM EDTA; i 1,5 mM CaCl2) i inkubować przez 10 minut na lodzie. UWAGA: Próbka może być przechowywana przez okres do jednego miesiąca w temperaturze 4 °C35.</li>
</ol>
4. Analiza próbek
<ol>
	<li>Elektroforeza żelowa
	<ol>
		<li>Elektroforeza niedenaturująca
		<ol>
			<li>Wymieszaj 15 μl próbki z 5 μl buforu ładującego (50 mM BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glicerolu i 0,001% Pąsu S, pH 7,2)49 i załaduj go na 4 - 16% żelu Bis-Tris w celu przeprowadzenia elektroforezy.</li>
			<li>Napełnij zbiornik katodowy lekkim buforem katodowym (50 mM Bis Tris; 50 mM Tricine, pH 6,8; i 0,002% Coomassie G-250) oraz zbiornik anodowy z buforem roboczym (50 mM Bis Tris i 50 mM Tricine, pH 6,8). Rozpocznij separację, używając stałego napięcia przy napięciu 150 V.</li>
			<li>Zatrzymaj separację elektroforetyczną, gdy przód Coomassie dotrze do końca żelu.</li>
			<li>Zabarwić żel standardowym niebieskim protokołem Coomassie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Elektroforeza denaturacji
		<ol>
			<li>Zmieszać 40 μl próbki z 10 μl buforu ładującego zawierającego SDS (0,05% (m/v) błękitu bromofenolowego; 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8; 20% (v/v) glicerolu; 10% (w/v) SDS; i 10 mM 2-merkaptoetanolu) i załadować ją do 4 - 20% żelu glicynowego Tris w celu przeprowadzenia elektroforezy.</li>
			<li>Napełnij zbiorniki katody i anody buforem roboczym (25 mM Tris-HCl, pH 6,8; 200 mM glicyny; i 0,1% (w/v) SDS). Rozpocznij separację, używając stałego napięcia przy napięciu 150 V.</li>
			<li>Zatrzymaj separację elektroforetyczną, gdy przód barwnika załadowczego dotrze do końca żelu.</li>
			<li>Zabarwić żel standardowym niebieskim protokołem Coomassie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu NaPT
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1 g fosfounganowianu soli sodowej w 50 ml wody przez mieszanie w temperaturze pokojowej, aby uzyskać 2% (m/v) kwaśny roztwór.</li>
		<li>Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 1 M NaOH. Usuń cząstki za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki do analizy TEM
	<ol>
		<li>Siatki miedziane powlekane węglem jarzeniowym (400 mesh) przez 20 s przy 30 mA w celu nadania siatkom hydrofilowości przed adsorpcją próbki. Umieścić 3,5 μl próbki (0,8 μM w odniesieniu do nanodysków) na siatce i inkubować przez 30 s. UWAGA: Zastosowana objętość może wahać się od 2,5 do 5 μl, w zależności od stężenia próbki. Odpowiedni zakres stężeń dla nanodysków wynosi 0,5 - 1 μM.</li>
		<li>Zetrzyj nadmiar roztworu za pomocą bibuły filtracyjnej.</li>
		<li>Natychmiast zabarwić siatkę kroplą 2% NaPT przez 30 s. Zetrzyj nadmiar roztworu i pozostaw siatkę do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Oceń siatki za pomocą TEM. Mikroskop z napięciem przyspieszającym 120-200 keV wystarcza do oszacowania zakresu układania w stosy. UWAGA: W niniejszym protokole użyto skalibrowanego transmisyjnego mikroskopu elektronowego, wyposażonego w pistolet do emisji pola o natężeniu 200 keV.</li>
		<li>Zapisz obrazy TEM. W przypadku obrazów przedstawiających długie stosy nie należy ich dalej przetwarzać; Obrazy pokazują kompleks nanodysków z zewnętrznym białkiem, które może zawierać kilka krótkich stosów, ale większość cząstek znajduje się w kompleksie. Nagraj kilka obrazów i przetwórz je zgodnie ze standardowymi metodami, aby uzyskać średnie klas i trójwymiarowy model kompleksu o niskiej rozdzielczości. 
		UWAGA: W celu zebrania danych o barwieniu ujemnym siatki zostały wykonane w co najmniej trzech różnych dniach. Dla każdego dnia przeprowadzano inkubację nowych próbek (jak w kroku 3.1) przed nałożeniem barwienia ujemnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metodę można podzielić na trzy części: rekonstytucję pustych nanodysków, przygotowanie kompleksów białko-nanodysk oraz barwienie ujemne dla TEM tych kompleksów. Każda część zostanie omówiona osobno pod kątem ograniczeń techniki, krytycznych kroków i przydatnych modyfikacji.
Rekonstytucja pustych nanodysków. Krytyczne etapy i ograniczenia w produkcji i użytkowaniu nanodysków.
Do przygotowania pustych nanodysków niezbędna jest optymalizacja stosunku MSP do lipidów. Dla n...

W badaniach medycznych wiele uwagi skupia się na białkach błonowych, zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych, zaangażowanych w różne interakcje lipidowe. Praca z białkami oddziałującymi z lipidami obejmuje albo wybór substytutu lipidów, takiego jak detergenty, amfipole1, lub małe białka2, albo znalezienie substytutu błony, który utrzymuje białko rozpuszczalne i aktywne. Substytuty błon liponowych obejmują liposomy i nanodyski (ND)3,4.
Nanodyski to niemal natywne platformy błonowe, które powstały dzięki inżynierii części białkowej, ApoA-1, lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) naturalnie występującej we krwi. ApoA-1 jest długim na 243 reszty łańcuchem krótkich amfipatycznych α-helis i ma konformację rozpuszczalną bez lipidów. W in vitro, w obecności lipidów, dwie kopie białka ApoA-1 spontanicznie przegrupowują się, aby otoczyć hydrofobową część łańcucha acylowego dwuwarstwowej łaty lipidowej5. Zmodyfikowane wersje ApoA-1 są ogólnie nazywane białkami rusztowania błonowego (MSP), a coraz więcej z nich jest dostępnych na rynku w postaci plazmidów lub oczyszczonych białek. Powtórzenia lub delecje α-helis w ApoA-1 skutkują dłuższymi6 lub krótszymi7 białkami rusztowania błonowego. To z kolei umożliwia formowanie krążków o średnicy około 6 nm7 do 17 nm8. Istnieją różne typy zastosowań nanodysków3,9. Najczęściej stosowanym zastosowaniem jest zapewnienie niemal natywnego środowiska błonowego do stabilizacji integralnego białka błonowego8, sprawdzone wcześniej3,9. Mniej zbadanym zastosowaniem jest zapewnienie powierzchni błony w nanoskali do badania białek błony obwodowej10,11,12,13,14,15,16,17. Sekcja 1 poniższego protokołu wizualizuje procedurę wytwarzania nanodysków złożonych z fosfolipidów i białka rusztowania błonowego.
Przygotowanie próbki jest wąskim gardłem w większości metod. Próbki specyficzne dla danej metody mogą dodawać określone informacje, ale także utrudniają porównywanie wyników. Dlatego jest to prostsze, gdy próbki są multimodalne i mogą być wykorzystywane bezpośrednio w kilku różnych metodach. Jedną z zalet stosowania nanodysków jest niewielki rozmiar nanodysku w porównaniu z liposomami (np. próbki mogą być bezpośrednio wykorzystywane zarówno do elektroforezy TEM, jak i elektroforezy żelowej bez denaturacji, jak w niniejszym protokole).
Pęcherzyki i liposomy od dawna są używane do zrozumienia funkcji białek oddziałujących z błoną. Do badań strukturalnych i wizualizacji dostępny jest przykład strukturalnego oznaczania białka transbłonowego w liposomach18. Jednak, o ile nam wiadomo, nie opublikowano jeszcze struktury 3D monotopowego białka błonowego osadzonego na błonie liposomowej. Nanocząstki złota lub przeciwciała mogą być używane do wizualizacji białek wiążących się z liposomami lub pęcherzykami za pomocą TEM19. Mimo że sondy te są bardzo specyficzne, mogą zakłócać białka wiążące błonę, zasłaniając miejsce wiązania błony lub maskując obszary zainteresowania elastycznymi częściami. Białka znakowane złotem lub skompleksowane przeciwciałami mogłyby być prawdopodobnie analizowane na żelu, ale zwiększyłoby to koszt eksperymentu.
Chociaż liposomy są doskonałą platformą, nie można być pewnym, że populacja ma określony stosunek białka na liposom, cechę, którą można zbadać za pomocą nanodysków20. W liposomie kofaktory i substraty mogą zostać uwięzione w rozpuszczalnym wnętrzu. Substancje, które są rozpuszczalne w błonie, będą dzielić ten sam los dla obu rodzajów mimetyków błonowych. Niemniej jednak, ponieważ obszar dwuwarstwy jest mniejszy w nanodyskach, do nasycenia membran nanodysków potrzebna jest mniejsza ilość substancji.
Zrozumienie funkcji białka poprzez określenie struktury atomowej było niezbędne dla wielu dziedzin badań. Metody oznaczania struktury białek obejmują X-ray21; magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)22,23; i transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)24 w temperaturach kriogenicznych, cryoEM. Rozdzielczość cryoEM została ostatnio znacznie poprawiona, głównie dzięki zastosowaniu bezpośrednich detektorów elektronów25,26. Makrocząsteczki są obrazowane w cienkim, szklistym lodzie27 w stanie zbliżonym do natywnego. Jednak ze względu na niski kontrast cząsteczek biologicznych stają się one trudne do wykrycia w zakresie wielkości 100 - 200 kDa. W przypadku próbek o odpowiedniej wielkości można zebrać dane i zastosować metodę rekonstrukcji pojedynczej cząstki w celu uzyskania struktury28.
Jednakże, określanie struktury białka za pomocą TEM jest procesem wieloetapowym. Zwykle rozpoczyna się od oceny monodyspersyjności próbki za pomocą barwienia ujemnego TEM29 przy użyciu soli metali ciężkich, takich jak fosfotungsten (PT)30 lub uranium31. Zazwyczaj wykonuje się rekonstrukcję modelu makrocząsteczki o niskiej rozdzielczości, który może dostarczyć ważnych informacji na temat struktury molekularnej29. Równolegle może rozpocząć się zbieranie danych za pomocą cryoEM. Należy zachować ostrożność podczas oceny danych TEM o ujemnym zabarwieniu, aby uniknąć błędnej interpretacji powstawania artefaktów. Jednym ze szczególnych artefaktów jest wpływ barwienia PT na fosfolipidy i liposomy32, co skutkuje powstawaniem długich prętów przypominających stosy monet oglądane z boku33. Takie "rouleau" lub "stosy" (dalej oznaczane jako "stosy") były obserwowane wcześnie dla HDL34, a później także dla nanodiscs35.
Układanie i przekształcanie membran może nastąpić z wielu powodów. Na przykład może być indukowany przez kofaktory, takie jak miedź, co wykazano za pomocą obrazowania TEM w barwieniu molibdenianem amonu36. Frakcja lipidów błonowych w liposomach zawierała grupę głowicową kwasu iminodiacetowego naśladującą kompleksowanie metali przez EDTA, układając w ten sposób liposomy po dodaniu jonów miedzi36. Układanie w stosy może być również spowodowane interakcją białko-białko przez białko w lub na dwuwarstwach lipidowych (użyta plama nie jest wymieniona)37. Tworzenie się stosu fosfolipidów przez PT zaobserwowano wcześnie; Jednak późniejsze prace skupiły się na usunięciu lub zniesieniu tej formacji artefaktu38.
Tutaj proponujemy metodę wykorzystania indukowanego przez NaPT układania nanodysków do badania białek wiążących błony za pomocą TEM. Krótko mówiąc, wiązanie białek na nanodyskach zapobiegłoby układaniu się nanodysków. Chociaż powody układania w stosy nie są jasne, zaproponowano39, że istnieje oddziaływanie elektrostatyczne między fosfolipidami a grupą fosforylową PT, powodujące sklejanie się krążków ze sobą (Rysunek 1A). Hipoteza stojąca za naszym protokołem jest taka, że gdy białko wiąże się z nanodyskiem, większość powierzchni fosfolipidów nie jest dostępna do interakcji z PT z powodu sterycznej przeszkody ze strony białka. Zapobiegłoby to tworzeniu się komina (rysunek 1B). Można wyciągnąć dwa wnioski. Po pierwsze, zapobieganie układaniu się w stosy oznacza, że białko będące przedmiotem zainteresowania związało się z błoną. Po drugie, kompleks białkowy-ND można traktować standardowymi metodami przetwarzania pojedynczych cząstek24,40, aby uzyskać przybliżoną morfologię kompleksu. Ponadto można przeprowadzać analizy za pomocą takich metod, jak elektroforeza żelowa bez denaturacji lub dynamiczne rozpraszanie światła.
Aby zademonstrować tę hipotezę, użyliśmy białka 5-lipooksygenazy (5LO) wiążącego błonę, które jest zaangażowane w wiele chorób zapalnych41,42. To białko o masie 78 kDa wymaga jonów wapnia, aby związać się ze swoją błoną43. Chociaż to asocjacja błony była szeroko badana przy użyciu liposomów44,45,46 i frakcje membranowe47, nie można ich używać do analizy TEM i określania struktury.
Przygotowanie nanodysków rozpoczyna się od zmieszania MSP z lipidem zawieszonym w protektorze cholan sodu. Po inkubacji na lodzie przez 1 godzinę, detergent jest powoli usuwany z mieszaniny do rozpuszczenia za pomocą żywicy adsorpcyjnej. Ten rodzaj materiału jest często wykonany z polistyrenu w kształcie małych koralików. Są one stosunkowo hydrofobowe i mają silną preferencję do wiązania detergentów w porównaniu do lipids48. Po usunięciu kulek hydrofobowych i przeprowadzeniu klarowania za pomocą wirowania, nanodyski są oczyszczane za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość (SEC). Oczyszczone nanodyski miesza się z monotopowym białkiem błonowym (i ewentualnymi kofaktorami) w stosunku równomolowym (lub kilku proporcjach do miareczkowania) i pozostawia się do reakcji (15 min). Analizę za pomocą TEM przeprowadza się poprzez naniesienie μl próbki na rozżarzone, pokryte węglem siatki, a następnie poprzez barwienie ujemne za pomocą NaPT. Ta sama próbka, od której podwielokrotności zostały nałożone na siatki TEM, może być wykorzystana do analizy za pomocą elektroforezy żelowej bez denaturacji lub SDS PAGE, a także do różnego rodzaju pomiarów aktywności, bez większych zmian.

<table><tbody><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy: JEOL2100F</td> Kamera CCD <td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wyładowanie jarzeniowe</td><td>Baltec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siatka TEM: 400 mesh</td><td>TAAB</td><td>GM016/C</td><td></td></tr><tr><td>Chromatografia wykluczająca rozmiar: Agilent SEC-5</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2526</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare Nauki Przyrodnicze</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid: MSP1E3D1</td><td>Addgene</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Bakterie: BL21DE3</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Bakterie: BL21 (DE3) T1R pRARE2</td><td>Protein Science Facility, KI, Solna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matryca oczyszczania: ATP agaroza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2767</td><td></td></tr><tr><td>Matryca oczyszczająca: HisTrap HP-5 mL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipidy: POPC</td><td>Avanti polarne lipidy</td><td>850457C</td><td>25 mg/ml w chloroformie</td></tr><tr><td>Kulki hydrofobowe: Bio-Beads, SM-2 Resin</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>13 mm filtr strzykawkowy: 0,2 &mu; m</td><td>Pall life sciences</td><td>PN 4554T</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie: Trójzasadowy hydrat fosforunglandianu sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31648</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Detergent: Hydrat cholanu sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cholan</td><td></td><td></td> sodu <td>500 mM Cholan sodu. Zawiesić w wodzie miliQ i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Lipid Stock</td><td></td><td></td><td>50 mM POPC, 100 mM cholan sodu, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl. <bt />Przechowywać w temperaturze 4 & C przez tydzień; lub Sklep -80 &deg; C przez miesiąc, po przeczyszczeniu roztworu azotem.</td></tr><tr><td>Standardowy bufor</td><td></td><td></td> MSP <td>20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA. Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.</td></tr><tr><td>Bufor anodowy do elektroforezy niedenaturującej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2001</td><td>50 mM Bis-tris, 50 mM Tricine, pH 6,8</td></tr><tr><td>Bufor katodowy do elektroforezy niedenaturującej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2002</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6,8, 0,002% Coomassie G-250</td></tr><tr><td>Elektroforeza niedenaturująca 4x Bufor do ładowania próbki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2003</td><td>50 mM Bis-Tris, pH 7,2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glicerol, 0,001% Ponceau S</td></tr><tr><td>Denaturaing Electrophoresis Running Buffer Receptura</td><td></td><td></td><td>własna: 25 mM Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM glicyna, 0,1% (w/v) SDS</td></tr><tr><td>Denaturaing Elektroforeza 5x Ładowanie próbki Bufor Receptura</td><td></td><td></td><td>własna: 0,05% (w/v) Bromophenolblue, 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% (v/v) glicerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-merkaptoetanol</td></tr><tr><td>Wspaniały bulion</td><td></td><td></td><td>Trypton - 12,0 g, Ekstrakt drożdżowy - 24,0 g, 100 ml 0,17 M KH2PO4 i 0,72 M K2HPO4, Glicerol - 4 mL. Trypton, ekstrakt drożdżowy i glicerol przygotowano do 900 ml i oddzielnie sterylizowano w autoklawie. KH2PO4 i K2HPO4 przygotowano i autoklawowano oddzielnie. Oba zostały zmieszane przed użyciem pożywki.</td></tr></tbody></table>

metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Białka monotopowe pełnią swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony, a takie interakcje zależą od specyficznego składu lipidów i dostępności wystarczającej powierzchni do pełnienia funkcji. Nanodyski służą do zapewnienia powierzchni membrany o kontrolowanej wielkości i zawartości lipidów. W przypadku braku związanych białek zewnętrznych, nanodyski barwione fosfowolfanem sodu wyglądają jak stosy monet, gdy patrzy się na nie z boku za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Protokół ten został zatem zaprojektowany tak, aby celowo promować układanie w stosy; W związku z tym zapobieganie układaniu się w stosy może być interpretowane jako wiązanie białka wiążącego błonę z nanodyskiem. W kolejnym kroku obrazy TEM kompleksów białko-nanodysk mogą być przetwarzane za pomocą standardowych metod jednocząsteczkowych w celu uzyskania struktur o niskiej rozdzielczości jako podstawy do prac krioEM o wyższej rozdzielczości. Ponadto nanodyski dostarczają próbki nadające się do elektroforezy TEM lub żelu niedenaturującego. Aby zilustrować metodę, przedstawiono indukowane przez Ca2+ wiązanie 5-lipooksygenazy na nanodyskach.

Proponowana przez nas metoda opiera się na przygotowaniu nanodysków, które zapewniają powierzchnię błony do wiązania monotopowych białek błonowych. Ponieważ w lipidowej dwuwarstwie nanodysku nie osadzono żadnego białka transbłonowego, nanodyski te określono tutaj mianem „nanodysków pustych” (Rycyna 2A). Mają one obliczoną masę cząsteczkową wynoszącą 256 kDa dla składu obejmującego dwa białka rusztowujące MSP1E3D1 oraz około 260 cząsteczek POPC8. St...

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja wiązania zewnątrzpochodnego białka błonowego na powierzchni membrany nanodysku za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej z barwieniem negatywowym, jako pierwszy krok w kierunku wyznaczenia struktury białka o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w wielu dziedzinach badawczych, ponieważ dotyczy aktywności białek zachodzących w błonach komórkowych i na ich powierzchni. Główną zaletą tej techniki jest charakterystyczne tworzenie się stosów nanodysków w przypadku, gdy białko nie może związać się z membranami.Stosy te są wyraźnie widoczne w transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na rozwój leków, ponieważ związki mogą być łatwo przesiewane pod kątem zdolności do blokowania lub umożliwiania oddziaływań białek błonowych. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji o optymalnych warunkach wiązania białek monotopicznych z błoną, pozwala ona również na uzyskanie struktury kompleksu białko-nanodysk o niskiej rozdzielczości.Aby rozpocząć procedurę, należy wyekspresować i oczyścić białko rusztowania błony, takie jak MSP1E3D1. Następnie, używając szklanej strzykawki z metalową igłą, należy odmierzyć 305 µL POPC o stężeniu 25 mg/mL w chloroformie do szklanej kolby okrągłodنnej. Chloroform należy odparować pod łagodnym strumieniem gazowego azotu w dygestorium.Pozostałe lipidy suszyć przez noc w deskrykatorze próżniowym. Następnie wysuszone lipidy rozpuścić w 200 µL standardowego buforu MSP wzbogaconego o 100 mM cholanu sodu jako detergentu. Mieszaninę wortexować do uzyskania przejrzystości, aby otrzymać zawiesinę 50 mM POPC w buforze.Następnie pięć gramów kulek hydrofobowych należy przemyć 30 mililitrami 100% methanol, potem 40 mililitrami wody ultraczystej i na koniec 10 mililitrami standardowego buforu MSP. Kuleczki należy przechowywać w 15 mililitrach standardowego buforu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie należy połączyć 190 mikrolitrów 0,124 milimolowego roztworu MSP1E3D1 oraz 61,5 mikrolitra 50 milimolowej zawiesiny POPC w buforze, co zapewni stosunek molowy MSP do POPC wynoszący 1:130 oraz stężenie cholanu sodu równe 25 milimolarom.Idealny stosunek lipidów do MSP różni się w zależności od wybranego typu lipidów oraz wariantu MSP i musi zostać zoptymalizowany w celu uzyskania homogennego preparatu nanodysków. Inkubować mieszaninę na wilgotnym lodzie przez jedną godzinę. Następnie dodać roztwór do probówki zawierającej 0,5 g wypłukanych kulek hydrofobowych na mililitr mieszaniny do rekonstytucji, aby zainicjować samozłożenie nanodysków.Mieszaninę inkubować w temperaturze 4 °C przez 16 godzin przy prędkości 7-8 obrotów na minutę. Po inkubacji pozwolić kuleczkom opaść pod wpływem grawitacji. Nadpływ usunąć i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przeprowadzenia chromatografii wykluczania cząsteczkowego.Przed przeprowadzeniem chromatografii wykluczania cząsteczkowego odwiruj mieszaninę przy 13 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zlej nadsącz i odrzuć osad. Równoważ kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczkowego przy użyciu standardowego buforu MSP, aż linia podstawowa przy 280 nanometrach stanie się stabilna.Wstrzyknij supernatant na kolumnę i zbierz produkt w frakcjach o objętości 0,5 ml. Zmierz absorbancję frakcji przy 280 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Oblicz stężenie nanodysków, korzystając z molowego współczynnika ekstynkcji dla wybranego MSP.Aby przeprowadzić nieodtwarzającą elektroforezę żelową, najpierw zmieszaj 15 µL próbki z pięcioma µL odpowiedniego buforu do nakładania. Napełnij zbiornik katody lekkim buforem katodowym, a zbiornik anody buforem do elektroforezy. Nałóż próbkę na żel Bis-Tris o stężeniu od 4 do 16% i rozpocznij rozdział.Przebarw żel zgodnie z instrukcjami producenta. Aby rozpocząć przygotowanie monotopowego kompleksu białkowego w nanodysku z zastosowaniem lipooksygenazy 5 jako białka, przygotuj partię standardowego buforu MSP wzbogaconego o 1,5 mM chlorku wapnia. Wyekspresuj i oczyść białko 5LO.Przygotuj niezwłocznie 100 µL mieszaniny 0,8 µM 5LO oraz 0,8 µM nanodyszczów w standardowym buforze MSP wzbogaconym o wapń. Nasz przykład monotopicznej proteinazy lipooksygenazy 5 zależy od ilości wapnia w celu związania się z błoną. 5LO jest bardzo wrażliwa i musi zostać wykorzystana w ciągu kilku godzin od przygotowania.Inkubować mieszaninę na lodzie przez 10 minut. Próbkę otrzymanego kompleksu białkowego w nanodyskach przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do jednego miesiąca. Aby rozpocząć przygotowania do analizy TEM, rozpuścić jeden gram soli fosfowolframianu sodu w 50 mililitrach wody ultrapurej w temperaturze pokojowej.Dostosuj pH roztworu do wartości 7,4 za pomocą jednomolarnego roztworu wodorotlenku sodu. Przefiltruj roztwór fosfowolframianu sodu przez filtr strzykawkowy o porach 0,22 µm i przechowuj roztwór w temperaturze pokojowej. Następnie poddaj siatkę miedzianą pokrytą węglem o oczkowaniu 400 mesh działaniu wyładowań żarowych przez 20 sekund przy natężeniu 30 mA, aby uczynić powierzchnię siatki hydrofilową.Nanieś od 2,5 do 5 µL próbki kompleksu białkowego monotopowego w nanodyskach na siatkę i pozostaw próbkę na 30 sekund. Następnie użyj papieru filtracyjnego, aby odsączyć nadmiar roztworu z siatki. Natychmiast nanieś kroplę roztworu wolframianu sodu i pozostaw roztwór na 30 sekund.Odsącz nadmiar roztworu i pozostaw siatkę do wyschnięcia na powietrzu. Przeprowadź transmisyjną mikroskopię elektronową przy napięciu przyspieszającym od 120 do 200 kV. Wyklucz obrazy przedstawiające długie stosy z dalszego przetwarzania obrazów.W przypadku wybranych obrazów zastosowano standardowe metody przetwarzania w celu wyznaczenia średnich klas oraz wygenerowania niskorozdzielczego modelu 3D białka monotopowego w nanodysku. Przy użyciu tej metody przygotowano puste nanodyski w stosunku białek rusztowujących błonę do lipidów wynoszącym 1:130. Podczas chromatografii wykluczania rozmiarów zaobserwowano tylko jeden główny pik, a w elektroforezie w żelu native-PAGE z barwieniem niebieskim zaobserwowano tylko jeden prążek.Po potraktowaniu pustych nanodysków roztworem soli fosfotungstanu sodu dochodzi do ich staplania. Powstałe długie stosy można następnie obserwować za pomocą TEM. Staplanie to nie zostało zaburzone przez dodanie jonów wapnia do roztworu nanodysków przed zastosowaniem roztworu fosfotungstanu sodu.Gdy białko monotopowe, takie jak 5-lipooksygenaza, wiąże się z powierzchnią nanodysku, jego agregacja warstwowa jest utrudniona przez zawadę steryczną białka. Obie strony nanodysku są dostępne dla wiązania, co umożliwia tworzenie kompleksów 5LO-nanodysk w stosunku jeden do jednego oraz dwa do jednego. Próbka kompleksów 5LO-nanodysk w stosunku dwa do jednego wykazała mniejszą tendencję do agregacji warstwowej niż próbka w stosunku jeden do jednego.Wiązanie 5LO wymaga obecności jonów wapnia. Potwierdzono to poprzez zaobserwowanie stosowania się (stacking) w mieszaninie 5LO i nanodysków bez wapnia, co wskazało, że 5LO nie związało się z powierzchniami błon. Po przygotowaniu białka monotopowego i nanodysków, ocena wiązania białka z błoną może zostać przeprowadzona w jedno popołudnie, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest oszacowanie powierzchni białka na nanodysku w celu wyboru odpowiedniej długości MSP. W przypadku dobrze dopasowanych rozmiarów, maksymalnie dwa białka zewnątrzstykowe mogą wiązać się po jednej stronie dysku. Ważne jest również, aby do barwienia negatywowego użyć soli sodowej fosfo-wolframianu w celu zapewnienia maksymalnego tworzenia stosów, ponieważ wiązanie potwierdza się poprzez porównanie braku stosów z długimi stosami w próbce pozbawionej białka monotopowego.Zastosowanie nanodysków zamiast liposomów umożliwia wykorzystanie dynamicznego rozpraszania światła oraz małokątnego rozpraszania rentgenowskiego w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące jednorodności, wielkości lub struktury molekularnej próbki. Niska rozdzielczość struktury 3D monotopowego białka błonowego związanego z nanodyskiem może stanowić łatwo dostępny pierwszy krok na drodze do uzyskania wysokiej rozdzielczości struktury takich związanych białek.

method-to-visualize-analyze-membrane-interacting-proteins

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół do określenia orientacji i topologii integralnych białek błonowych w żywych komórkach. Ten prosty protokół opiera się na selektywnej wrażliwości chimer na proteazę między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP.

Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Opracowaliśmy nowatorską technikę w mikroskopii elektronowej, "flash-and-freeze", która umożliwia wizualizację dynamiki membrany z rozdzielczością czasową ms. Technika ta łączy optogenetyczną stymulację neuronów z zamrażaniem pod wysokim ciśnieniem. W tym miejscu demonstrujemy procedury i szczegółowo opisujemy protokoły.

Flash-and-Freeze: nowatorska technika uchwycenia dynamiki membrany za pomocą mikroskopii elektronowej

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.

System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe

Ten protokół opisuje oparte na iSCAT przetwarzanie obrazów i śledzenie pojedynczych cząstek, które umożliwia jednoczesne badanie masy cząsteczkowej i dyfuzyjnego zachowania makrocząsteczek oddziałujących z błonami lipidowymi. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, konwersji masy na kontrast, akwizycji filmu i obróbki końcowej są dostępne wraz ze wskazówkami, aby zapobiec potencjalnym pułapkom.

Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Poznaj metodę wizualizacji wiązania białek zewnętrznych z nanodyskami za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Technika ta umożliwia badanie interakcji białko-błona i ma zastosowanie w rozwoju leków.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów