Pomiar dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek

Wykazano, że test wypukłości krawędzi komórki bezpośrednio koreluje z migracją komórek. Dlatego może być stosowana jako wstępna metoda identyfikacji krytycznych białek i mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w ruchliwość komórek. Metoda jest szybka, prosta, opłacalna i nie wymaga znakowania fluorescencyjnego ani użycia drogiego mikroskopu fluorescencyjnego.

Procedurę zademonstruje Michał Gendler, student z mojego laboratorium. Dodaj dwa mililitry jednego normalnego roztworu kwasu solnego na środek naczynia ze szklanym dnem i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj naczynie trzy razy dwoma mililitrami PBS.

Rozcieńczyć fibronektynę w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr w PBS i dodać 200 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu do szklanego naczynia środkowego. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotować 1% roztwór BSA i PBS i przepuścić go przez filtr 0,2 mikrometra.

Denaturację roztworu przez inkubację w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 30 minut we wstępnie podgrzanej łaźni wodnej. Umyj naczynie z powlekanym szklanym dnem trzema mililitrami PBS. Dodaj dwa mililitry denaturowanego roztworu BSA i inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Umyj szklane naczynie trzema mililitrami PBS. Przed 16 do 18 godzinami eksperymentu na płytce do hodowli tkankowej o średnicy 0,7 miliona komórek na 10 centymetrów, aby osiągnąć 70 do 80% zbieżności. Następnego dnia dodaj dwa mililitry roztworu trypsyny do płytki do hodowli tkankowej i inkubuj przez dwie do trzech minut, aż komórki się oderwą.

Dodaj pięć mililitrów pożywki, aby dezaktywować trypsynę. Za pomocą hemekytometru policz komórki i umieść 20 000 komórek w dwóch mililitrach kompletnej pożywki w dolnym naczyniu. Następnie inkubuj naczynie z platerowanymi komórkami w inkubatorze przez 15 minut.

Włącz urządzenie grzewcze i ustaw je na 37 stopni Celsjusza na godzinę przed obrazowaniem. Włącz również jednostkę dwutlenku węgla i ustaw ją na 5%10 minut przed obrazowaniem. Włącz mikroskop i kamerę.

Włącz komputer i otwórz oprogramowanie do akwizycji mikroskopu. Ustaw powiększenie na 40-krotny suchy kontrast fazowy soczewki. Ustaw całkowity czas trwania filmu na 10 minut z interwałem czasu wynoszącym pięć sekund.

Po 15 minutach inkubacji umieść naczynie ze szklanym dnem z przylegającymi komórkami w adapterze i zamocuj. Włóż adapter wraz z naczynią do szczelin w stoliku mikroskopu. Zdejmij pokrywę naczynia, załóż pokrywkę na dwutlenek węgla i otwórz zawór dwutlenku węgla.

Znajdź odpowiednią komórkę do obrazowania. Akwizycja filmu rozpocznie się po ustawieniu ostrości na komórce. Aby przeprowadzić analizę obrazu, wybierz narzędzie proste w oprogramowaniu do analizy obrazu i wykonaj osiem linii po 20 dowolnych jednostek prostopadłych do występów w układzie promieniowym co 45 stopni, łącznie z blaszką i krawędzią komórki.

Na głównym pasku narzędzi przejdź do obrazu, wybierz Stosy, a następnie kliknij Reslice, aby wygenerować obraz kimograficzny opisujący ruch pojedynczych punktów w błonie komórkowej. Korzystając z obrazów kimografu, wyodrębnij i ręcznie policz liczbę wypukłości, cofnięć i zmarszczek w każdym z ośmiu regionów w komórce zaznaczonych liniami siatki. Liczby te reprezentują częstotliwość występowania, wycofywania i marszczenia na 10 minut.

Określ trwałość, odległość i prędkość wypukłości za pomocą analizy kymograficznej. Aby określić odległość występu, narysuj prostopadłą linię od podstawy występu do najwyższego wierzchołka występu. Naciśnij M, aby zmierzyć długość linii w pikselach i upewnić się, że stosunek pikseli do mikrometrów jest znany z przeliczania długości w mikrometrach.

Kwantyfikacja wypukłości, reakcji i falban była wykonywana ręcznie co 10 minut, a średnia częstotliwość uzyskana dla wypukłości i retrakcji wynosiła 5,1 i 2,1 dla falban. Reprezentatywny kimograf miał odległość występu około 4,8 mikrometra i czas wysunięcia około 0,6 minuty. Przedstawiono przykład komórki, która powinna zostać wykluczona z analizy.

Analiza kimograficzna wykazała, że komórka nie była obecna w fazie rozprzestrzeniania się i nie wykazywała żadnych wyraźnych wypukłości błony. Najważniejszą rzeczą jest wybór odpowiednich komórek do obrazowania. Właściwa komórka powinna znajdować się w fazie rozprzestrzeniania się i nie powinna dotykać innych komórek, aby uniknąć komunikacji i sygnalizacji między komórkami.

Metoda ta może być wykorzystana jako wstępne narzędzie do badania dynamiki cytoszkieletu obejmującej ruchliwość komórek przed podjęciem decyzji o wykonaniu bardziej wymagających testów migracji komórek.