Izolacja limfocytów T oparta na flotacji przy użyciu sortowania komórek aktywowanych wyporem

Aby wyizolować limfocyty T - białe krwinki niezbędne dla układu odpornościowego - za pomocą sortowania komórek aktywowanego wyporem, BACS, należy pobrać zawiesinę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, PBMC. PBMC zawierają docelowe limfocyty T i komórki niedocelowe, takie jak limfocyty B, monocyty, komórki NK i komórki dendrytyczne.

Dodać bufor zawierający odpowiednią ilość biotynylowanego przeciwciała anty-CD3 i inkubować przez wymagany czas. Przeciwciało wiąże się z kompleksem CD3 – multimerycznym kompleksem białkowym na powierzchni komórki – cechą charakterystyczną limfocytów T.

Dodaj funkcjonalizowane mikropęcherzyki - małe kuliste cząstki pokryte streptawidyną - w celu pozytywnej selekcji limfocytów T związanych z przeciwciałami. Rdzeń każdego mikropęcherzyka jest pustą kulą, dzięki czemu są to cząstki o niskiej gęstości, które mogą unosić się w roztworze wodnym.

Inkubować mieszaninę pod wpływem mieszania, pozwalając mikropęcherzykom i próbce dokładnie się wymieszać. Podczas inkubacji streptawidyna na mikropęcherzykach wiąże się z biotyną na przeciwciałie związanym z limfocytami T, unieruchamiając komórki na mikropęcherzykach.

Odwirować probówkę. Komórki niebędące przedmiotem zwalczania oddzielają się od mieszaniny w postaci osadu na dnie.

Docelowe mikropęcherzyki związane z limfocytami T utrzymują się na powierzchni, co prowadzi do separacji limfocytów T na podstawie wyporu. Ta technika separacji ogranicza stres w komórkach docelowych. Za pomocą cienkiej pipety usunąć osad i subnatant bez naruszania warstwy mikropęcherzyków.

Zawiesić wyizolowane, związane z mikropęcherzykami limfocyty T w odpowiedniej pożywce hodowlanej w celu dalszego przetwarzania.

Na początek inkubuj 3 x 10⁸ komercyjnie uzyskanych PBMC w 2,5 mililitra buforu separacyjnego z biotynylowanym przeciwciałem anty-CD3. Delikatnie wymieszać składniki przez pipetowanie i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Dodaj mikropęcherzyki streptawidyny do komórek w stosunku 0,5 do 1, zgodnie z instrukcjami producenta, i mieszaj za pomocą komercyjnego rotatora end-over-end przy 20 obr./min przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu pozytywnie wybrane komórki znajdą się na górze zawiesiny z mikropęcherzykami streptawidyny, a pozostałe niewybrane komórki znajdą się w osadzie komórkowej na dnie probówki.

Za pomocą 9-calowej szklanej pipety włóż końcówkę poniżej warstwy komórek bąbelkowych na dno probówki. Odessać osad komórkowy i subnatant za pomocą pipety elektronicznej i przenieść je do nowej probówki.

Ponownie zawiesić warstwę komórek bąbelkowych pozostawioną w oryginalnej probówce w 1 mililitrze kompletnego podłoża z komórek T. Odwirować subnatant o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i użyć go do pośredniego pomiaru czystości i odzysku.