Pomiar dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek
1 listopada 2021
Ten protokół ma na celu zmierzenie parametrów dynamicznych (wypukłości, retrakcje, falbany) wypukłości na krawędzi komórek rozsiewających.
Wykazano, że test wypukłości krawędzi komórki bezpośrednio koreluje z migracją komórek. Dlatego może być stosowana jako wstępna metoda identyfikacji krytycznych białek i mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w ruchliwość komórek. Metoda jest szybka, prosta, opłacalna i nie wymaga znakowania fluorescencyjnego ani użycia drogiego mikroskopu fluorescencyjnego.
Procedurę zademonstruje Michał Gendler, student z mojego laboratorium. Dodaj dwa mililitry jednego normalnego roztworu kwasu solnego na środek naczynia ze szklanym dnem i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj naczynie trzy razy dwoma mililitrami PBS.
Rozcieńczyć fibronektynę w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr w PBS i dodać 200 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu do szklanego naczynia środkowego. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotować 1% roztwór BSA i PBS i przepuścić go przez filtr 0,2 mikrometra.
Denaturację roztworu przez inkubację w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 30 minut we wstępnie podgrzanej łaźni wodnej. Umyj naczynie z powlekanym szklanym dnem trzema mililitrami PBS. Dodaj dwa mililitry denaturowanego roztworu BSA i inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.
Umyj szklane naczynie trzema mililitrami PBS. Przed 16 do 18 godzinami eksperymentu na płytce do hodowli tkankowej o średnicy 0,7 miliona komórek na 10 centymetrów, aby osiągnąć 70 do 80% zbieżności. Następnego dnia dodaj dwa mililitry roztworu trypsyny do płytki do hodowli tkankowej i inkubuj przez dwie do trzech minut, aż komórki się oderwą.
Dodaj pięć mililitrów pożywki, aby dezaktywować trypsynę. Za pomocą hemekytometru policz komórki i umieść 20 000 komórek w dwóch mililitrach kompletnej pożywki w dolnym naczyniu. Następnie inkubuj naczynie z platerowanymi komórkami w inkubatorze przez 15 minut.
Włącz urządzenie grzewcze i ustaw je na 37 stopni Celsjusza na godzinę przed obrazowaniem. Włącz również jednostkę dwutlenku węgla i ustaw ją na 5%10 minut przed obrazowaniem. Włącz mikroskop i kamerę.
Włącz komputer i otwórz oprogramowanie do akwizycji mikroskopu. Ustaw powiększenie na 40-krotny suchy kontrast fazowy soczewki. Ustaw całkowity czas trwania filmu na 10 minut z interwałem czasu wynoszącym pięć sekund.
Po 15 minutach inkubacji umieść naczynie ze szklanym dnem z przylegającymi komórkami w adapterze i zamocuj. Włóż adapter wraz z naczynią do szczelin w stoliku mikroskopu. Zdejmij pokrywę naczynia, załóż pokrywkę na dwutlenek węgla i otwórz zawór dwutlenku węgla.
Znajdź odpowiednią komórkę do obrazowania. Akwizycja filmu rozpocznie się po ustawieniu ostrości na komórce. Aby przeprowadzić analizę obrazu, wybierz narzędzie proste w oprogramowaniu do analizy obrazu i wykonaj osiem linii po 20 dowolnych jednostek prostopadłych do występów w układzie promieniowym co 45 stopni, łącznie z blaszką i krawędzią komórki.
Na głównym pasku narzędzi przejdź do obrazu, wybierz Stosy, a następnie kliknij Reslice, aby wygenerować obraz kimograficzny opisujący ruch pojedynczych punktów w błonie komórkowej. Korzystając z obrazów kimografu, wyodrębnij i ręcznie policz liczbę wypukłości, cofnięć i zmarszczek w każdym z ośmiu regionów w komórce zaznaczonych liniami siatki. Liczby te reprezentują częstotliwość występowania, wycofywania i marszczenia na 10 minut.
Określ trwałość, odległość i prędkość wypukłości za pomocą analizy kymograficznej. Aby określić odległość występu, narysuj prostopadłą linię od podstawy występu do najwyższego wierzchołka występu. Naciśnij M, aby zmierzyć długość linii w pikselach i upewnić się, że stosunek pikseli do mikrometrów jest znany z przeliczania długości w mikrometrach.
Kwantyfikacja wypukłości, reakcji i falban była wykonywana ręcznie co 10 minut, a średnia częstotliwość uzyskana dla wypukłości i retrakcji wynosiła 5,1 i 2,1 dla falban. Reprezentatywny kimograf miał odległość występu około 4,8 mikrometra i czas wysunięcia około 0,6 minuty. Przedstawiono przykład komórki, która powinna zostać wykluczona z analizy.
Analiza kimograficzna wykazała, że komórka nie była obecna w fazie rozprzestrzeniania się i nie wykazywała żadnych wyraźnych wypukłości błony. Najważniejszą rzeczą jest wybór odpowiednich komórek do obrazowania. Właściwa komórka powinna znajdować się w fazie rozprzestrzeniania się i nie powinna dotykać innych komórek, aby uniknąć komunikacji i sygnalizacji między komórkami.
Metoda ta może być wykorzystana jako wstępne narzędzie do badania dynamiki cytoszkieletu obejmującej ruchliwość komórek przed podjęciem decyzji o wykonaniu bardziej wymagających testów migracji komórek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia test wypustek krawędziowych komórek służący do badania parametrów dynamicznych rozprzestrzeniających się komórek, w tym wypustek, retrakcji i fałd błony komórkowej. Metoda ta jest szczególnie istotna, ponieważ koreluje z migracją komórek, pomagając w identyfikacji kluczowych białek i mechanizmów sygnalizacyjnych uczestniczących w motywności komórkowej.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Migracja komórek
- Motylość komórek
- Dynamika cytoszkieletu
Wstęp
- Istnieje korelacja między wypustkami na krawędziach komórek a migracją komórkową.
- Metoda ta jest prosta, kosztowo efektywna i nie wymaga znakowania fluorescencyjnego.
- Zrozumienie natury wypustek może dostarczyć wiedzy na temat zachowania komórek oraz mechanizmów napędzających ich ruchliwość.
Zastosowane metody
- Analiza wypustek krawędziowych komórek
- Komórki przytwierdzone do naczynia z szklanym dnem
- Analiza kymograficzna w celu oceny wypustek
Główne wyniki
- Średnia częstotliwość powstawania wypustek wynosiła 5,1 na 10 minut, natomiast dla fałdów błonowych (ruffles) było to 2,1.
- Analiza kymograficzna wykazała, że odległość wysunięcia wypustek wynosiła około 4,8 mikrometra.
- Zidentyfikowano znaczenie wyboru odpowiednich komórek w fazie rozprzestrzeniania się dla uzyskania dokładnych wyników.
Wnioski
- Badanie wprowadza przystępny test do oceny dynamiki ruchliwości komórek.
- Metoda ta służy jako narzędzie do wstępnej oceny przed przeprowadzeniem bardziej złożonych testów migracji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dynamika wypustek krawędzi komórkowych służy jako wczesny, prognostyczny wskaźnik ruchliwości komórek, umożliwiając szybką ocenę regulatorów cytoszkieletu przed przystąpieniem do czasochłonnych i kosztownych analiz migracji. Metoda ta wspiera walidację celów poprzez powiązanie zaburzeń molekularnych z funkcjonalną dynamiką błon, co pozwala na mechanistyczną minimalizację ryzyka w procesach odkrywania leków. Jej bezetykietowa, kosztowo efektywna konstrukcja ułatwia wysokoprzepustowe przesiewanie szlaków sygnalizacyjnych istotnych dla gojenia ran, odpowiedzi immunologicznej oraz przerzutowania nowotworów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pomiar częstotliwości, trwałości, dystansu i prędkości wypustek w celu zweryfikowania hipotez terapeutycznych dotyczących regulatorów aktyny i szlaków motylości.
- Wartość operacyjna: Umożliwia szybki, bezznakowy screening wyciszeń białek lub inhibitorów wpływających na dynamikę cytoszkieletu.
- Wartość prognostyczna: Koreluje dynamikę wypustek z migracją komórek, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) na podstawie wczesnych odczytów fenotypowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe wskaźniki pochodzące z kymografów (liczba wypustek, odległość, prędkość) w celu ustandaryzowanego porównania między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje mikroskopię fazowo-kontrastową oraz ogólnodostępne narzędzia do analizy obrazu, co zmniejsza zależność od specjalistycznego sprzętu lub sond fluorescencyjnych.
- Skalowalność: Umożliwia testowanie wielu warunków poprzez radialne próbkowanie ośmiu obszarów błony na komórkę, co zwiększa wiarygodność danych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy modulację celu molekularnego z funkcjonalnym zachowaniem komórkowym w systemach istotnych dla chorób, takich jak fibroblasty lub komórki odpornościowe.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala wyjaśnić, czy obserwowane efekty fenotypowe wynikają ze zmienionej dynamiki wypustek, a nie z wtórnej cytotoksyczności lub defektów adhezyjnych.
- Korelacja z biomarkerami: Parametry wypustek mogą służyć jako biomarkery translacyjne, gdy są powiązane z fenotypami ruchliwości lub inwazji in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od etapu angażowania celu po walidację fenotypową, stanowiąc pomost między przesiewaniem biochemicznym a funkcjonalnymi analizami komórkowymi.
- Biologia odkrywcza: Pozwala badać, w jaki sposób manipulacje genetyczne lub farmakologiczne regulatorów aktyny (np. Arp2/3, kofilin, GTPazy Rho) wpływają na dynamikę wypustek jako wskaźnik motywności.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki (np. liczba wypustek na 10 minut, prędkość wypustek), które umożliwiają porównania między bibliotekami związków lub w badaniach przesiewowych genetycznych.
- Analityka: Kimografia zapewnia rozdzielczość czasową i przestrzenną dynamiki błon, co pozwala na wyodrębnienie parametrów kinetycznych krytycznych dla modelowania mechanistycznego.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość w modelach przedklinicznych poprzez walidację, że zidentyfikowane cele wywołują spójne fenotypy wypustek w liniach komórkowych pierwotnych lub istotnych dla danej choroby.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy standaryzowaną, niskokosztową platformę do wielokrotnego wykorzystania w projektach badających motywność komórek w procesach rozwoju, stanach zapalnych lub onkologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez bezpośrednie powiązanie zaburzeń molekularnych z mierzalną dynamiką błon).
- Wartość operacyjna: Eliminuje potrzebę znakowania fluorescencyjnego i stosowania kosztownego sprzętu obrazującego, obniżając barierę wejścia do analizy i zwiększając jej dostępność.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wczesne filtrowanie celów przy użyciu predykcyjnego, fenotypowego punktu odniesienia dla migracji komórek.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zgodność między dynamiką wypustek a potencjałem migracyjnym.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu żywych komórek, generowaniu kymografów oraz manualnej lub półautomatycznej analizie wypustek.
- Zależy od zastosowania mikroskopii fazokontrastowej oraz oprogramowania do analizy obrazów umożliwiającego tworzenie przekrojów (reslice) i kymografów.
- Wymaga standaryzacji gęstości siewu komórek, powłoki podłoża (fibronektyna/BSA) oraz kontroli parametrów środowiskowych (37°C, 5% CO2) w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wymaga przeszkolenia w zakresie identyfikacji komórek w odpowiedniej fazie rozprzestrzeniania się oraz unikania komórek zlewnej lub stykających się, co mogłoby zafałszować pomiary wypustek.
- Ogranicza się do rozprzestrzeniania na podłożu 2D; może nie w pełni oddawać fenotypy inwazji 3D lub migracji w warunkach ograniczenia przestrzennego.
