Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i identyfikacja epitopów komórek T CD4 ograniczonych do HLA-DR na podstawie matrycy peptydowej

W przewlekłym zakażeniu HBV limfocyty T CD4 odgrywają ważną rolę zarówno w klirensie wirusa, jak i w powrotach. Metoda ta pozwala nam ocenić odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i jednocześnie zidentyfikować epitopy limfocytów T CD4 specyficzne dla HBV. Procedurę zademonstruje Jianmei Xiao, asystent naukowy.

I Xing Wan, technik z Bilao. Na początek wyizoluj jednojądrzaste komórki krwi obwodowej lub PBMC z krwi, stosując wirowanie w gradiencie gęstości Ficoll w temperaturze 800 razy G przez 20 minut. Następnie zbierz granulocyty między warstwą czerwonych krwinek a warstwą czerwonych krwinek za pomocą pipety Pasteura.

Przenieś rozmrożoną zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej, dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanej benzonazy RPMI 1640, kropli, a następnie powoli dodaj kolejne sześć mililitrów. Przepłucz fiolkę kriogeniczną dwoma mililitrami benzonazy RPMI 1640, aby odzyskać pozostałe komórki. Następnie odwirować probówkę o temperaturze 400 razy G przez 10 minut.

Usunąć supernatant i poluzować osad, stukając w rurkę. Delikatnie ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze ciepłego Bensenase NACE RPMI 1640. Delikatnie wymieszaj komórki i przefiltruj je przez sitko o średnicy 70 mikrometrów, jeśli widoczne są jakieś grudki komórek.

Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Ponownie zawiesić PBMC i kompletną pożywkę hodowlaną, zawierającą 10 jednostek na mililitr IL2 i 10 nanogramów na mililitr IL7. Dostosuj gęstość komórek do 1,5x10 do 6 komórek na mililitr.

Następnie umieść komórki w 96-dołkowych płytkach z płaskim dnem o gęstości 3x10 do piątych komórek na studzienkę. Dodaj wirusa zapalenia wątroby typu B lub pule peptydów pochodzących z HBV do każdej studzienki. W przypadku studzienek tła i kontroli pozytywnej dodać taką samą ilość rozpuszczalnika.

Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Trzeciego dnia uzupełnij pożywkę hodowlaną o 50 jednostek na mililitr IL2 i 10 nanogramów na mililitr IL7. Siódmego dnia zastąp połowę pożywki hodowlanej świeżą pożywką zawierającą: cztery mikrogramy na mililitr peptydów, 100 jednostek na mililitr IL2 i 20 nanogramów na mililitr IL7.

W dniu 10 delikatnie pipetuj komórki w każdym dołku siedem do dziewięciu razy, aby zdezagregować klastry komórek. Policz liczbę żywotnych komórek i przenieś 2x10 do piątych komórek do każdej studzienki 96-dołkowej okrągłej płytki dolnej w celu analizy odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HPV. W przypadku pozostałych komórek w 96-dołkowej płaskiej płytce dennej należy dostosować objętość pożywki hodowlanej do 100 mikrolitrów, odrzucając nadmierną pożywkę.

Następnie uzupełnij kulturę 100 mikrolitrami świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej, zawierającej: cztery mikrogramy na mililitr peptydów, 100 jednostek na mililitr IL2 i 20 nanogramów na mililitr IL7. Kontynuuj hodowlę komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w celu identyfikacji epitopów w 12 dniu. Umyj komórki w 96-dołkowej okrągłej płytce dennej, dodając 200 mikrolitrów RPMI 1640, odwirowując płytkę przy 550 razy G przez trzy minuty i odrzucając supernatant.

Powtórz pranie dwukrotnie, używając kompletnej pożywki hodowlanej do ostatniego prania. Do każdej studzienki komórek stymulowanych określoną pulą peptydową dodać 200 mikrolitrów kompletnej pożywki hodowlanej uzupełnionej tą samą pulą peptydową. Do studzienki kontrolnej tła dodać kompletną pożywkę hodowlaną, uzupełnioną jednym mikrolitrem na mililitr DMSO.

Do studzienki kontroli pozytywnej dodać kompletną pożywkę hodowlaną uzupełnioną jednym mikrolitrem na mililitr DMSO, 150 nanogramami na mililitr PMA i jednym mikromolem na litr jonomycyny. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez sześć godzin. Po godzinie inkubacji dodać do kultury 1,37 mikrograma na mililitr monenzyny.

Po zakończeniu sześciogodzinnej inkubacji odwirować płytkę o stężeniu 550 razy G przez trzy minuty. Usunąć supernatant i przemyć komórki raz 200 mikrolitrami DPP, jak pokazano wcześniej. Bejca do markerów powierzchniowych CD3, CD4 i CD8 oraz marker żywotności.

Po zawieszeniu komórek za pomocą wibratora, następnie wstaw płytkę do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Po jednokrotnym umyciu płytki 200 mikrolitrami DPBS, utrwal i przepuszczaln komórki, wybarwić cytokin wewnątrzkomórkowych, TNF alfa i interferon-gamma i wstaw płytkę do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 minut. Ponownie umyj komórki i ponownie zawieś je w 150 mikrolitrach buforu cytometrii przepływowej.

Następnie uzyskaj dane cytometrii przepływowej za pomocą cytometru przepływowego. Utrzymuj alergiczne linie komórkowe limfoblastoidów B lub BLCL w kolbie T-75. W 12 dniu ekspansji PBMC policz liczbę żywotnych BLCL i przenieś je do 15-mililitrowych probówek wirówkowych.

Odwirować komórki w temperaturze 350 razy G przez 10 minut i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy i kompletną pożywkę hodowlaną. Następnie porcjować BLCL na 96-dołkową okrągłą płytkę dolną w proporcji 4x10 do czwartej komórki na studzienkę i 80 mikrolitrów kompletnej pożywki hodowlanej.

Dodaj 10 mikrogramów na mililitr pojedynczego peptydu i ustaw dwie kontrole w tle. Peptyd pulsujący z blokowaniem HLADR i pulsujący DMSO. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny.

Dodać 100 mikrogramów na mililitr mitomycyny C i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez godzinę. Umyj płytkę trzykrotnie 200 mikrolitrami RPMI 1640 w celu usunięcia niepulsacyjnego peptydu i mitomycyny C, a następnie ponownie zawiesić komórki w 120 mikrolitrach kompletnej pożywki hodowlanej za pomocą wibratora. W 12 dniu ekspansji PBMC przenieś PBMC na 96-dołkową okrągłą płytę denną.

Odwirować komórki na płytce, usunąć supernatant i umyć je dwukrotnie 200 mikrolitrami RPMI 1640, jak pokazano wcześniej. Ponownie zawiesić PBMC w każdym dołku z 210 mikrolitrami kompletnej pożywki hodowlanej. W przypadku studzienek PBMC wybranych do identyfikacji epitopów, należy podać 70 mikrolitrów zawiesiny komórek i wymieszać z pulsacyjnymi peptydowymi BLCL w trzech dołkach, w tym w dwóch kontrolach tła.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez sześć godzin. Po godzinie inkubacji dodać 1,37 mikrograma na mililitr monenzyny do kultury i doprowadzić końcową objętość w każdym dołku do 200 mikrolitrów za pomocą kompletnej pożywki hodowlanej. W tym reprezentatywnym przykładzie odpowiedzi limfocytów T CD4 wydzielających TNF alfa i interferon-gamma dla puli peptydowej Core11 są niższe niż dwa razy wartości tła, stąd uważane za ujemne.

Tymczasem odpowiedzi na pulę peptydową Core09 są ponad dwukrotnie wyższe niż tło i uważane za pozytywne. Szare tło wskazuje, że studzienki z dodatnią odpowiedzią limfocytów T CD4 i peptydy kandydujące do identyfikacji epitopów są oznaczone na czerwono, Core01 ma najwyższy wskaźnik odpowiedzi, sądząc zarówno po komórkach CD4T wydzielających TNF alfa, jak i interferon-gamma w pulach peptydów kolumnowych. Peptydy C1 do 15, C31 do 45, C61 do 75 i C91 do 105 w tej puli peptydów są ustawione jako peptydy kandydujące, ponieważ rząd pul peptydowych zawierających te peptydy również wykazuje wyniki dodatnie.

PBMC rozszerzone pulami peptydowymi Core07, 08, 09 i 10 służą do identyfikacji epitopów tych peptydów. Podobnie Core09 ma najwyższy wskaźnik odpowiedzi w rzędowych pulach peptydowych. Wszystkie peptydy w tej puli są ustawione jako peptydy kandydujące, a PBMC rozszerzone o pule peptydowe: Core01, 02, 03, 04, 05 i 06 są używane do identyfikacji epitopów tych peptydów.

W przypadku PBMC rozszerzonych na pulę peptydową Core08, po stymulacji peptydem C31 do 45 pulsacyjnych BLCL, częstości komórek T CD4 wydzielających TNF alfa i interferon gamma są dwa razy wyższe niż w kontrolach tła. Tak więc peptyd C31 do 45 jest zweryfikowanym epitopem komórek T CD4 ograniczonym przez HLAD. To właśnie tam, po identyfikacji epitopów, pozostały dodatkowe rozszerzone PBMC.

Dokładne oznaczanie zidentyfikowanych epitopów można wykonać za pomocą panelu skróconych peptydów.