Name: Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i identyfikacja epitopów komórek T CD4 ograniczonych do HLA-DR na podstawie matrycy peptydowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj metodę oceny odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i identyfikacji epitopów komórek T CD4 ograniczonych do HLA-DR przy użyciu matrycy peptydowej. Technika ta umożliwia badaczom szczegółową analizę immunologiczną zakażenia przewlekłego HBV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) oraz Chinese Key 
Projekt Specjalizacja w chorobach zakaźnych (2018ZX10723203).

Od każdego pacjenta włączonego do badania uzyskano pisemną świadomą zgodę. Protokół badania jest zgodny z wytycznymi etycznymi Deklaracji Helsińskiej z 1975 roku, co potwierdza uprzednia zgoda komisji etyki medycznej Southwest Hospital.
1. Projekt macierzy peptydowej pochodzącej z HBV
<ol>
	<li>Pobrać sekwencje aminokwasowe antygenu rdzeniowego HBV z baz danych NCBI (GenBank: AFY98989.1).</li>
	<li>Zakupić peptydy pochodne od antygenu rdzeniowego HBV (panel 35 peptydów 15-merowych z zakładką 10 reszt, czystość &gt; 90%, 4 mg/peptyd) od dostawcy usług syntezy peptydów.</li>
	<li>Przygotować kwadratową macierz peptydową 6×6, w której każda pozycja zawiera tylko 1 peptyd. Utworzyć 12 pul peptydowych: 6 pul wierszowych i 6 pul kolumnowych, po 5-6 peptydów w każdej puli16. Pule peptydowe wierszowe i kolumnowe w macierzy reprezentują 2 oddzielne formacje antygenu rdzeniowego HBV.</li>
	<li>Dla 3/4 zakupionych peptydów wymieszać peptydy znajdujące się w tym samym wierszu/kolumnie macierzy, tworząc 12 oddzielnych pul peptydowych poprzez ich wspólne rozpuszczenie w dimetylosulfotlenku (DMSO) (2 µg/µL dla każdego peptydu). Przechowywać w temperaturze -80 °C do analizy odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.</li>
	<li>Pozostałe peptydy rozpuścić oddzielnie (10 µg/µL) i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu identyfikacji epitopów.</li>
</ol>
2. Izolacja mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC)
<ol>
	<li>Pobrać 5 mL krwi żylnej od pacjentów z przewlekłym zakażeniem HBV. 
	UWAGA: Objętość krwi należy oszacować w przybliżeniu na podstawie liczby pul peptydowych plus 1 kontrola tła i 1 kontrola dodatnia. Analiza 1 puli peptydowej wymaga 3 x 105 PBMC. Średnio z 1 mL krwi można uzyskać 1 x 106 PBMC.</li>
	<li>Wyizolować PBMC z krwi, wykorzystując wirowanie w gradiencie gęstości Ficoll (800 × g, 20 min), a następnie kriokonserwować wyizolowane PBMC w ciekłym azocie do późniejszego użycia.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura zebrać granulocyty znajdujące się pomiędzy przezroczystą warstwą Ficoll a warstwą erytrocytów. Wyekstrahować genomowe DNA z granulocytów, używając zestawu do oczyszczania genomowego DNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Przekazać próbkę DNA do dostawców usług genotypowania w celu określenia genotypu HLA-DRB1.</li>
</ol>
3. Ekspansja PBMC in vitro z wykorzystaniem macierzy peptydowej HBV
<ol>
	<li>Rozmrozić PBMC.
	<ol>
		<li>Podgrzać RPMI 1640 uzupełnione benzonazą w stosunku 1:10 000 (25 U/mL) do 37 °C w kąpieli wodnej. 
		UWAGA: Benzonaza pomaga ograniczyć agregację komórek podczas rozmrażania. Każda próbka wymaga 20 mL RPMI 1640 z benzonazą. Obliczyć ilość potrzebną do rozmrożenia wszystkich próbek i przygotować oddzielną alikwot pożywki (37 °C) z benzonazą w stosunku 1:10 000 (25 U/mL). Rozmrażać nie więcej niż 5 próbek jednocześnie.</li>
		<li>Wyjąć próbki z ciekłego azotu i szybko rozmrozić zamrożone fiolki w kąpieli wodnej (37 °C).</li>
		<li>Przenieść rozmrożoną zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej 15 mL. Do probówki dodawać pokroplowo 1 mL RPMI 1640 z benzonazą (37 °C). Powoli dodać 6 mL RPMI 1640 z benzonazą (37 °C) do probówki wirówkowej, a następnie wypłukać kriofiolkę kolejnymi 2 mL RPMI 1640 z benzonazą (37 °C), aby odzyskać wszystkie komórki. Postąpić tak samo z pozostałymi próbkami tak szybko, jak to możliwe. 
		​UWAGA: Powolne rozcieńczanie próbek kriokonserwowanych jest kluczowe dla zachowania żywotności rozmrożonych komórek.</li>
		<li>Odwirować (400 × g, 10 min), usunąć nadsącz i rozbić osad poprzez opukiwanie probówki.</li>
		<li>Delikatnie resuspendować osad w 1 mL ciepłego RPMI 1640 z benzonazą. Delikatnie wymieszać i w razie potrzeby przefiltrować komórki przez sito komórkowe 70 µm (np. w przypadku obecności widocznych skupisk).</li>
		<li>Pobrać alikwot 10 µL zawiesiny i rozcieńczyć w soli fosforanowej w PBS Dulbecco (DPBS), dodać błękit trypanu (0,04%), nanieść na hemocytometr, odczekać 1 min i zliczyć liczbę żywych komórek (komórki przejaśnione).</li>
		<li>Dodać 9 mL RPMI 1640 z benzonazą (37 °C) do probówki, odwirować (400 × g, 10 min), usunąć nadsącz i rozbić osad poprzez opukiwanie probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Resuspendować PBMC w RPMI 1640 uzupełnionym o 25 mM HEPES, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny oraz 10% ludzkiej surowicy AB (pełna pożywka hodowlana). Dostosować gęstość komórek do 1,5 x 106 komórek/mL. Wysiać PBMC na płytki 96-dołkowe (płaskie dno) w gęstości 3 x 105 komórek/dołek.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać pulle peptydów pochodnych HBV (2 μg/mL dla każdego pojedynczego peptydu). Do dołków kontroli tła i kontroli dodatniej dodać taką samą ilość rozpuszczalnika (DMSO, 1 μL/mL). Dodać 10 U/mL IL-2 oraz 10 ng/mL IL-7. Inkubować w 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>W 3. dniu uzupełnić pożywkę hodowlaną o 50 U/mL IL-2 i 10 ng/mL IL-7. 
	UWAGA: Od 1. do 3. dnia nie będzie zaobserwowano wyraźnej proliferacji limfocytów T. Całkowita liczba komórek zazwyczaj zmniejszy się o 1/3 do 1/2 z powodu śmierci komórek innych niż limfocyty T, takich jak limfocyty B, komórki NK, komórki NKT i monocyty.</li>
	<li>W 7. dniu wymienić połowę pożywki hodowlanej na świeżą pożywkę zawierającą peptydy (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) i IL-7 (20 ng/mL). 
	UWAGA: Aby uniknąć naruszenia komórek osiadłych na dnie, ostrożnie pobrać pipetą około 90 μL pożywki hodowlanej z górnej warstwy. Od 3. do 7. dnia zaobserwuje się intensywną proliferację limfocytów T, a proliferujące limfocyty T zazwyczaj agregują, tworząc klastry.</li>
	<li>W 10. dniu delikatnie pipetować hodowlę komórkową w każdym dołku 7–9 razy, aby rozbić klastry komórkowe, zliczyć liczbę żywych komórek i przenieść 2×105 komórek z każdego dołka na płytkę 96-dołkową (okrągłe dno) w celu analizy odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.</li>
	<li>Kontynuować hodowlę pozostałych komórek w celu identyfikacji epitopów w 12. dniu, dostosować objętość pożywki hodowlanej do 100 μL (usuwając nadmiar pożywki) i uzupełnić hodowlę o 100 μL świeżej pełnej pożywki hodowlanej zawierającej peptydy (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) i IL-7 (20 ng/mL). 
	UWAGA: Od 7. do 10. dnia limfocyty T nadal intensywnie proliferują. Jeśli pożywka zmieni kolor na żółty, wymienić pożywkę hodowlaną zgodnie z instrukcją w kroku 3.5. Zazwyczaj w 10. dniu liczba komórek przekroczy 6×105. Każdy dołek zazwyczaj wykazuje podobną liczbę komórek; należy zliczyć komórki w 3 dołkach i użyć wartości średniej jako szacunku liczby komórek dla wszystkich dołków.</li>
</ol>
4. Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV za pomocą cytometrii przepływowej z barwieniem wewnątrzkomórkowym
<ol>
	<li>Stymulowanie PBMCs pulami peptydów
	<ol>
		<li>W przypadku komórek przeniesionych na płytkę 96-dołkową (do dna okrągłego), przemyć je 3 razy w płytce (550 × g, 3 min). Do każdego płukania użyć 200 µL medium (RPMI 1640 przez pierwsze 2 płukania, pełne medium hodowlane przy ostatnim płukaniu). Usunąć nadsączniki. 
		UWAGA: Usunięcie resztkowych cytokin z hodowli poprzez wielokrotne płukanie może skutecznie zmniejszyć tło w analizie cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowej.</li>
		<li>Do każdego dołka z komórkami stymulowanymi konkretną pulą peptydów dodać 200 µL pełnego medium hodowlanego uzupełnionego o te same pule peptydów (2 µg/mL dla każdego pojedynczego peptydy). Do dołka kontroli tła dodać pełne medium hodowlane uzupełnione o 1 µL/mL DMSO. Do dołka kontroli pozytywnej dodać pełne medium hodowlane uzupełnione o 1 µL/mL DMSO, 150 ng/mL octanu forbolu 12-mirystynianu 13-octanu (PMA) oraz 1 µmol/L jonomycyny. 
		​UWAGA: Wysoka dawka DMSO zablokuje wydzielanie cytokin przez limfocyty T (najbardziej znacząco dla TNF-α). Nie zaleca się stosowania dawki DMSO wyższej niż 5 µL/mL. Generalnie dawka DMSO w naszym eksperymencie nie przekracza 1 µL/mL.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 6 h.</li>
		<li>Po 1 h inkubacji dodać do hodowli monensynę (1,37 µg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytometria przepływowa
	<ol>
		<li>Po 6 h inkubacji usunąć nadsącznik po wirowaniu (550 × g, 3 min), przemyć komórki raz 200 µL DPBS (550 × g, 3 min), a następnie barwić markery powierzchniowe (CD3, CD4 i CD8) oraz marker żywotności (używając Fixable Viability Dye) w lodówce w temperaturze 4 °C przez 30 min.</li>
		<li>Przemyć raz 200 µL DPBS (550 × g, 3 min). Utrwalić i permeabilizować komórki, a następnie barwić wewnątrzkomórkowe cytokiny (TNF-α i IFN-γ) w lodówce w temperaturze 4 °C przez 45 min.</li>
		<li>Po ostatnim płukaniu podczas barwienia wewnątrzkomórkowego resuspendować komórki w 150 µL buforu do cytometrii przepływowej (DPBS + 0,5% BSA).</li>
		<li>Nabrać dane cytometrii przepływowej na cytometrze przepływowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wyników cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Definicja dołka pozytywnego: uznać dołek za pozytywny, jeśli częstotliwość występowania limfocytów T wydzielających cytokiny jest co najmniej dwukrotnie wyższa niż w dołku kontroli tła (Rycina 1).</li>
		<li>Zgodnie z poniższym wzorem obliczyć odsetek odpowiedzi dla każdej analizowanej cytokiny (Rycina 2): 
		<img alt="Równanie odsetka odpowiedzi: Σ(częstość komórek wydzielających cytokiny w dołku pozytywnym - tło)/2." src="/files/ftp_upload/62387/62387eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
		UWAGA: Pula peptydów w wierszu i pule peptydów w kolumnie w macierzy reprezentują 2 odrębne formacje antygenu rdzenia HBV, zatem końcowy odsetek odpowiedzi należy podzielić przez 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Identyfikacja HBV-specyficznych epitopów limfocytów T CD4 ograniczonych przez HLA-DR
<ol>
	<li>Rozmrażanie i hodowla allogenicznych linii limfoblastoidalnych komórek B (BLCL) w kolbach T-75 (5-20 ×106 komórki, 20 mL pełnej pożywki hodowlanej). 
	UWAGA: Aby zagwarantować dobrą kondycję BLCL, etap ten należy rozpocząć na 2 tygodnie przed rozmrożeniem PBMC pacjentów. BLCL muszą być homozygotyczne pod względem allelu HLA-DRB1. Zgodnie z wynikiem genotypowania, pacjenci powinni posiadać ten sam allel HLA-DRB1 co BLCL.</li>
	<li>Przesiewowe badanie peptydów kandydackich w celu identyfikacji (Rysunek 3)
	<ol>
		<li>Na podstawie wyników odpowiedzi limfocytów T w 10. dniu, należy wyselekcjonować 2 pule peptydów o najwyższym wskaźniku odpowiedzi (jedną pulę peptydów w rzędzie i jedną pulę peptydów w kolumnie).</li>
		<li>Uznaj peptyd w tych 2 pulach za peptyd kandydujący, jeśli inna pula peptydów zawierająca ten peptyd również wykazuje pozytywny wynik w analizie odpowiedzi limfocytów T. Do późniejszej identyfikacji epitopów wykorzystaj PBMC wyekspandowane z drugą pulą peptydów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Impulsowanie BLCL peptydem
	<ol>
		<li>W 12. dniu należy policzyć liczbę żywych linii komórkowych BLCL, przenieść komórki do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml, odwirować (350 × g, 10 min) i usunąć nadsącz. Osad komórkowy należy resuspender w pełnym medium hodowlanym, a następnie nanieść BLCL do płytki 96-dołkowej (z dnem okrągłym) w stężeniu 4×104 komórek/dołek w 80 µL pełna pożywka hodowlana.</li>
		<li>Dodaj pojedynczy peptyd (10 µg/mL), inkubować w 37 °C oraz 5% CO22 przez 2 h. Przygotowano dwie kontrole tła: inkubację z peptydem przy jednoczesnym blokowaniu HLA-DR (wcześniejsza inkubacja z przeciwciałem anty-HLA-DR (10 µg/mL) przez 1 h); DMSO (1 µL/mL) pulsacji. Końcowa objętość pełnej pożywki hodowlanej w każdej studzience wynosi 100 µL.</li>
		<li>Dodaj mitycomycynę C (100 µg/mL), inkubować przy 37 °C oraz 5% CO22 przez 1 h.</li>
		<li>Przemyć 3 razy za pomocą 200 µL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) w płytce w celu usunięcia nieprzyłączonego peptydy i mitomycyny C. Podczas pierwszego przemywania uzupełnić kulturę inkubacyjną o 100 µL pożywki RPMI 1640.</li>
		<li>Resuspendować komórki w 120 µL pełnej pożywki hodowlanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stymulowanie PBMC za pomocą BLCL obciążonych peptydami.
	<ol>
		<li>W 12. dniu przenieść PBMC do płytki 96-dołkowej (o okrągłym dnie).</li>
		<li>Usunąć supernatant po wirowaniu (550 × g, 3 min) w płytce, a następnie dwukrotnie przemyć za pomocą 200 µL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) na płytce. 
		UWAGA: Usunięcie resztkowych cytokin i peptydów z hodowli poprzez wielokrotne przemywanie jest kluczowym etapem zmniejszania tła w analizie cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowej. W szczególności resztkowe peptydy będą wiązać się z liniami BLCL, co znacząco zwiększy tło.</li>
		<li>Resuspender PBMC w każdej studzience w 210 µL pełnej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Dla studzienki z PBMC wybranej do identyfikacji epitopów, wymieszać alykwot (70 µL (każda) z liniami komórkowymi BLCL stymulowanymi peptydem (3 studzienki, w tym 2 kontrole tła). 
		UWAGA: W 12. dniu liczba PBMC po ekspansji w pulach peptydowych zazwyczaj osiąga wartość powyżej 5-7×10^6.5 na studzienkę, tak aby stosunek PBMC do BLCL wynosił od około 6:1 do 4:1.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 przez 6 h.</li>
		<li>Po 1 h inkubacji dodać monensynę (1.37 µg/mL) do hodowli. Końcowa objętość pełnej pożywki w każdej studzience wynosi 200 µL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytometria przepływowa
	<ol>
		<li>Powtórz czynności opisane w kroku 4.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wyników cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Potwierdź, czy peptyd jest epitopem komórek T CD4 z ograniczeniem do HLA-DR, jeżeli PBMC inkubowane z tym peptydem w obecności impulsowanych nim komórek BLCL wykazują częstotliwość wydzielających cytokiny komórek T CD4 co najmniej dwukrotnie wyższą niż w przypadku PBMC inkubowanych z kontrolami tła (impulsowanie peptydem przy wcześniejszym blokowaniu HLA-DR; impulsowanie DMSO).Rycina 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+T-cell+epitopes+in+hepatitis+B+virus%3A+identification%2C+genotypic+variation+and+relevance+to+antiviral+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Therapy%22%5BJournal%5D)">A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics.</a> Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).</li>
<li>Mizukoshi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immune+responses+to+the+hepatitis+B+virus+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase.</a> Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).</li>
<li>Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+CD137+to+study+the+full+repertoire+of+CD8%2B+T+cells+without+the+need+to+know+epitope+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities.</a> Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).</li>
<li>Reiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+activation+induced+marker+%28AIM%29+assays+for+sensitive+identification+of+antigen-specific+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells.</a> PLoS One. 12, 0186998(2017).</li>
<li>Herati, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successive+annual+influenza+vaccination+induces+a+recurrent+oligoclonotypic+memory+response+in+circulating+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells.</a> Science Immunology. 2, (2017).</li>
<li>Bowyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+Markers+Detect+Vaccine-Specific+CD4%2B+T+Cell+Responses+Not+Measured+by+Assays+Conventionally+Used+in+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials.</a> Vaccines. 6, (2018).</li>
<li>Morou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+differentiation+is+central+to+HIV-specific+CD4%28%2B%29+T+cell+dysfunction+in+progressive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease.</a> Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).</li>
<li>Grifoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targets+of+T+Cell+Responses+to+SARS-CoV-2+Coronavirus+in+Humans+with+COVID-19+Disease+and+Unexposed+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals.</a> Cell. 181, 1489-1501 (2020).</li>
<li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalance+of+Regulatory+and+Cytotoxic+SARS-CoV-2-Reactive+CD4%2B+T+Cells+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19.</a> Cell. , (2020).</li>
<li>Boni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hepatitis+B+virus+%28HBV%29-specific+T-cell+dysfunction+in+chronic+HBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection.</a> Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).</li>
<li>Chang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+hepatitis+B+virus+%28HBV%29-specific+CD4%2B+T-cell+responses+in+human+immunodeficiency+virus+type+1-HBV-coinfected+individuals+receiving+HBV-active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy.</a> Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).</li>
<li>Boni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restored+Function+of+HBV-Specific+T+Cells+After+Long-term+Effective+Therapy+With+Nucleos%28t%29ide+Analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues.</a> Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).</li>
<li>Kennedy, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+T-cell+function+in+children+and+young+adults+with+immune-tolerant+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B.</a> Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).</li>
<li>de Niet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+T+cell+function+in+chronic+hepatitis+B+patients+upon+treatment+with+interferon+based+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy.</a> Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).</li>
<li>Rinker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus-specific+T+cell+responses+after+stopping+nucleos%28t%29ide+analogue+therapy+in+HBeAg-negative+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B.</a> Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1%2FIFN-%CE%B3+profile+of+HBV-specific+CD4+T+cells+is+associated+with+liver+damage+and+viral+clearance+in+chronic+HBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection.</a> Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).</li>
<li>Hoffmeister, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+T+cell+epitopes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping T cell epitopes by flow cytometry.</a> Methods. 29, 270-281 (2003).</li>
<li>Anthony, D. D., Lehmann, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+epitope+mapping+using+the+ELISPOT+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach.</a> Methods. 29, 260-269 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najbardziej krytyczne kroki w tym protokole są wymienione w następujący sposób: 1) wystarczająca liczba PBMC o wysokiej żywotności, aby rozpocząć ekspansję PBMC; 2) odpowiednie środowisko do rozbudowy PBMC; oraz 3) całkowite usunięcie resztkowych pul peptydowych w hodowli PBMC przed identyfikacją epitopów.
Cała analiza w tym protokole zależy od silnej proliferacji limfocytów T CD4. Ogólnie rzecz biorąc, liczba PBMC po 10-dniowej ekspansji będzie 2-3 razy większa od początkowej liczby. Liczba k...

Obecnie istnieją 3 główne podejścia do analizy limfocytów T specyficznych dla antygenu. Pierwsze podejście opiera się na interakcji między receptorem limfocytów T a peptydem (epitopem). Limfocyty T specyficzne dla antygenu mogą być bezpośrednio barwione multimerami peptydowego głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC). Zaletą tej metody jest to, że można uzyskać żywotne limfocyty T specyficzne dla antygenu, odpowiednie do dalszej analizy transkryptomicznej/metabolomicznej. Ograniczeniem tej metody jest to, że nie może ona dostarczyć informacji o całej odpowiedzi limfocytów T na określony antygen, ponieważ wymaga zwalidowanych peptydów epitopowych, podczas gdy liczba zidentyfikowanych epitopów dla określonego antygenu jest na razie ograniczona. W porównaniu z epitopami limfocytów T CD8 specyficznymi dla wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), zidentyfikowano mniej epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla wirusa HBV1,2, co sprawiło, że ta metoda jest obecnie mniej przydatna do analizy limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.
Drugie podejście opiera się na regulacji w górę szeregu markerów wywołanych aktywacją po stymulacji peptydów antygenowych3. Powszechnie używane markery to CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Metoda ta została teraz wykorzystana do analizy odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu u osób zaszczepionych5,6, pacjenci z ludzkim wirusem niedoboru odporności7, oraz pacjenci z zakażeniem koronawirusem zespołu ostrej niewydolności oddechowej 28,9. W przeciwieństwie do testu opartego na multimerach peptyd-MHC, metoda ta nie jest ograniczona zwalidowanymi epitopami i może uzyskać żywe komórki do dalszej analizy. Ograniczeniem tej metody jest to, że nie może ona dostarczyć informacji na temat profilu cytokin limfocytów T specyficznych dla antygenu. Ponadto ekspresja tych markerów indukowanych aktywacją przez niektóre aktywowane komórki niespecyficzne dla antygenu może przyczyniać się do sygnałów tła w analizie, co może stanowić problem, zwłaszcza gdy limfocyty T specyficzne dla docelowego antygenu są rzadkie. Obecnie zastosowanie tej metody w odniesieniu do limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV jest ograniczone4. To, czy ta metoda może być wykorzystana do wiarygodnej analizy limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV, wymaga dalszych badań.
Trzecie podejście opiera się na wydzielaniu cytokin po stymulacji peptydem antygenowym. Podobnie jak analiza oparta na markerach indukowanych aktywacją, metoda ta nie jest ograniczona zwalidowanymi epitopami. Metoda ta może bezpośrednio ujawnić profil cytokin limfocytów T specyficznych dla antygenu. Czułość tej metody jest niższa niż metody opartej na markerach indukowanych aktywacją, ponieważ opiera się ona na wydzielaniu cytokin przez limfocyty T specyficzne dla antygenu, a liczba badanych cytokin jest zwykle ograniczona. Obecnie metoda ta jest szeroko stosowana w analizie limfocytów T specyficznych dla HBV. Ponieważ limfocyty T specyficzne dla HBV wydzielające cytokiny są trudne do wykrycia przez bezpośrednią stymulację peptydami ex vivo10,11, profil cytokin limfocytów T specyficznych dla HBV jest zwykle analizowany po 10-dniowej ekspansji stymulowanej peptydem in vitro12,13,14,15,16. Układ pul peptydowych w formie matrycy został wykorzystany w celu ułatwienia identyfikacji epitopów specyficznych dla antygenu17,18. Dzięki połączeniu macierzy peptydowej i analizy wydzielania cytokin opracowano metodę oceny odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i jednoczesnej identyfikacji epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV16. W tym protokole opisano szczegóły tej metody. Antygen rdzeniowy HBV został wybrany jako przykład demonstracji w tym protokole.

<table><tbody><tr><td>Albumina bydlęca V (BSA)</td><td>Beyotime</td><td>ST023</td><td></td></tr><tr><td>sprzężona z APC anty-ludzka TNF-&alfa;</td><td>eBioscience</td><td>17-7349-82</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Ograniczenie zlepiania się komórek</td></tr><tr><td>linii komórkowych limfoblastoidów B (BLCL)</td><td>CENTRUM BADAŃ NAD RAKIEM FRED HUTCHINSON</td><td></td><td>IHW09126 HLA-DRB1*0803 homozygota</td></tr><tr><td>B linie komórkowe limfoblastoidów (BLCL)</td><td>FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER</td><td></td> IHW09121 <td>homozygota HLA-DRB1*1202</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych (T75)</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli komórkowych (96-dołkowa, z płaskim dnem)</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Płaska</td></tr><tr><td>płytka do hodowli komórkowej (96-dołkowa, z okrągłym dnem)</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Okrągłodenne</td></tr><tr><td>sitko do hodowli komórek</td><td>Corning</td><td>CLS431751</td><td>Wielkość porów 70&nbsp; &mu; m, biała, sterylna</td></tr><tr><td>probówka wirówkowa (15 ml)</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td>sterylna</td></tr><tr><td>probówka wirówkowa (50 ml)</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>sterylna</td></tr><tr><td>wirówka, chłodzona</td> wirówka <td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr>, chłodzona wirówka <tr><td></td><td>Thermo</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>, chłodzona</td><td>Thermo</td><td>Legend Micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Cytofix/Cytoperm (zestaw czynnika transkrypcyjnego)</td><td>BD Biosciences</td><td>562574</td><td>Przygotuj roztwór przed użyciem</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej, aby zapobiec krystalizacji</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna</td><td></td><td></td> buforowana fosforanami <td>Przygotuj ddH2O (1000 ml) zawierający NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg) i Na2HPO4,7H2O (2160&nbsp; mg). Dostosuj PH do 7.4. Sterylizować w autoklawie.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące (0,5-10)</td><td>Kirgen</td><td>KG5131</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>końcówki filtrujące (100-1000)</td><td>Kirgen</td><td>KG5333</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>końcówki filtrujące (1-200)</td><td>Kirgen</td><td>KG5233</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>anty-ludzki CD4 BioLegend 300506 sprzężony z FITC</td><td></td><td></td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Możliwy do naprawienia barwnik żywotności eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Inhibitor transportu białek GolgiStop (zawierający Monenzynę)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td>Inhibitor transportu białek</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Marka</td><td>718620</td><td></td></tr><tr><td>Peptydy rdzeniowe HBV pochodzące z antygenu</td><td>ChinyPeptydy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Ludzka surowica AB</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-51</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100395-0500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100781-0500</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Cytometr przepływowy</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>probówka do mikrowirówek (1,5 ml)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td>Autoklawizowana sterylizacja przed użyciem</td></tr><tr><td>Wytrząsarki do mikropłytek</td><td>Scientific Industries</td><td>MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100348-0500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241-0500</td><td></td></tr><tr><td>Probówki PCR (0,2 ml)</td><td>Kirgen</td><td>KG2331</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-sprzężony anty-ludzki CD8</td><td>BioLegend</td><td>300914</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Anty-ludzkim IFN-&gamma sprzężonym z PE;</td><td>eBioscience</td><td>12-7319-42</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5-sprzężony anty-ludzki CD3</td><td>eBioscience</td><td>45-0037-42</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octan forbolu (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Pirogonian sodu, 100mM</td><td>Gibco</td><td>15360070</td><td></td></tr><tr><td>Trypanowa niebieska plama (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Oczyszczony anty-ludzki HLA-DR</td><td>BioLegend</td><td>307648</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Zestaw oczyszczający</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza odpowiedzi limfocytów t cd4 specyficznych dla hbv i identyfikacja epitopów komórek t cd4 ograniczonych do hla-dr na podstawie matrycy peptydowej

Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix

Limfocyty T CD4 odgrywają ważną rolę w patogenezie przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu B. Jako wszechstronna populacja komórek, limfocyty T CD4 zostały sklasyfikowane jako odrębne podzbiory funkcjonalne w oparciu o wydzielane przez nie cytokiny: na przykład IFN-γ dla komórek pomocniczych 1 CD4 T, IL-4 i IL-13 dla komórek pomocniczych T CD4, IL-21 dla pęcherzykowych komórek pomocniczych T CD4 i IL-17 dla komórek pomocniczych T CD4. Analiza limfocytów T CD4 specyficznych dla wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) na podstawie wydzielania cytokin po stymulacji peptydami pochodzącymi z HBV może dostarczyć informacji nie tylko na temat wielkości odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV, ale także na temat funkcjonalnych podzbiorów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV. Nowatorskie podejścia, takie jak transkryptomika i analiza metabolomiczna, mogą dostarczyć bardziej szczegółowych informacji funkcjonalnych na temat limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV. Podejścia te zwykle wymagają izolacji żywotnych limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV w oparciu o multimery peptydowo-durowego kompleksu zgodności tkankowej II, podczas gdy obecnie informacje o epitopach limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV są ograniczone. W oparciu o matrycę peptydową pochodzącą z HBV opracowano metodę oceny odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i jednoczesnej identyfikacji epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV przy użyciu próbek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od pacjentów z przewlekłym zakażeniem HBV.

Częstość występowania wydzielających cytokiny limfocytów T CD4 oblicza się jako sumę producentów pojedynczych oraz podwójnych cytokin. Jak pokazano na Rysunku 1, częstość występowania wydzielających TNF-α limfocytów T CD4 oraz częstość występowania wydzielających IFN-γ limfocytów T CD4 w kontroli tła (DMSO) wynosi odpowiednio 0,154% i 0,013%. Częstość występowania wydzielających TNF-α limfocytów T CD4 oraz częstość występowania wydzielających IFN-γ limfocytów T CD4 swoistych dla puli peptydó...

Na podstawie matrycy peptydowej pochodzącej z wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficzne dla HBV mogą być oceniane równolegle z identyfikacją epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.

Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i identyfikacja epitopów komórek T CD4 ograniczonych do HLA-DR na podstawie matrycy peptydowej

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct ...

W przewlekłym zakażeniu HBV limfocyty T CD4 odgrywają ważną rolę zarówno w klirensie wirusa, jak i w powrotach. Metoda ta pozwala nam ocenić odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i jednocześnie zidentyfikować epitopy limfocytów T CD4 specyficzne dla HBV. Procedurę zademonstruje Jianmei Xiao, asystent naukowy.I Xing Wan, technik z Bilao. Na początek wyizoluj jednojądrzaste komórki krwi obwodowej lub PBMC z krwi, stosując wirowanie w gradiencie gęstości Ficoll w temperaturze 800 razy G przez 20 minut. Następnie zbierz granulocyty między warstwą czerwonych krwinek a warstwą czerwonych krwinek za pomocą pipety Pasteura.Przenieś rozmrożoną zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej, dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanej benzonazy RPMI 1640, kropli, a następnie powoli dodaj kolejne sześć mililitrów. Przepłucz fiolkę kriogeniczną dwoma mililitrami benzonazy RPMI 1640, aby odzyskać pozostałe komórki. Następnie odwirować probówkę o temperaturze 400 razy G przez 10 minut.Usunąć supernatant i poluzować osad, stukając w rurkę. Delikatnie ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze ciepłego Bensenase NACE RPMI 1640. Delikatnie wymieszaj komórki i przefiltruj je przez sitko o średnicy 70 mikrometrów, jeśli widoczne są jakieś grudki komórek.Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Ponownie zawiesić PBMC i kompletną pożywkę hodowlaną, zawierającą 10 jednostek na mililitr IL2 i 10 nanogramów na mililitr IL7. Dostosuj gęstość komórek do 1,5x10 do 6 komórek na mililitr.Następnie umieść komórki w 96-dołkowych płytkach z płaskim dnem o gęstości 3x10 do piątych komórek na studzienkę. Dodaj wirusa zapalenia wątroby typu B lub pule peptydów pochodzących z HBV do każdej studzienki. W przypadku studzienek tła i kontroli pozytywnej dodać taką samą ilość rozpuszczalnika.Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Trzeciego dnia uzupełnij pożywkę hodowlaną o 50 jednostek na mililitr IL2 i 10 nanogramów na mililitr IL7. Siódmego dnia zastąp połowę pożywki hodowlanej świeżą pożywką zawierającą: cztery mikrogramy na mililitr peptydów, 100 jednostek na mililitr IL2 i 20 nanogramów na mililitr IL7.W dniu 10 delikatnie pipetuj komórki w każdym dołku siedem do dziewięciu razy, aby zdezagregować klastry komórek. Policz liczbę żywotnych komórek i przenieś 2x10 do piątych komórek do każdej studzienki 96-dołkowej okrągłej płytki dolnej w celu analizy odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HPV. W przypadku pozostałych komórek w 96-dołkowej płaskiej płytce dennej należy dostosować objętość pożywki hodowlanej do 100 mikrolitrów, odrzucając nadmierną pożywkę.Następnie uzupełnij kulturę 100 mikrolitrami świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej, zawierającej: cztery mikrogramy na mililitr peptydów, 100 jednostek na mililitr IL2 i 20 nanogramów na mililitr IL7. Kontynuuj hodowlę komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w celu identyfikacji epitopów w 12 dniu. Umyj komórki w 96-dołkowej okrągłej płytce dennej, dodając 200 mikrolitrów RPMI 1640, odwirowując płytkę przy 550 razy G przez trzy minuty i odrzucając supernatant.Powtórz pranie dwukrotnie, używając kompletnej pożywki hodowlanej do ostatniego prania. Do każdej studzienki komórek stymulowanych określoną pulą peptydową dodać 200 mikrolitrów kompletnej pożywki hodowlanej uzupełnionej tą samą pulą peptydową. Do studzienki kontrolnej tła dodać kompletną pożywkę hodowlaną, uzupełnioną jednym mikrolitrem na mililitr DMSO.Do studzienki kontroli pozytywnej dodać kompletną pożywkę hodowlaną uzupełnioną jednym mikrolitrem na mililitr DMSO, 150 nanogramami na mililitr PMA i jednym mikromolem na litr jonomycyny. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez sześć godzin. Po godzinie inkubacji dodać do kultury 1,37 mikrograma na mililitr monenzyny.Po zakończeniu sześciogodzinnej inkubacji odwirować płytkę o stężeniu 550 razy G przez trzy minuty. Usunąć supernatant i przemyć komórki raz 200 mikrolitrami DPP, jak pokazano wcześniej. Bejca do markerów powierzchniowych CD3, CD4 i CD8 oraz marker żywotności.Po zawieszeniu komórek za pomocą wibratora, następnie wstaw płytkę do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Po jednokrotnym umyciu płytki 200 mikrolitrami DPBS, utrwal i przepuszczaln komórki, wybarwić cytokin wewnątrzkomórkowych, TNF alfa i interferon-gamma i wstaw płytkę do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 minut. Ponownie umyj komórki i ponownie zawieś je w 150 mikrolitrach buforu cytometrii przepływowej.Następnie uzyskaj dane cytometrii przepływowej za pomocą cytometru przepływowego. Utrzymuj alergiczne linie komórkowe limfoblastoidów B lub BLCL w kolbie T-75. W 12 dniu ekspansji PBMC policz liczbę żywotnych BLCL i przenieś je do 15-mililitrowych probówek wirówkowych.Odwirować komórki w temperaturze 350 razy G przez 10 minut i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy i kompletną pożywkę hodowlaną. Następnie porcjować BLCL na 96-dołkową okrągłą płytkę dolną w proporcji 4x10 do czwartej komórki na studzienkę i 80 mikrolitrów kompletnej pożywki hodowlanej.Dodaj 10 mikrogramów na mililitr pojedynczego peptydu i ustaw dwie kontrole w tle. Peptyd pulsujący z blokowaniem HLADR i pulsujący DMSO. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny.Dodać 100 mikrogramów na mililitr mitomycyny C i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez godzinę. Umyj płytkę trzykrotnie 200 mikrolitrami RPMI 1640 w celu usunięcia niepulsacyjnego peptydu i mitomycyny C, a następnie ponownie zawiesić komórki w 120 mikrolitrach kompletnej pożywki hodowlanej za pomocą wibratora. W 12 dniu ekspansji PBMC przenieś PBMC na 96-dołkową okrągłą płytę denną.Odwirować komórki na płytce, usunąć supernatant i umyć je dwukrotnie 200 mikrolitrami RPMI 1640, jak pokazano wcześniej. Ponownie zawiesić PBMC w każdym dołku z 210 mikrolitrami kompletnej pożywki hodowlanej. W przypadku studzienek PBMC wybranych do identyfikacji epitopów, należy podać 70 mikrolitrów zawiesiny komórek i wymieszać z pulsacyjnymi peptydowymi BLCL w trzech dołkach, w tym w dwóch kontrolach tła.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez sześć godzin. Po godzinie inkubacji dodać 1,37 mikrograma na mililitr monenzyny do kultury i doprowadzić końcową objętość w każdym dołku do 200 mikrolitrów za pomocą kompletnej pożywki hodowlanej. W tym reprezentatywnym przykładzie odpowiedzi limfocytów T CD4 wydzielających TNF alfa i interferon-gamma dla puli peptydowej Core11 są niższe niż dwa razy wartości tła, stąd uważane za ujemne.Tymczasem odpowiedzi na pulę peptydową Core09 są ponad dwukrotnie wyższe niż tło i uważane za pozytywne. Szare tło wskazuje, że studzienki z dodatnią odpowiedzią limfocytów T CD4 i peptydy kandydujące do identyfikacji epitopów są oznaczone na czerwono, Core01 ma najwyższy wskaźnik odpowiedzi, sądząc zarówno po komórkach CD4T wydzielających TNF alfa, jak i interferon-gamma w pulach peptydów kolumnowych. Peptydy C1 do 15, C31 do 45, C61 do 75 i C91 do 105 w tej puli peptydów są ustawione jako peptydy kandydujące, ponieważ rząd pul peptydowych zawierających te peptydy również wykazuje wyniki dodatnie.PBMC rozszerzone pulami peptydowymi Core07, 08, 09 i 10 służą do identyfikacji epitopów tych peptydów. Podobnie Core09 ma najwyższy wskaźnik odpowiedzi w rzędowych pulach peptydowych. Wszystkie peptydy w tej puli są ustawione jako peptydy kandydujące, a PBMC rozszerzone o pule peptydowe: Core01, 02, 03, 04, 05 i 06 są używane do identyfikacji epitopów tych peptydów.W przypadku PBMC rozszerzonych na pulę peptydową Core08, po stymulacji peptydem C31 do 45 pulsacyjnych BLCL, częstości komórek T CD4 wydzielających TNF alfa i interferon gamma są dwa razy wyższe niż w kontrolach tła. Tak więc peptyd C31 do 45 jest zweryfikowanym epitopem komórek T CD4 ograniczonym przez HLAD. To właśnie tam, po identyfikacji epitopów, pozostały dodatkowe rozszerzone PBMC.Dokładne oznaczanie zidentyfikowanych epitopów można wykonać za pomocą panelu skróconych peptydów.

analysis-hbv-specific-cd4-t-cell-responses-identification-hla-dr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza procedura demonstruje oczyszczanie i ekspansję in vitro antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z pełnej krwi obwodowej oraz ich wizualizację przy użyciu tetramerów MHC klasy II. Tetramery umożliwiają bezpośrednią wizualizację limfocytów T o pojedynczej swoistości antygenowej i określonym ograniczeniu MHC klasy II.<br...

Wizualizacja antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem tetramerów MHC klasy II

Charakterystyka epitopów limfocytów T patogenów wywołujących infekcje miejscowe, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego, stanowi wyzwanie ze względu na ograniczoną liczbę krążących limfocytów T. Opisano metodę, w której rzadkie limfocyty T zostały wyizolowane i scharakteryzowane, zaczynając od bardzo małej liczby komórek.

Wykorzystanie testu Enzyme-linked Immunospot (ELISpot) dla interferonu $\gamma$ do charakterystyki nowych epitopów limfocytów T wirusa papilomawirusa ludzkiego

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie tetramerów peptyd:MHC oraz magnetycznych mikrokulek do izolacji populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu o niskiej częstotliwości oraz ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia bezpośrednie badanie endogennych populacji limfocytów T w systemach eksperymentalnych in vivo.

Wzbogacanie limfocytów T swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-MHC

Film demonstruje test z wykorzystaniem ludzkich komórek macierzystych CD8+ pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w celu zahamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy. Te limfocyty T, zmodyfikowane za pomocą receptorów specyficznych dla HBV, są przenoszone do myszy transgenicznych. Kompetentne replikacyjnie plazmidy genomu HBV są następnie wstrzykiwane bezpośrednio do wątroby, umożliwiając wychwyt DNA wirusa. Gdy antygeny wirusowe ulegną...

Hamowanie replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B za pomocą limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego

Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projektowanie epitopów immunogennych. Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do płytek 384-dołkowych. Ten opłacalny format powinien okazać się przydatny w dziedzinie deimmunizacji białek oraz projektowania i opracowywania szczepionek.

Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

Nienaruszone kompleksy HLA/peptydowe klasy I są wydalane przez komórki rakowe, co stanowi potencjalnie istotny biomarker raka. Wykorzystując technologię czujników bezznacznikowych i przeciwciała monoklonalne naśladujące receptor limfocytów T, demonstrowano wykrywanie wydalanych kompleksów MIF/HLA-A*02:01 w supernatantach komórkowych MDA-MB-231, wzbogaconej surowicy ludzkiej i osoczu pacjenta, co umożliwiło opracowanie nowej platformy diagnostycznej raka.

Wykrywanie biomarkerów ludzkiego antygenu leukocytów w raku piersi z wykorzystaniem technologii biosensorów bez znaczników

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do liczenia i charakteryzowania limfocytów T CD8+ makaków rezusów przeciwko wirusowi AIDS. Ten artykuł jest przydatny nie tylko w dziedzinie immunologii HIV, ale także w innych obszarach badań biomedycznych, w których wiadomo, że odpowiedzi limfocytów T CD8 + wpływają na wynik choroby.

Analiza limfocytów T CD8 + specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności u makaków rezusów za pomocą barwienia tetramerem peptydowo-MHC-I

Niezgodności w sekwencjach ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) między parami dawców i biorców narządów są główną przyczyną odrzucenia przeszczepu narządów za pośrednictwem przeciwciał. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie niestandardowych macierzy antygenowych, które są oparte na sekwencjach HLA poszczególnych dawców, do badania alloprzeciwciał HLA przeciwko dawcom u biorców narządów.

Spersonalizowane macierze peptydowe do wykrywania alloprzeciwciał HLA w przeszczepach narządów

Ten protokół opisuje użycie jednołańcuchowych kompleksów MHC klasy I do badania interakcji molekularnych w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8+: generowanie zmodyfikowanych komórek prezentujących antygen wyrażających konstrukty jednołańcuchowe, hodowla klonu ludzkich komórek T CD8+ i eksperymenty z aktywacją limfocytów T.

Zastosowanie technologii jednołańcuchowej MHC do badania koagonizmu w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8 +

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania kompleksów peptydowych MHC klasy I i klasy II z linii komórkowych myszy i ludzi, dostarczając wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Protokół koncentruje się na przygotowaniu próbki przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał.

Immunopeptydomika: izolacja mysich i ludzkich peptydów związanych z MHC klasy I i II do analizy spektrometrii mas

Poznaj metodę oceny odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i identyfikacji epitopów komórek T CD4 ograniczonych do HLA-DR przy użyciu matrycy peptydowej. Technika ta umożliwia badaczom szczegółową analizę immunologiczną zakażenia przewlekłego HBV.

Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i identyfikacja epitopów komórek T CD4 ograniczonych do HLA-DR na podstawie matrycy peptydowej (Wideo) | JoVE Journal

Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i identyfikacja epitopów komórek T CD4 ograniczonych do HLA-DR na podstawie matrycy peptydowej

Przeglądaj więcej filmów