Name: Pomiar dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Poznaj metodę pomiaru dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek. Ta prosta technika bez fluorescencji pozwala analizować motorykę komórkową i dynamikę cytoszkieletu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH MH115939, NS112121, NS105640 i R56MH122449-01A1 (dla Anthony'ego J. Koleske) oraz od Izraelskiej Fundacji Naukowej (granty numer 1462/17 i 2142/21) (dla Hava Gil-Henn).

Wszystkie metody opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Bar-Ilan.
UWAGA: Graficzne przedstawienie krok po kroku procedury opisanej w tej sekcji pojawia się w Rysunek 1.
1. Hodowla komórkowa
UWAGA: Komórki użyte w protokole to mysie fibroblasty embrionalne (MEF), które zostały wygenerowane z zarodków E11.5-13.5 myszy C57BL/6 typu dzikiego. Podstawowe MEF-y zostały wygenerowane zgodnie z protokołem laboratoryjnym Jacks13. Komórki z pięciu różnych zarodków połączono ze sobą i unieśmiertelniono przez zakażenie wektorem retrowirusowym eksprymującym duży antygen T SV40, a następnie selekcję za pomocą 4 mM histydynolu przez 3 tygodnie.
<ol>
	<li>Hodowla komórek na płytkach do hodowli tkankowej zawierających zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierające 1 g/l glukozy, 1% glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (patrz tabela materiałów), w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Hoduj komórki do 90%-95% zbiegu i dziel w stosunku 1:5 co 2-3 dni.</li>
</ol>
2. Powłoka naczynia ze szklanym dnem
UWAGA: Powlekanie naczynia szklanym dnem powinno być wykonywane w kapturze do hodowli tkanek w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Dodać 2 ml roztworu 1N HCl na środek naczynia ze szklanym dnem (tabela materiałów) i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Ten etap ma na celu usunięcie pozostałości ze szkła, które mogą później przerwać obrazowanie.</li>
	<li>Umyj naczynie ze szklanym dnem trzy razy po 2 ml 1x PBS (Tabela Materiałów).</li>
	<li>Rozcieńczyć fibronektynę (patrz tabela materiałów) do 10 μg/ml w 1x PBS. Dodaj 200 μl rozcieńczonego roztworu fibronektyny do szklanego środka naczynia. Inkubować w temperaturze 37 °C (inkubator do hodowli tkankowych) przez 1 h. 
	UWAGA: Alternatywnie, naczynie ze szklanym dnem można inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na płaskiej powierzchni.</li>
	<li>Podczas inkubacji powlekania fibronektyną przygotować 1% roztwór BSA (Tabela Materiałów) w 1x PBS, przefiltrować przez 0,2 μm i denaturować przez inkubację w temperaturze 70 °C przez 30 minut we wstępnie podgrzanej łaźni wodnej.</li>
	<li>Umyj naczynie ze szklanym dnem trzy razy po 2 ml 1x PBS każde.</li>
	<li>Dodać 2 ml denaturowanego roztworu BSA do szklanego środka i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (inkubator do hodowli tkankowych). 
	UWAGA: Alternatywnie, naczynie ze szklanym dnem można inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na płaskiej powierzchni.</li>
	<li>Umyj naczynie ze szklanym dnem 3 razy po 2 ml 1x PBS każdy. 
	UWAGA: Inkubację naczyń ze szklanym dnem z fibronektyną należy przeprowadzać przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby odpowiednio pokryć powierzchnię. Krótszy czas inkubacji może nie powodować prawidłowego powlekania, w wyniku czego fenotyp komórki może nie być związany z aktywacją integryny. Warstwa BSA jest obojętna i nie wpływa na dynamikę wypukłości i ma na celu blokowanie wolnych potencjalnych miejsc dla adhezji komórek niezależnych od integryn. BSA musi zostać zdenaturowany przed powlekaniem, aby zapobiec indukowaniu apoptozy komórek, która może wpływać na dynamikę krawędzi komórki.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek do obrazowania
<ol>
	<li>Szesnaście do osiemnastu godzin przed eksperymentem nałóż komórki na płytkę, aby następnego dnia osiągnęły 70%-80% konfluencji. W przypadku MEF należy podawać płytkę 0,7 x 106 komórek na 10 cm średnicy płytki do hodowli tkankowej na dzień przed wykonaniem eksperymentu. 
	UWAGA: Aby eksperyment z wypukłością był udany, ważne jest, aby komórki były używane podczas ich logarytmicznej fazy wzrostu. Aby to osiągnąć, komórki powinny osiągnąć 70%-80% konfluencji w dniu eksperymentu. Większe zagęszczenie komórek spowoduje dłuższy czas rozprzestrzeniania się i/lub utrudnienie przyczepiania się podczas eksperymentu.</li>
	<li>W dniu doświadczenia dodać 2 ml roztworu trypsyny (tabela materiałów) na płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm i inkubować przez 2-3 minuty w inkubatorze do hodowli tkankowych, aż komórki się odłączą. Dezaktywuj trypsynę, dodając 5 ml kompletnej pożywki.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i umieść 20 000 komórek w 2 ml kompletnej pożywki na naczyniu ze szklanym dnem pokrytym jak powyżej (sekcja 2). 
	UWAGA: Liczba komórek do powlekania zależy od wielkości i rodzaju komórek. W przypadku większych lub bardziej rozproszonych komórek należy umieścić tylko 10 000 komórek, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do obrazowania. Ważne jest, aby wybierać pojedyncze komórki, które się nie stykają, ponieważ kontakt między komórkami może zmienić wewnętrzne zachowania rozprzestrzeniania się komórek.</li>
	<li>Inkubować szalki ze szklanym dnem z posianymi komórkami w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 15 min. 
	UWAGA: Na tym etapie komórki przylegają do substratu fibronektyny i rozprzestrzeniają się po nim. Podczas pomiaru wypukłości podczas rozsiewania komórek, komórki powinny mieć możliwość rozprzestrzeniania się przez 15 minut po posiewie i przed obrazowaniem. Obrazowanie można wykonać w oknie czasowym od 15 minut do ~1 godziny po posiewaniu, a w każdym razie przed rozpoczęciem migracji komórek.</li>
</ol>
4. Ustawienie mikroskopu i obrazowanie
UWAGA: Dostępne są różne systemy mikroskopii żywych komórek. Zastosowany tutaj system to mikroskop odwrócony Leica AF6000 wyposażony w CO2 i jednostki grzewcze i jest podłączony do cyfrowej kamery CMOS ORCA-Flash 4.0 V2.
<ol>
	<li>Włączyć urządzenie grzewcze co najmniej 1 godzinę przed obrazowaniem i ustawić je na 37 °C.</li>
	<li>Włącz jednostkę CO2 co najmniej 10 minut przed obrazowaniem i ustaw ją na 5% CO2 .</li>
	<li>Włącz mikroskop, kamerę i komputer.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do akwizycji mikroskopu (patrz Spis materiałów). Wybierz folder, w którym chcesz zapisać przechwycone obrazy, i wpisz nazwę pliku. Zapisz każdy film jako nowy plik.</li>
	<li>Ustaw powiększenie na 40-krotnym suchym obiektywie, kontrast fazowy. Ustaw interwał czasowy na 5 s, całkowity czas trwania filmu 10 min.</li>
	<li>Po 15 minutach inkubacji posianych komórek umieścić naczynie ze szklanym dnem z przylegającymi komórkami do adaptera i zamocować. Włóż adapter z naczynią do szczeliny w stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Zdejmij pokrywę naczynia i zamiast niej umieść pokrywkę CO2. Otwórz zawór CO2. 
	UWAGA: Upewnij się, że pokrywa CO2 jest czysta przed umieszczeniem jej na naczyniu ze szklanym dnem. Brudna okładka obniży jakość filmów. Wytrzyj spód pokrywy CO2 niestrzępiącą się chusteczką nasączoną 70% etanolem, aby usunąć kurz i brud. Przetrzyj po raz drugi suchą, niestrzępiącą się chusteczką.</li>
	<li>Wyświetl komórki i znajdź odpowiednią komórkę do obrazowania. Upewnij się, że komórka jest aktywna i rozpocznij pobieranie filmów.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
UWAGA: Analiza obrazu jest wykonywana za pomocą ImageJ (Tabela Materiałów) w następujący sposób:
<ol>
	<li>Otwórz uzyskany film w programie ImageJ.</li>
	<li>Korzystając z narzędzia Prosty na głównym pasku narzędzi, wykonaj osiem linii po 20 dowolnych jednostek, z których każda jest prostopadła do występów, w tym blaszki i krawędzi komórki, w układzie promieniowym co 45°, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2A.</li>
	<li>Na głównym pasku narzędzi przejdź do opcji Image > Stacks > Reslice. W ten sposób otrzymamy obraz kimograficzny, który opisuje ruch pojedynczych punktów w błonie komórkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Ta czynność powinna być wykonywana osobno dla każdego wiersza z ośmiu wierszy.</li>
	<li>Wyodrębnij i ręcznie policz z odpowiednich obrazów kimografu liczbę wypukłości, cofnięć i zmarszczek w każdym z ośmiu obszarów komórki, oznaczonych liniami siatki. Liczby te reprezentują częstotliwość występowania wypukłości, cofnięć i marszczeń na 10 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C, D). 
	UWAGA: Falbany można odróżnić od innych struktur na podstawie ich ciemnego wyglądu w mikroskopii z kontrastem fazowym i ich ruchu dośrodkowego, który zaczyna się na krawędzi komórki, a kończy na granicy ciała komórki, co można zaobserwować na pozyskanych filmach. Warto zauważyć, że przy ilościowym określaniu wypukłości, retrakcji i częstotliwości falban, filmy powinny być obserwowane jako kontrola kwantyfikacji, a zwłaszcza definiowania falban.</li>
	<li>Określ trwałość, odległość i prędkość wypukłości za pomocą analizy kymograficznej. Dla każdego z wygenerowanych kymogramów oś X reprezentuje odległość, a oś Y reprezentuje czas.</li>
	<li>Aby zmierzyć odległość występu, wykonaj kroki 5.6.1-5.6.2.
	<ol>
		<li>Narysuj prostopadłą linię od podstawy występu do najwyższego wierzchołka występu. Naciśnij M w ImageJ, aby zmierzyć długość linii w pikselach.</li>
		<li>Aby przekonwertować długość z pikseli na μm, upewnij się, że stosunek pikseli do μm jest znany. 
		UWAGA: Stosunek μm do pikseli to fizyczna długość piksela w kamerze CCD / całkowite powiększenie. Rozmiar piksela jest charakterystyczny dla każdego typu aparatu. Na przykład w przypadku aparatu użytego w tym badaniu rozmiar piksela wynosi 6,5 μm x 6,5 μm, długość fizyczna to 6,5 μm, a powiększenie, którego użyliśmy, to 40x. Dlatego stosunek μm do pikseli naszego aparatu wynosi 0,1625 μm/piksel. W analizie, dla linii o długości 30 pikseli, odległość występu wynosiłaby 30 pikseli x 0,1625 μm/piksel = 4,875 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zmierzyć czas wysunięcia (trwałość; czas, przez jaki występ wystaje przed wycofaniem), wykonaj kroki 5.7.1-5.7.2.
	<ol>
		<li>Narysuj poziomą linię od początku występu (od lewej do prawej) do obszaru najwyższego szczytu. Naciśnij M w ImageJ, aby zmierzyć długość linii w pikselach.</li>
		<li>Aby przekonwertować długość z pikseli na minuty, oblicz stosunek pikseli do minut. Ta wartość zależy od interwału między images. 
		UWAGA: W tym przykładzie interwał między obrazami wynosi 5 s, stosunek min/piksel wynosi 0,0833, a długość linii poziomej wynosi 8 pikseli. W związku z tym czas wypukłości wynosi 8 pikseli x 0,0833 min/piksel = 0,6664 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz i oblicz czas wycofania podobnie jak czas wysunięcia dla linii narysowanej poziomo u podstawy występu, od miejsca, w którym znajduje się szczyt występu, do jego podstawy po prawej stronie (linia X2 w <silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Oblicz prędkość wystania, dzieląc odległość występu przez czas wysunięcia. Oblicz prędkość wciągania, dzieląc odległość występu przez czas chowania. W tym przykładzie prędkość wypukłości jest obliczana jako 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min., a prędkość cofania jest identyczna, ponieważ linia reprezentująca czas ma tę samą długość. 
	UWAGA: Porównując różne typy komórek, tj. komórki wykazujące ekspresję typu dzikiego i zmutowane konstrukty tego samego białka, konieczne jest przeprowadzenie zaślepionej analizy, aby nie wprowadzać stronniczości.</li>
</ol>

<ol><li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+embryonic+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C+-+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li>
<li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li>
<li>Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+formins+to+remodel+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).</li>
<li>Chesarone, M. A., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+nucleation+and+elongation+factors%3A+mechanisms+and+interplay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).</li>
<li>Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+JM+%22The+Actin+Cytoskeleton+and+the+Regulation+of+Cell+Migration.+Colloquium+series+on+building+blocks+of+the+cell%3A+cell+structure+and+function%22">The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function</a>. , Morgan and Claypool Life Sciences, Morgan and Claypool Publishers. (2013).</li>
<li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li>
<li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+stress+fibers--assembly%2C+dynamics+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, Pt 8 1855-1864 (2012).</li>
<li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+contributes+to+cell-scale+actin+network+treadmilling+through+network+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly.</a> Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).</li>
<li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+actin%3A+matching+assembly+factors+with+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).</li>
<li>Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED%2C+a+new+computer-assisted+motion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li>
<li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+between+Ena%2FVASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li>
<li>Jacks laboratory protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs">http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs</a> (2021).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187(2011).</li>
<li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Abl-related+gene+%28Arg%29+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li>
<li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li>
<li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li>
<li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+%28Arg%29+tyrosine+kinase+and+N-WASp%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li>
<li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Dynamika wypukłości krawędzi komórki, składająca się z wypukłości, retrakcji i zmarszczek, jest zarówno warunkiem wstępnym, jak i potencjalnym zdarzeniem ograniczającym szybkość ruchliwości komórek. W tym miejscu opisujemy szybką i prostą metodę pomiaru dynamiki wystających krawędzi komórek podczas rozsiewania. Metoda ta umożliwia obrazowanie w krótkim czasie, generuje znaczną ilość danych, nie wymaga znakowania fluorescencyjnego komórek ani drogiego sprzętu do mikroskopii fluorescencyjnej i może być stosowana jako wstęp...

Migracja komórek jest krytycznym procesem, który kontroluje rozwój i funkcjonowanie wszystkich żywych organizmów. Migracja komórek zachodzi zarówno w stanach fizjologicznych, takich jak embriogeneza, gojenie się ran i odpowiedź immunologiczna, jak i w stanach patologicznych, takich jak przerzuty raka i choroba autoimmunologiczna. Pomimo różnic w typach komórek, które biorą udział w różnych zdarzeniach migracyjnych, wszystkie zdarzenia ruchliwości komórek mają podobne mechanizmy molekularne, które zostały zachowane w ewolucji od pierwotniaków do ssaków i obejmują wspólne mechanizmy kontroli cytoszkieletu, które mogą wyczuwać środowisko, reagować na sygnały i modulować zachowanie komórki w odpowiedzi1.
Początkowym etapem migracji komórek może być tworzenie bardzo dynamicznych wypukłości na krawędzi czołowej komórki. Za blaszką można znaleźć blaszkę, która łączy aktynę ze kurczliwością za pośrednictwem miozyny II i pośredniczy w przyleganiu do podłoża leżącego poniżej. Lamelipodia są indukowane przez bodźce zewnątrzkomórkowe, takie jak czynniki wzrostu, cytokiny i receptory adhezyjne komórek, i są napędzane przez polimeryzację aktyny, która zapewnia siłę fizyczną, która popycha błonę plazmatyczną do przodu2,3. Zaangażowanych jest w to wiele białek sygnałowych i strukturalnych; wśród nich są GTPazy Rho, które działają koordynacyjnie z innymi sygnałami, aktywując białka regulujące aktynę, takie jak kompleks Arp 2/3, białka z rodziny WASP oraz członkowie rodzin Formin i Spire w lamellipodiach2,4,5.
Oprócz polimeryzacji aktyny, aktywność miozyny II jest niezbędna do generowania sił skurczu na blaszce blaszkowej i przedniej. Skurcze te, definiowane również jako retrakcja krawędzi komórki, mogą również wynikać z depolimeryzacji aktyny dendrytycznej na obrzeżach komórki i mają kluczowe znaczenie dla rozwoju blaszkowatej krawędzi natarcia i umożliwienia występowi wyczucia elastyczności macierzy zewnątrzkomórkowej i innych komórek oraz określenia kierunku migracji6,7,8. Występy krawędzi komórek, które nie mogą przyczepić się do podłoża, tworzą falbany błony obwodowej, struktury przypominające arkusze, które pojawiają się na brzusznej powierzchni blaszek i blaszek i przesuwają się do tyłu w stosunku do kierunku migracji. Ponieważ blaszka nie przyczepia się do podłoża, pod nią tworzy się tylna blaszka i mechanicznie popycha pierwsze blaszki w kierunku górnej powierzchni brzusznej. Włókna aktyny w falbanie, które wcześniej były równoległe do podłoża, teraz stają się do niego prostopadłe, a falbana znajduje się teraz nad posuwającym się blaszką. Falbania, która porusza się do tyłu, wpada z powrotem do cytozolu i reprezentuje komórkowy mechanizm recyklingu aktyny lamellipodial9,10.
Tutaj opisujemy test do pomiaru dynamiki wystania krawędzi komórki. Test wypukłości wykorzystuje poklatkową mikroskopię wideo do pomiaru dynamiki wypukłości pojedynczej komórki przez 10 minut podczas fazy rozprzestrzeniania się komórki. Dynamika wypukłości jest analizowana poprzez generowanie kimografów z tych filmów. Zasadniczo kimograf dostarcza szczegółowych danych ilościowych o poruszających się cząstkach na wykresie czasoprzestrzennym, aby uzyskać jakościowe zrozumienie dynamiki krawędzi komórki. Intensywność poruszającej się cząstki jest wykreślana dla wszystkich stosów obrazów na wykresie czasu w funkcji przestrzeni, gdzie oś X i oś Y reprezentują odpowiednio czas i odległość11. Metoda ta wykorzystuje ręczną analizę kimografową z ImageJ w celu uzyskania szczegółowych danych ilościowych, umożliwiających pobieranie informacji z filmów i obrazów w przypadku niskiego stosunku sygnału do szumu i/lub wysokiej gęstości cech oraz analizę obrazów uzyskanych w mikroskopii świetlnej z kontrastem fazowym lub słabej jakości obrazu.
Opisany tutaj test dynamiki wypukłości krawędzi komórki jest szybką, prostą i opłacalną metodą. W związku z tym, a także dlatego, że wykazano, że jest bezpośrednio skorelowany z migracją komórek11,12, może być stosowany jako wstępna metoda badania dynamiki cytoszkieletu zaangażowanej w ruchliwość komórek przed podjęciem decyzji o zastosowaniu metod wymagających większej ilości zasobów. Co więcej, umożliwia również ilościowy pomiar tego, w jaki sposób manipulacje genetyczne (nokaut, powalenie lub ratunek) białek cytoszkieletu wpływają na dynamikę cytoszkieletu przy użyciu prostej platformy. Test jest pouczającym modelem do badania dynamiki cytoszkieletu w kontekście migracji komórek i może być wykorzystany do wyjaśnienia mechanizmów i cząsteczek leżących u podstaw ruchliwości komórek.

<table><tbody><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych 10 cm</td><td>Greiner</td><td>P7612-360EA</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)</td><td>Biological Industries, Izrael</td><td>01-055-1A</td><td>Pożywka zawiera wysoką glukozę (4,5 g/L D-glukozy)</td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1xDPBS)</td><td>Biological Industries, Izrael</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Biological Industries, Izrael</td><td>04-001-1A</td> Fibronektyna z ludzkiego osocza, płynna, 0,1%, odpowiednia <td></td></tr><tr><td>do hodowli komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>Naczynie ze szklanym dnem 35 mm, rozmiar naczynia 35 mm, rozmiar studni 20 mm, szkło nakrywkowe #1.5 (0.16-0.19 mm).</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Feely dostępne pod adresem: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji mikroskopu wyposażone w cyfrowy CMOS ORCA-Flash 4.0 V2</td></tr><tr><td>Leica AF6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Odwrócony mikroskop jasnego pola (40x, NA 1.3 ) wyposażony w optykę z kontrastem fazowym, inkubator i jednostkę CO2 z oprogramowaniem do akwizycji LAS AF wyposażoną w Cyfrowa kamera CMOS ORCA-Flash 4.0 V2 .</td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy</td><td>Biological Industries, Izrael</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 V2 cyfrowa kamera CMOS</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny</td><td>Biological Industries, Izrael</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA roztwór B (0,25%), EDTA (0,05%)</td><td>Biological Industries, Izrael</td><td>03-052-1A</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

Rozwój i homeostaza organizmów wielokomórkowych opiera się na skoordynowanej regulacji migracji komórek. Migracja komórek jest istotnym wydarzeniem w budowie i regeneracji tkanek i ma kluczowe znaczenie w rozwoju embrionalnym, odpowiedziach immunologicznych i gojeniu się ran. Rozregulowanie ruchliwości komórek przyczynia się do zaburzeń patologicznych, takich jak przewlekłe stany zapalne i przerzuty do raka. Migracja komórek, inwazja tkanek, aksony i rozrost dendrytów rozpoczynają się od wypukłości krawędzi komórki za pośrednictwem polimeryzacji aktyny. W tym miejscu opisujemy prostą, wydajną i oszczędzającą czas metodę obrazowania i analizy ilościowej dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozsiewania. Metoda ta mierzy dyskretne cechy dynamiki błony komórkowej, takie jak wypukłości, retrakcje i zmarszczki, i może być wykorzystana do oceny, w jaki sposób manipulacje kluczowymi regulatorami aktyny wpływają na wypukłości krawędzi komórki w różnych kontekstach.

W eksperymencie opisanym na Rysunku 2, unieśmiertelnione MEF wysiano na szalkach z dnem szklanym, uprzednio pokrytych fibronektyną w celu aktywacji sygnalizacji zależnej od integryn, a następnie zablokowanych denaturowanym BSA, aby zablokować wolne potencjalne miejsca adhezji komórkowej niezależnej od aktywacji integryn. Aby w dniu eksperymentu osiągnąć logarytmiczną fazę wzrostu przy 70%-80% konfluencji komórek, 0,7 x 106 MEF wysiano na płytkę do hodowli tkanek o średnicy 10 cm n...

Ten protokół ma na celu zmierzenie parametrów dynamicznych (wypukłości, retrakcje, falbany) wypukłości na krawędzi komórek rozsiewających.

Pomiar dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Wykazano, że test wypukłości krawędzi komórki bezpośrednio koreluje z migracją komórek. Dlatego może być stosowana jako wstępna metoda identyfikacji krytycznych białek i mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w ruchliwość komórek. Metoda jest szybka, prosta, opłacalna i nie wymaga znakowania fluorescencyjnego ani użycia drogiego mikroskopu fluorescencyjnego.Procedurę zademonstruje Michał Gendler, student z mojego laboratorium. Dodaj dwa mililitry jednego normalnego roztworu kwasu solnego na środek naczynia ze szklanym dnem i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj naczynie trzy razy dwoma mililitrami PBS.Rozcieńczyć fibronektynę w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr w PBS i dodać 200 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu do szklanego naczynia środkowego. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotować 1% roztwór BSA i PBS i przepuścić go przez filtr 0,2 mikrometra.Denaturację roztworu przez inkubację w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 30 minut we wstępnie podgrzanej łaźni wodnej. Umyj naczynie z powlekanym szklanym dnem trzema mililitrami PBS. Dodaj dwa mililitry denaturowanego roztworu BSA i inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Umyj szklane naczynie trzema mililitrami PBS. Przed 16 do 18 godzinami eksperymentu na płytce do hodowli tkankowej o średnicy 0,7 miliona komórek na 10 centymetrów, aby osiągnąć 70 do 80% zbieżności. Następnego dnia dodaj dwa mililitry roztworu trypsyny do płytki do hodowli tkankowej i inkubuj przez dwie do trzech minut, aż komórki się oderwą.Dodaj pięć mililitrów pożywki, aby dezaktywować trypsynę. Za pomocą hemekytometru policz komórki i umieść 20 000 komórek w dwóch mililitrach kompletnej pożywki w dolnym naczyniu. Następnie inkubuj naczynie z platerowanymi komórkami w inkubatorze przez 15 minut.Włącz urządzenie grzewcze i ustaw je na 37 stopni Celsjusza na godzinę przed obrazowaniem. Włącz również jednostkę dwutlenku węgla i ustaw ją na 5%10 minut przed obrazowaniem. Włącz mikroskop i kamerę.Włącz komputer i otwórz oprogramowanie do akwizycji mikroskopu. Ustaw powiększenie na 40-krotny suchy kontrast fazowy soczewki. Ustaw całkowity czas trwania filmu na 10 minut z interwałem czasu wynoszącym pięć sekund.Po 15 minutach inkubacji umieść naczynie ze szklanym dnem z przylegającymi komórkami w adapterze i zamocuj. Włóż adapter wraz z naczynią do szczelin w stoliku mikroskopu. Zdejmij pokrywę naczynia, załóż pokrywkę na dwutlenek węgla i otwórz zawór dwutlenku węgla.Znajdź odpowiednią komórkę do obrazowania. Akwizycja filmu rozpocznie się po ustawieniu ostrości na komórce. Aby przeprowadzić analizę obrazu, wybierz narzędzie proste w oprogramowaniu do analizy obrazu i wykonaj osiem linii po 20 dowolnych jednostek prostopadłych do występów w układzie promieniowym co 45 stopni, łącznie z blaszką i krawędzią komórki.Na głównym pasku narzędzi przejdź do obrazu, wybierz Stosy, a następnie kliknij Reslice, aby wygenerować obraz kimograficzny opisujący ruch pojedynczych punktów w błonie komórkowej. Korzystając z obrazów kimografu, wyodrębnij i ręcznie policz liczbę wypukłości, cofnięć i zmarszczek w każdym z ośmiu regionów w komórce zaznaczonych liniami siatki. Liczby te reprezentują częstotliwość występowania, wycofywania i marszczenia na 10 minut.Określ trwałość, odległość i prędkość wypukłości za pomocą analizy kymograficznej. Aby określić odległość występu, narysuj prostopadłą linię od podstawy występu do najwyższego wierzchołka występu. Naciśnij M, aby zmierzyć długość linii w pikselach i upewnić się, że stosunek pikseli do mikrometrów jest znany z przeliczania długości w mikrometrach.Kwantyfikacja wypukłości, reakcji i falban była wykonywana ręcznie co 10 minut, a średnia częstotliwość uzyskana dla wypukłości i retrakcji wynosiła 5,1 i 2,1 dla falban. Reprezentatywny kimograf miał odległość występu około 4,8 mikrometra i czas wysunięcia około 0,6 minuty. Przedstawiono przykład komórki, która powinna zostać wykluczona z analizy.Analiza kimograficzna wykazała, że komórka nie była obecna w fazie rozprzestrzeniania się i nie wykazywała żadnych wyraźnych wypukłości błony. Najważniejszą rzeczą jest wybór odpowiednich komórek do obrazowania. Właściwa komórka powinna znajdować się w fazie rozprzestrzeniania się i nie powinna dotykać innych komórek, aby uniknąć komunikacji i sygnalizacji między komórkami.Metoda ta może być wykorzystana jako wstępne narzędzie do badania dynamiki cytoszkieletu obejmującej ruchliwość komórek przed podjęciem decyzji o wykonaniu bardziej wymagających testów migracji komórek.

measuring-cell-edge-protrusion-dynamics-during-spreading-using-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Prezentujemy oprogramowanie do półautomatycznego śledzenia względnego stężenia białka na całej długości dynamicznych wypukłości komórkowych.

Graficzny interfejs użytkownika do wspomaganego programowo śledzenia stężenia białka w dynamicznych wypukłościach komórkowych

Tutaj szczegółowo opisujemy techniki eksperymentalne używane do oceny sił wypukłości, które podosomy przykładają do odpowiedniej folii, od przygotowania filmu do automatycznej analizy obrazów topograficznych.

Mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Korzystając z wcześniej zaprojektowanego urządzenia do mechanicznego obciążania przylegających komórek, ten artykuł opisuje przeprojektowaną geometrię podłoża i dostosowane urządzenie do obrazowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości z obiektywem 100x zanurzenia w olejku.

Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

Ta metoda jest przydatna do ilościowego określania wczesnej dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek zależnych od zakotwiczenia na fibronektynie. Ponadto test ten może być wykorzystany do zbadania wpływu zmienionej homeostazy redoks na rozprzestrzenianie się komórek i/lub wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe związane z adhezją komórek.

Badanie dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek nabłonka na fibronektynie podczas stresu oksydacyjnego

Obrazowanie na żywo lizosomalnej egzocytozy na mikrowzorcach komórek pozwala na przestrzenną kwantyfikację tego procesu. Normalizacja morfologii za pomocą mikrowzorców jest znakomitym narzędziem do odkrywania ogólnych zasad dotyczących przestrzennego rozkładu procesów komórkowych.

Kwantyfikacja parametrów czasoprzestrzennych egzocytozy komórkowej w komórkach z mikrowzorami

W tym protokole prezentujemy eksperymentalne procedury testu rozprzestrzeniania się komórek, który opiera się na mikroskopii żywych komórek. Dostarczamy narzędzie obliczeniowe typu open source do bezstronnej segmentacji komórek znakowanych fluorescencyjnie i ilościowej analizy dynamiki lamellipodiów podczas rozprzestrzeniania się komórek.

Analiza ilościowa dynamiki krawędzi komórek podczas rozprzestrzeniania się komórek

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół krokowy, jak wykorzystać zintegrowany wielofunkcyjny i programowalny przez użytkownika system, który umożliwia automatyczne obrazowanie wielokanałowe i analizę mechanobiologiczną w celu wyjaśnienia mechano-wrażliwości białka związanego z Tak (YAP).

W pełni optyczne badanie mechanobiologiczne białka związanego z Tak w ludzkim raku i normalnych komórkach przy użyciu wielofunkcyjnego systemu

Tutaj prezentujemy wszechstronne urządzenie do rozciągania równoosiowego, które jest uruchamiane pneumatycznie i kompatybilne z mikroskopią o wysokiej rozdzielczości.

Równoosiowe urządzenie rozciągające do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek o dużym powiększeniu

Poznaj metodę pomiaru dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek. Ta prosta technika bez fluorescencji pozwala analizować motorykę komórkową i dynamikę cytoszkieletu.

Pomiar dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek

Przeglądaj więcej filmów