Name: Aseptyczne techniki laboratoryjne: metody galwanizacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min
Description: Poznaj aseptyczne techniki posiewu w mikrobiologii, w tym metody smugowe, zalewowe i powierzchniowe do izolacji bakterii i fagów. Te procedury umożliwiają badaczom uzyskanie czystych kultur mikroorganizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Specjalne podziękowania dla Cori Sanders z Iroc Designs za przygotowanie ilustracji oraz dla Krisa Reddiego i Bhairava Shaha z UCLA za przygotowanie próbek kultur i pomoc przy rysunkach. Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez HHMI (HHMI Grant No. 52006944).

<ol><li>Barker, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarker%2C+K+%22At+the+Bench%3A+A+Laboratory+Navigator%22">At the Bench: A Laboratory Navigator</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1998).</li>
<li>US Department of Health and Human Services (DHHS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+Microbiological+And+Biomedical+Laboratories+%28BMBL%29%22">Biosafety in Microbiological And Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5th, U.S. Government Printing Office. Washington DC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> (2009).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li>
<li>Fields, B. N., Knipe, D. M., Chanock, R. M., Hirsch, M. S., Melnick, J. L., Monath, T. P., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFields%2C+BN+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. 1, 2nd, Raven Press. New York, NY. (1991).</li>
<li>Gilbert, R. A., Ouwerkerk, D., Zhang, L. H., Klieve, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Research+Center+for+Beef+Genetic+Technologies.+In+vitro+detection+and+primary+cultivation+of+bacteria+producing+materials+inhibitory+to+ruminal+methanogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cooperative Research Center for Beef Genetic Technologies. In vitro detection and primary cultivation of bacteria producing materials inhibitory to ruminal methanogens.</a> Journal of Microbiological Methods. 80, 217-218 (2010).</li>
<li>Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+agar+plate+method+for+quantifying+viable+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria.</a> BioTechniques. 23, 648-650 (1997).</li>
<li>Karam, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaram%2C+JD+%22Molecular+Biology+of+Bacteriophage+T4%22">Molecular Biology of Bacteriophage T4</a>. , ASM Press. Washington, DC. (1994).</li>
<li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A., Roizman, B., Straus, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fundamental+Virology%22">Fundamental Virology</a>. , 4th, Lippincott, Williams, and Wilkins. Philadelphia, PA. (2001).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+JH+%22A+Short+Course+in+Bacterial+Genetics%3A+A+Laboratory+Manual+and+Handbook+for+Escherichia+coli+and+related+bacteria%22">A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and related bacteria</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1992).</li>
<li>Mills, K. V., Gareau, J. R., Garcia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+modification+to+the+Copacabana+method+for+spreading+transformation+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Low-cost modification to the Copacabana method for spreading transformation mixtures.</a> BioTechniques. 39, 188(2005).</li>
<li>Jordan, T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJordan%2C+T+%22RESEARCH%3A+National+Genomics+Research+Initiative+Phage+Resource+Laboratory+Manual%22">RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual</a>. , Howard Hughes Medical Institute. (2008).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning - A Laboratory Manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Sanders, E. R., Miller, J. H. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanders%2C+ER+%22Microbiologist%3A+A+Discovery-based+Course+in+Microbial+Ecology+and+Molecular+Evolution%22">Microbiologist: A Discovery-based Course in Microbial Ecology and Molecular Evolution</a>. , ASM Press. Washington, DC. (2010).</li>
<li>Slonczewski, J. L., Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSlonczewski%2C+JL+%22Microbiology+-+An+Evolving+Science%22">Microbiology - An Evolving Science</a>. , 2nd, W.W. Norton & Co., Inc. New York, NY. (2011).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+Red-Polysaccharide+Interactions+in+Enumeration+and+Characterization+of+Cellulolytic+Bacteria+from+the+Bovine+Rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of Congo Red-Polysaccharide Interactions in Enumeration and Characterization of Cellulolytic Bacteria from the Bovine Rumen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Wise, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWise%2C+K+%22Preparing+Spread+Plates+Protocols%22">Preparing Spread Plates Protocols</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.microbelibrary.org/index.php/component/resource/laboratory-test/3085-preparing-spread-plates-protocols">http://www.microbelibrary.org/index.php/component/resource/laboratory-test/3085-preparing-spread-plates-protocols</a> (2006).</li>
<li>Worthington, M., Luo, R. Q., Pelo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copacabana+method+for+spreading+E.+coli+and+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Copacabana method for spreading E. coli and yeast colonies.</a> BioTechniques. 30, 738-742 (2001).</li>
<li>American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/</a> (2012).</li>
<li>EPA Microbiology Home Page. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epa.gov/nerlcwww/index.html">http://www.epa.gov/nerlcwww/index.html</a> (2012).</li>
<li>The GENE Project: Laboratory Methods and Materials. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html">http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html</a> (2012).</li>
<li>Joint Genome Institute (JGI) Genome Sequencing Protocols: Library Plating Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html">http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html</a> (2012).</li>
<li>Microbial Genetics (maintained by Stanley Maloy at UCSD). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics">http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics</a> (2012).</li>
<li>Organization of American States (OAS) Department of Sustainable Development (DSD). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm">http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm</a> (2012).</li>
<li>Public Health Agency of Canada: Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss">http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss</a> (2012).</li>
<li>United States Environmental Protection Agency (EPA) Office of Water. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov">http://water.epa.gov</a> (2012).</li>
<li>American Society for Microbiology (ASM)'s Curriculum Recommendations Microbiology Majors Program. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html">http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html</a> (2012).</li>
<li>Introductory Course in Microbiology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html">http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html</a> (2012).</li>
</ol>

Nie mam nic do ujawnienia.

Hodowla mikroorganizmów obejmuje szereg metod posiewu, z których wszystkie wymagają zachowania techniki aseptyki podczas manipulacji komórkami i pożywkami. W protokole tym opisano pięć różnych procedur. Chociaż te techniki powlekania są rutynowo stosowane do manipulowania bakteriami i fagami, można je również stosować do hodowli komórek ssaków i mikroorganizmów eukariotycznych powszechnie stosowanych w genetyce molekularnej, takich jak drożdże (tj. Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe), glony i pierwotniaki (tj. Volvox, Chlamydomonas, Amoeba, Paramecium) oraz nicienie (tj. Caenorhabditis elegans). Istnieją również liczne (i jeszcze bardziej wyrafinowane) warianty każdej metody posiewu, w zależności od celu eksperymentalnego lub badanego organizmu. Dlatego ważne jest, aby nie tylko wybrać najbardziej odpowiednią technikę dla danego eksperymentu lub docelowego mikroorganizmu, ale także dostosować metodologię tak, aby wyniki eksperymentu odpowiednio odpowiadały na pytanie lub problem badawczy.
Niektóre z najnowszych zastosowań technik powlekania omówionych w tym protokole obejmują postęp technologiczny, który zapewnia wyniki o wysokiej przepustowości w badaniach przesiewowych i eksperymentach związanych z odkrywaniem leków. Na przykład centra sekwencjonowania genomu wykorzystują "metodę Copacabana" do rozprzestrzeniania bibliotek klonów, które są komórkami E. coli przekształconymi plazmidami zawierającymi fragmenty DNA pochodzące z genomu mikroorganizmu. Ponieważ jednorazowo przygotowywane są dziesiątki dużych płytek (zwanych tacami do testów biologicznych), do wytrząsania szklanych kulek dla całej partii tacek używa się automatycznej wytrząsarki do płytek. Ponadto, podczas selekcji kolonii z tych płytek po inkubacji, do zbierania komórek z odpowiednich kolonii jako inokulum dla bulionu LB w 384-dołkowych mikropłytkach używa się robotycznego zbieracza kolonii. W przypadku tego wysokoprzepustowego testu przesiewowego zastosowanie mają zasady proceduralne techniki płytki rozsiewającej, ale technologia pozwala na automatyzację i skalowanie różnych etapów, aby umożliwić jednoczesną analizę dużej liczby próbek w krótkim czasie.
Firmy biotechnologiczne i farmaceutyczne inwestują znaczne środki w rozwój wysokoprzepustowej technologii dla najbardziej podstawowych technik w mikrobiologii i genetyce molekularnej. Na przykład istnieją wielokanałowe mikropipetory do przenoszenia objętości do 8 lub 12 próbek jednocześnie. Istnieją nawet zrobotyzowane stacje robocze, które manewrują 96-kanałową głowicą pipetową! Wysiłki te obejmują multidyscyplinarne zespoły naukowców, łączące biologów posiadających wiedzę metodologiczną z inżynierami i programistami komputerowymi, którzy mogą opracować oprzyrządowanie potrzebne do wykonywania operacji mechanicznych związanych z eksperymentami. Niezależnie od zastosowania badawczego, cel wspólny dla firm rozwijających te technologie jest taki sam – automatyzacja procesów laboratoryjnych, narzędzi, systemów i przyrządów, czyniąc je mniej pracochłonnymi i bardziej wydajnymi.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Agar z tryptonem drożdżowym (YTA)
<obramowanie tabeli="1">
	< treść>
		<tr>
			<td>Ekstrakt drożdżowy</td>
			<td>2.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>10.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<g>15.0 g</gd>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>do 1000,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7,0</td>
		</tr>
	</tbody>
</stół>
Autoklaw pod kątem 121&deg; C przez 20 minut w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4&deg;C.
Jeśli przygotowujesz probówki do procedury nalewania, pozwól agarowi ostygnąć do ~55&deg; C, następnie dodać 2,0 ml cykloheksymidu o stężeniu 50 mg/ml. W asepcie dozować 18,0 ml stopionego agaru na probówkę o średnicy 18 mm, a następnie przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Agar zestala się i przed użyciem należy go stopić w parowarze lub kuchence mikrofalowej.
2. Minimalna zawartość soli agaru (MSA) + 0,1% (w/v) źródło węgla
<obramowanie tabeli="1">
	< treść>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>1.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH2HPO4&bull; 2H2O</td>
			<td>2.14 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1,09 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>0,2 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Źródło węgla*</td>
			<td>1.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór soli śladowych**</td>
			<td>10.0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<g>15.0 g</gd>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>do 1000,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7,0</td>
		</tr>
	</tbody>
</stół>
Autoklaw pod kątem 121&deg; C przez 20 minut w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4&deg;C.
* Źródła węgla użyte w eksperymentach przedstawionych na rysunku 13 obejmują acetamid, laktozę i glicynę.
** Roztwór soli śladowych przygotowuje się w 0,1 N HCl w następujący sposób. Dodaje się go do bazy przed sterylizacją (autoklaw w temperaturze 121& C przez 20 minut).
<obramowanie tabeli="1">
	< treść>
		<tr>
			<td>FeSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>300,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&bull; 4H2O</td>
			<td>180,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co(NO3)2&bull; 6H2O</td>
			<td>130,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>40,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2MoO4</td>
			<td>20,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&bull; 5H2O</td>
			<td>1,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1000,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (0,1 N)</td>
			<td>do 1000,0 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</stół>
3. Miękki agar EHA (0,65 % w/v)
<obramowanie tabeli="1">
	< treść>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<g>6,5 g</g>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Trypton</td>
			<td>13.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NaCl</td>
			<td>8.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Na Cytrynian&byk; 2H2O</td>
			<td>2.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Glukoza</td>
			<g>3,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>do 1000,0 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</stół>
Autoklaw pod kątem 121&deg; C przez 20 minut w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4&deg;C.
4. Twardy agar EHA (1,2% w/v)
<obramowanie tabeli="1">
	< treść>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>12.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>13.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			< g> 8,0 g</t>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cytrynian&byk; 2H2O</td>
			<g> 2,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoza</td>
			<g> 3,0 g</g>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>do 1000,0 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</stół>
Autoklaw pod kątem 121&deg; C przez 20 minut w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4&deg;C.
5. 1X Middlebrook Top Agar (miękki agar MBTA, 0,5% w/v)
<obramowanie tabeli="1">
	< treść>
		<tr>
			<td>100 mM CaCl2 stock*</td>
			<td> 1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 płynne medium: Neat **</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2XTA ***</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</stół>
Rozpuść 50 ml 2XTA i pozwól mu ostygnąć do ~55&deg;C. Stosując technikę aseptyczną, dodaj CaCl2 i 7H9 bulion do stopionego agaru. Aseptycznie dozować 4,5 ml mieszaniny na probówkę 13 mm i przechowywać w temperaturze 55&deg; Inkubator C &#8804; 7 dni. Chłodzenie MBTA do temperatury pokojowej lub 4&deg; C spowoduje, że CaCl2 wytrąci się z roztworu.
* 100 mM CaCl2. Zapas musi być przechowywany w temperaturze pokojowej, aby zapobiec wytrącaniu się CaCl2 z roztworu.
** 7H9 medium płynne: Neat
<obramowanie tabeli="1">
	< treść>
		<tr>
			<td>7H9 baza bulionowa</td>
			<g>4,7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% zapasów glicerolu</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>do 900,0 ml</t>
		</tr>
	</tbody>
</stół>
Wymieszaj bazę z wodą, a następnie dodaj glicerol, mieszając. Autoklaw pod kątem 121&deg; C przez 20 minut w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4&deg;C.
*** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1,0% w/v)
<obramowanie tabeli="1">
	< treść>
		<tr>
			<td>7H9 baza bulionowa</td>
			<g>4,7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>1.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>do 1000.0 ml </t>
		</tr>
	</tbody>
</stół>
Autoklaw pod kątem 121&deg; C przez 20 minut w celu sterylizacji. Dozować 50 ml porcji do butelek o pojemności 100 ml i przechowywać w temperaturze 4&st;C. 
6. Płytki agarowe Middlebrook 7H10 (twardy agar MHA, 1,9% w/v)
<obramowanie tabeli="1">
	< treść>
		<tr>
			<td>7H10 baza agarowa</td>
			<g>19.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% zapasów glicerolu</td>
			<td>12,5 ml</t>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>887.5 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</stół>
Wymieszaj bazę agarową z wodą, a następnie dodaj glicerol, mieszając. Podgrzej roztwór do wrzenia, a następnie mieszaj przez minutę, aby całkowicie rozpuścić proszek bazowy. Autoklaw pod kątem 121&deg; C przez 20 minut w celu sterylizacji. Pozwól agarowi ostygnąć do ~55&deg; Następnie w asepcie dodać następujące odczynniki: 
<obramowanie tabeli="1">
	< treść>
		<tr>
			Suplement <td>AD (wstępnie podgrzany do 37&deg; C)*</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mg/ml karbenicyliny **</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/ml cykloheksymidu **</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</stół>
* suplement AD
<obramowanie tabeli="1">
	< treść>
		<tr>
			<td>NaCl > </td>
			<td>17 g > </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumina (frakcja V)> </td>
			<td>100 g> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dekstroza (D-glukoza)> </td>
			<td>40 g> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana> </td>
			<td>do 2000.0 ml> </td>
		</tr>
	</tbody>
</stół>
Filtruj ten roztwór; Nie sterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze 4&deg;C.
** Filtruj-sterylizuj i przechowuj te roztwory w temperaturze 4&deg; C jak &le; 60 dni.</s>
7. Agar LB (1,5% w/v) + X-Gal (60 &mu; g/ml)
<obramowanie tabeli="1">
	< treść>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>10.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ekstrakt drożdżowy</td>
			<g>5,0 g</g>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>10.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<g>15.0 g</gd>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>do 1000,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7,5 przy 25&deg; C</td>
		</tr>
	</tbody>
</stół>
Autoklaw pod kątem 121&deg; C przez 20 minut w celu sterylizacji. Pozwól agarowi ostygnąć do ~55&deg; C, następnie w asepcie dodać 3,0 ml roztworu X-Gal o stężeniu 20 mg/ml. Świeżo przygotować bulion X-gal, rozpuszczając 400 mg X-Gal w 20 ml dimetyloformamidu (DMF). 
Tabela konkretnych odczynników:
<obramowanie tabeli="1">
	< treść>
		<tr>
			<td>Nazwa odczynnika</td>
			<td>Company</td>
			<td>Numer katalogowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ekstrakt drożdżowy</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>212750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>211705</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>214030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>123340010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH2HPO4&bull; 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30435</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Naukowy</td>
			<td>BP 303-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetamid</td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>A-0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laktoza</td>
			<td>Fisher Scientific </td>
			<td>L6-500 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicyna</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-7126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&bull; 4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3634</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co(NO3)2&bull; 6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2MoO4</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>213621000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&bull; 5H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>209198 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher Naukowy</td>
			<td>A144-212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cykloheksymid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>038K1561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>karbenicylina</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>46-100-RG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cytrynian&byk; 2H2O</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S279-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoza (dekstroza)</td>
			<td>BD</td>
			<td>215530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 baza bulionowa</td>
			<td>BD</td>
			<td>271310</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10 baza agarowa</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Shelton</td>
			<td>IB15760</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumina (frakcja V)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S71907</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galaktopyranozyd) </td>
			<td>Teknova</td>
			<td>X1205</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimetyloformamid (DMF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4551</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CDA19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wybielacz chlorowy</td>
			<td>Chlorox</td>
			<td>02490/06644884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CiDecon (środek dezynfekujący)</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>8504</td>
		</tr>
	</tbody>
</stół>
Tabela konkretnych urządzeń:
<obramowanie tabeli="1">
	< treść>
		<tr>
			<td>Nazwa sprzętu</td>
			<td>Company</td>
			<td>Numer katalogowy</td>
			<td>Eksperyment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metalowe pętle</td>
			<td>Amerykańskie produkty edukacyjne</td>
			<td>S17352</td>
			<td>Powłoka smugowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jednorazowe plastikowe pętle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-602</td>
			<td>Powłoka smugowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drewniane kije</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23-400-104</td>
			<td>Powłoka smugowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wykałaczki płaskie</td>
			<td>Amerykańskie produkty edukacyjne</td>
			<td>S67859</td>
			<td>Powłoka smugowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stoły obrotowe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-758Q</td>
			<td>Powłoka rozsiewająca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pręty szklane</td>
			<td>Bellco Glass</td>
			<td>NC9004380</td>
			<td>Powłoka rozsiewająca</td>
		</tr>
		<tr>
			Koraliki szklane <td>4 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-312B</td>
			<td>Powłoka rozsiewająca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aksamitna ściereczka</td>
			<td>Produkty Bel-Art</td>
			<td>09-718-2</td>
			<td>Replika poszycia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blok cylindryczny</td>
			<td>Produkty Bel-Art</td>
			<td>09-718-1</td>
			<td>Replika poszycia</td>
		</tr>
	</tbody>
</stół></td></tr></tbody></table>

aseptyczne techniki laboratoryjne: metody galwanizacji

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Mikroorganizmy są obecne na wszystkich powierzchniach nieożywionych, tworząc wszechobecne źródła możliwego skażenia w laboratorium. Sukces eksperymentu zależy od zdolności naukowca do sterylizacji powierzchni roboczych i sprzętu, a także zapobiegania kontaktowi sterylnych narzędzi i roztworów z powierzchniami niesterylnymi. W tym miejscu przedstawiamy etapy kilku metod posiewu rutynowo stosowanych w laboratorium do izolacji, rozmnażania lub liczenia mikroorganizmów, takich jak bakterie i fagi. Wszystkie pięć metod obejmuje technikę aseptyczną, czyli procedury, które utrzymują sterylność materiałów eksperymentalnych. Opisane procedury obejmują (1) powlekanie smugami kultur bakteryjnych w celu wyizolowania pojedynczych kolonii, (2) posiewanie i (3) posiewanie w celu wyliczenia żywotnych kolonii bakteryjnych, (4) miękkie nakładki agarowe w celu wyizolowania faga i zliczenia blaszek oraz (5) posiewanie replik w celu przeniesienia komórek z jednej płytki na drugą w identycznym wzorze przestrzennym. Procedury te mogą być wykonywane na stanowisku laboratoryjnym, pod warunkiem, że obejmują niepatogenne szczepy mikroorganizmów (poziom bezpieczeństwa biologicznego 1, BSL-1). W przypadku pracy z organizmami BSL-2 manipulacje te muszą odbywać się w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zapoznaj się z aktualnym wydaniem Raportu o bezpieczeństwie biologicznym w laboratoriach mikrobiologicznych i biomedycznych (BMBL) oraz z kartami charakterystyki substancji zakaźnych (MSDS) dla substancji zakaźnych, aby określić klasyfikację zagrożenia biologicznego, a także środki ostrożności i urządzenia zabezpieczające wymagane dla danego mikroorganizmu. Szczepy bakteryjne i zapasy fagów można uzyskać od badaczy, firm i kolekcji utrzymywanych przez określone organizacje, takie jak American Type Culture Collection (ATCC). Zaleca się stosowanie szczepów niepatogennych podczas nauki różnych metod posiewu. Postępując zgodnie z procedurami opisanymi w niniejszym protokole, uczniowie powinni być w stanie: 
 
● Wykonuj procedury galwaniczne bez zanieczyszczania mediów. 
● Izolować pojedyncze kolonie bakteryjne metodą powlekania smugowego. 
● Stosuj metody powlekania i rozsiewania w celu określenia stężenia bakterii. 
● Wykonuj miękkie nakładki agarowe podczas pracy z phage. 
● Przenieś komórki bakteryjne z jednej płytki na drugą za pomocą procedury posiewu repliki. 
● Biorąc pod uwagę zadanie eksperymentalne, wybierz odpowiednią metodę powlekania.

Podczas pracy z pożywkami i odczynnikami używanymi do hodowli mikroorganizmów, należy stosować technikę aseptyczną, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Do izolacji, namnażania lub oznaczania liczby bakterii i fagów rutynowo stosuje się różne metody posiewu, z których wszystkie obejmują procedury utrzymujące sterylność materiałów eksperymentalnych.

Aseptyczne techniki laboratoryjne: metody galwanizacji

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

[Narrator] Niniejszy protokół obejmuje techniki aseptyczne w metodach wysiewu stosowanych do izolacji, namnażania lub enumeracji mikroorganizmów, takich jak bakterie i fagi. Procedury obejmują wysiew metodą smugową kultur bakteryjnych w celu izolacji pojedynczych kolonii. Metodę wysiewu wgłębnego w celu oznaczenia stężenia bakterii. Oraz metodę wysiewu powierzchniowego do enumeracji żywych kolonii bakteryjnych. Nakładki z miękkiego agaru są wykorzystywane do izolacji fagów i enumeracji placków, natomiast wysiew replikacyjny umożliwia przenoszenie komórek z jednej płytki na drugą w identycznym układzie przestrzennym. W ostateczności praktyczne zastosowania tych technik hodowli mikroorganizmów obejmują zakres od identyfikacji bakterii w środowisku po postępy technologiczne w genetyce molekularnej i wysokoprzepustowych bioanalizach.- Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tymi metodami wysiewu mogą napotkać trudności, ponieważ manipulacje wymagają ostrożnych i skoordynowanych ruchów, aby uniknąć kontaktu z niejałowymi powierzchniami. Opanowanie tych rutynowych procedur wymaga szkolenia i praktyki. Procedury zaprezentuje koordynator mojego laboratorium, dr Kris Reddi.- [Narrator] Pracę z mikroorganizmami należy rozpocząć od zapoznania się z zasadami laboratoryjnymi i środkami ostrożności, w tym z klasyfikacją zagrożeń biologicznych, dekontaminacją odpadów oraz ich utylizacją. Należy potwierdzić, że wszystkie instrumenty, roztwory i pożywki do procedur wysiewu są sterylne. Należy również przygotować czysty obszar roboczy i zdezynfekować go środkiem odkażającym. Należy przygotować palnik Bunsena z rurką podłączoną do linii gazowej oraz ułożyć niezbędne materiały, odpowiednio je etykietując. Następnie należy dokładnie umyć ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą. Najpierw zmocz ręce ciepłą, bieżącą wodą, a następnie nałóż i dokładnie rozprowadź mydło. Intensywnie pocieraj ręce, wywołując tarcie na wszystkich powierzchniach, w tym na kciukach, grzbietach palców, wierzchu dłoni i pod paznokciami. Następnie dokładnie spłucz ręce, aby usunąć pozostałości mydła, i osusz je ręcznikami papierowymi z dozownika. Na koniec, używając świeżego ręcznika papierowego, zakręć kran. Procedura wysiewu metodą smugową służy do izolacji czystych kultur bakterii, czyli kolonii, z populacji mieszanych poprzez proste rozdzielenie mechaniczne. Wyjmij płytkę z agarem z chłodni o temperaturze 4 °C i ogrzej ją do temperatury pokojowej. Wybierz odpowiednie narzędzie z zestawu instrumentów do smugowania płytki. Upewnij się, że płytka jest sucha i na pokrywce nie ma kondensacji. Opisz dno płytki z agarem wzdłuż jej krawędzi. Po nabyciu wprawy można używać jednej płytki dla wielu próbek. Następnie zapal palnik Bunsena, aby wysterylizować pętlę metalową w płomieniu. Zacznij od odległości trzech do czterech cali od pętli, umieszczając drut w czubku niebieskiego stożka, czyli w najgorętszej części płomienia palnika Bunsena. Gdy metal rozżarzy się do czerwoności, przesuń drut tak, aby płomień objął pętlę. Aby schłodzić pętlę, dotknij krawędzi podłoża agarowego, co wywoła syczenie. Następnie pobierz inokulum na pętlę. Unieś dolną połowę płytki. Poruszaj pętlą w przód i w tył od krawędzi do środka w pierwszym kwadrancie płytki. Odłóż odwróconą płytkę na pokrywkę. Ponownie wysterylizuj pętlę w płomieniu. Obróć szalkę Petriego o 90 stopni. Dotknij pętlą miejsca w pobliżu końca ostatniej smugi, stosując wzór ruchów w przód i w tył, przecinając ostatnią połowę smug w pierwszym kwadrancie, a następnie przejdź do pustego drugiego kwadrantu. Po wypełnieniu drugiego kwadrantu odłóż płytkę. Powtórz procedurę smugowania dla trzeciego i czwartego kwadrantu, unikając kontaktu z pierwszym kwadrantem. W przypadku smugowania za pomocą sterylnej, płaskiej wykałaczki, trzymaj wąski koniec delikatnie między kciukiem a palcem serdecznym pod kątem 10 do 20 stopni względem podłoża, a szerokiego końca używaj do smugowania kwadrantów. Odwróć płytkę na pokrywkę pomiędzy kwadrantami i odpowiednio zutylizuj wykałaczkę. Następnie inkubuj wysiewane płytki w pozycji odwróconej. Procedura wysiewu metodą wlewaniem pozwala na wyliczenie całkowitej liczby jednostek tworzących kolonie na powierzchni i wewnątrz agaru na pojedynczej płytce. Nastaw timer na 10 minut, a następnie przenieś 18 mL stopionego podłoża agarowego z łaźni wodnej o temperaturze 55 °C do bloku grzejnego o temperaturze 48 °C i pozostaw na 10 minut w celu wyrównania temperatury. Opisz dno sterylnej szalki Petriego. Jeśli jest to wymagane, podaj czynnik rozcieńczenia. Teraz nlej 1 mL próbki na środek szalki Petriego. Zamknij pokrywkę. Zdejmij korek z probówki ze stopionym agarem i przejdź krawędzią otwartej probówki przez płomień. Ostrożnie wlej agar do szalki Petriego. Zamknij pokrywkę, a następnie wymieszaj próbkę z agarem, delikatnie obracając płytkę kolistymi ruchami. Odczekaj 30 minut, aż agar stężeje. Po zastygnięciu agaru odwróć płytkę i umieść ją w ciepłym pomieszczeniu. Wysiew metodą rozlewania ma na celu rozdzielenie mikroorganizmów zawartych w małej objętości próbki i równomierne rozłożenie powstałych kolonii na powierzchni agaru. Doprowadź płytkę do temperatury pokojowej i odpowiednio ją opisz. Umieść płytkę na obrotowym stole. Pipetuj 0,1 mL próbki na środek agaru i zamknij pokrywkę. Wyrzuć końcówkę do pojemnika na odpady. Zanurz metalowy rozpylacz w zlewce z 70% etanolem, pokrywając całą dolną część rozpylacza i pierwszy cal trzpienia, a następnie odcedź. Odpal nadmiar etanolu, przeprowadzając go przez płomień palnika Bunsena. Następnie otwórz pokrywkę płytki z agarem i schłódź rozpylacz, dotykając agaru wzdłuż krawędzi przy brzegu. Powoli obracaj stołem obrotowym. Trzymając rozpylacz delikatnie na powierzchni agaru, stopniowo i równomiernie rozprowadź próbkę na całej płytce, wykonując ruchy w przód i w tył podczas obrotu stołu. Zamknij pokrywkę i pozostaw próbkę do całkowitego wchłonięcia przez co najmniej pięć minut. Następnie inkubuj odwróconą płytkę. Najpierw odpowiednio opisz płytkę z agarem. Otwórz pokrywkę płytki z agarem. Następnie otwórz pojemnik z wstępnie sterylizowanymi szklanymi kuleczkami i wysterylizuj krawędź w płomieniu. Ostrożnie nanieś 10 do 12 sterylnych szklanych kuleczek na płytkę z agarem. Zamknij pokrywkę płytki i wysterylizuj krawędź pojemnika z kuleczkami przed ponownym założeniem korka. Teraz pipetuj próbkę na środek agaru. Wykonując ruch poziomy, delikatnie potrząśnij kuleczkami po powierzchni agaru siedem razy. Jeśli procedura jest wykonana prawidłowo, dźwięk przypomina potrząsanie marakasami. Obróć płytkę o 60 stopni i ponownie potrząśnij poziomo siedem razy. Ponownie obróć płytkę o 60 stopni i powtórz potrząsanie. Upewnij się, że próbka została wchłonięta. Następnie zlej zanieczyszczone kuleczki do oznakowanej zlewki zbiorczej zawierającej 10% wybielacza chlorowego. Inkubuj odwróconą płytkę. Test plackowy jest powszechnie stosowany do wykrywania i ilościowego oznaczania bakteriofagów. Hoduj bakterie wskaźnikowe do fazy wykładniczej i przechowuj na lodzie. Następnie opisz dwie sterylne probówki do mikrocentryfugi jako „fag” i „kontrola” i dodaj odpowiednio 50 µL próbki faga lub buforu do każdej z nich. Następnie zamieszaj kulturę bakteryjną w kolbie, przenieś alikwot bakterii do sterylnej probówki i delikatnie wymieszaj bakterie wskaźnikowe w wortexie, a następnie dodaj 500 µL bakterii do każdej probówki do adsorpcji. Wymieszaj, delikatnie stukując probówkami o dłoń. Nigdy nie używaj wortexu ani nie pipetuj energicznie próbek fagowych. Inkubuj mieszaninę faga i bakterii w temperaturze odpowiedniej dla szczepu wskaźnikowego przez 20 minut. W międzyczasie przenieś dwie probówki z miękkim agarem z łaźni wodnej o temperaturze 55 °C do bloku grzejnego o temperaturze 48 °C. Wyrównaj temperaturę przez 10 minut. Opisz dwie wolne od kondensacji płytki z twardym agarem odżywczym, uprzednio ogrzane do temperatury pokojowej. Wyjmij probówkę z miękkim agarem z bloku grzejnego i sprawdź, czy zawartość nie jest zbyt gorąca w dotyku. Następnie aseptycznie przenieś mieszaninę z probówki adsorpcyjnej z fagiem do probówki z miękkim agarem. Następnie szybko obracaj probówką między dłońmi, aby wymieszać zawartość. Trzymając probówkę w jednej ręce, otwórz pokrywkę płytki z twardym agarem drugą ręką. Natychmiast wlej całą zawartość probówki na powierzchnię płytki z twardym agarem. Szybko i delikatnie kołysz płytką. Zamknij pokrywkę i pozostaw płytkę w poziomie na 30 minut, aż miękki agar stężeje. Następnie powtórz procedurę dla probówki adsorpcyjnej kontrolnej, przenosząc mieszaninę kontrolną do probówki z miękkim agarem. Wymieszaj ją, wlej zawartość na płytkę z twardym agarem, zakołysz ją i pozwól miękkiemu agarowi stężeć przez 30 minut. Sprawdź płytki pod kątem tworzenia się placków. Aby wyizolować plack z mieszaniny heterogenicznej, ostrożnie przebij jego środek sterylną wykałaczką i przenieś inokulum do sterylnej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 100 µL buforu fagowego. Kontynuuj oczyszczanie tego lizatu, powtarzając test plackowy od trzech do sześciu razy z rozcieńczeniami seryjnymi w razie potrzeby. Wysiew metodą replikacji wykorzystuje fenotyp selekcjonowalny, umożliwiając porównanie wzrostu komórek na płytce pierwotnej z płytkami wtórnymi. Narysuj siatkę na dnie płytki, opisz płytkę pierwotną i ponumeruj powstałe kwadraty. Teraz, stosując technikę aseptyczną, wyjmij wstępnie sterylizowaną wykałaczkę ze zlewki, dotknij środka każdego kwadratu próbką komórek i zutylizuj wykałaczkę w odpowiednim pojemniku na odpady. Inkubuj płytkę pierwotną. Ustaw płytkę pierwotną i wszystkie płytki wtórne w stos. Umieść znacznik orientacyjny na boku dolnej połowy płytek. Teraz wyjmij sterylną tkaninę welurową z opakowania i umieść ją na cylindrycznym bloku. Następnie załóż uchwyt, dopasowując znaczniki na uchwycie do tych na bloku. Zwróć uwagę na znacznik orientacyjny na bloku i uchwycie. Następnie zdejmij pokrywkę z płytki pierwotnej. Dopasuj znaczniki orientacyjne na płytce i bloku. Opuść płytkę tak, aby powierzchnia agaru zetknęła się z tkaniną welurową. Używając opuszków palców, lekko, ale równomiernie dociśnij tył płytki pierwotnej, a następnie ostrożnie zdejmij ją z bloku. Potwierdź, że na welurze widać odcisk komórek. Załóż pokrywkę na płytkę. Teraz sekwencyjnie powtórz protokół na tkaninie welurowej z każdą z płytek wtórnych. Użyj odcisku komórek z płytki pierwotnej na welurze, aby zaszczepić do ośmiu płytek wtórnych, ułożonych od podłoża najmniej do najbardziej sprzyjającego. Na koniec, jako kontrolę pozytywną, dla ostatniej płytki w serii użyj podłoża agarowego, na którym powinny rosnąć wszystkie testowane szczepy. Sklej odwrócone płytki taśmą i inkubuj je. Sprawdź wzrost na płytkach wtórnych. Wyłącz palnik Bunsena, a następnie uprzątnij wszystkie materiały. Umieść zanieczyszczoną odzież laboratoryjną, szkło i odpady niebezpieczne w odpowiednim pojemniku do utylizacji. Oczyść obszar roboczy środkiem dezynfekującym. Na koniec dokładnie umyj ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą. Serratia Marcescens to gram-ujemna, pałeczkowata proteobakteria, która produkuje czerwonawy pigment zwany prodigiozyną. Często występuje w łazienkach i na zasłonach prysznicowych. W tym przykładzie technika wysiewu smugowego generuje pojedyncze kolonie w czwartym kwadrancie. Ta analiza bakterii obecnych w próbce wody pobranej z publicznej fontanny do picia wykorzystuje technikę wysiewu metodą wlewaniem. Zauważ różnicę w wyglądzie kolonii. Kolonie powierzchniowe są duże i okrągłe, podczas gdy niektóre kolonie powierzchniowe są bardzo małe i mają nieregularny kształt. Technika wysiewu metodą rozlewania jest ważnym elementem doświadczeń wzbogacania, selekcji i przesiewania. Na przykład metoda Copacabana jest narzędziem różnicującym w klasycznym przesiewie niebiesko-białym w technologii rekombinowanego DNA. Fag T4 to wirulentny fag o dwuniciowym DNA, który infekuje swojego gospodarza Escherichia coli, aby go lizować i uwalniać potomne fagi. Ten test plackowy na agarze EHA pokazuje fagi w strefach przejaśnienia o średnicy około 1 mm. W przypadku braku infekujących cząsteczek faga wzrost bakterii skutkuje mętna zawiesiną komórek w miękkim agarze, w której nie są widoczne odrębne kolonie. W technice nakładania miękkiego agaru morfologia placków może się różnić. Na przykład tutaj ten sam szczep gospodarza mycobacterium produkuje odmienne morfologie placków w obecności niszczycieli fagów microbacteria w przeciwieństwie do fagów mycobacteria MSSS. Siła wysiewu metodą replikacji tkwi w jednoczesnym przesiewaniu dużej liczby mikroorganizmów. W tym przypadku cztery szczepy pseudomonas zostały przetestowane w dubletach pod kątem wzrostu na trzech różnych źródłach węgla: acetamidzie, laktozie i glicynie. Tutaj płytka pierwotna zawiera kompletne podłoże YTA zaszczepione czterema wskazanymi szczepami. Szczepy wykazują zmienne wzorce wzrostu na płytkach replikacyjnych z minimalnego podłoża MSA uzupełnionego o pojedyncze źródło węgla: acetamid, laktozę lub glicynę. Wszystkie szczepy rosną na ostatniej płytce kontrolnej pozytywnej, co potwierdza, że komórki zostały przeniesione na wszystkie płytki wtórne w tej serii. Tabulacja wyników tych płytek replikacyjnych szczegółowo przedstawia jednoczesne przesiewanie różnych szczepów typu dzikiego pod kątem charakterystycznych wymagań wzrostowych.- Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzać procedury wysiewania bez zanieczyszczania pożywek lub kultur, a także jak dobrać odpowiednią metodę wysiewania do każdego konkretnego zadania eksperymentalnego w laboratorium. Osiągnięcie biegłości w tych technikach wymaga praktyki. Jednak dzięki odpowiedniemu przeszkoleniu procedury wysiewania opisane w tym filmie staną się naturalnym elementem pracy przy stole laboratoryjnym.

aseptic-laboratory-techniques-plating-methods

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Techniki laboratoryjne bezzakaźnicze: metody wysiewu

Podczas pracy w laboratorium niezbędne jest zminimalizowanie źródeł kontaminacji. Technika aseptyczna odnosi się do procedur umożliwiających przenoszenie kultur i odczynników przy jednoczesnym unikaniu kontaktu z powierzchniami nieszterylnymi. Pipety serologiczne i mikropipety są wykorzystywane do odmierzania precyzyjnych objętości bez naruszania sterylności roztworów stosowanych w eksperymentach.

Aseptyczne techniki laboratoryjne: przenoszenie objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipet

Ten manuskrypt opisuje prawidłowe techniki utrzymania Vibrio cholerae wraz z serią testów biochemicznych, wspólnie wykorzystywanych do szybkiego i niezawodnego rozróżniania klinicznego i środowiskowego V.  biotypy w warunkach laboratoryjnych.

Techniki laboratoryjne stosowane do utrzymania i różnicowania biotypów izolatów klinicznych i środowiskowych Vibrio cholerae

Ten protokół umożliwia czytelnikowi analizę powstawania biofilmu wywołanego solą żółciową w patogenach jelitowych przy użyciu wieloaspektowego podejścia do uchwycenia dynamicznej natury biofilmów bakteryjnych poprzez ocenę przylegania, tworzenia matrycy substancji polimerowej zewnątrzkomórkowej i dyspersji.

Tworzenie biofilmu wywołanego solą żółciową w patogenach jelitowych: techniki identyfikacji i kwantyfikacji

Testy synergii przeciwdrobnoustrojowej są używane do oceny efektu dwóch lub więcej antybiotyków stosowanych w połączeniu i zazwyczaj są wykonywane za pomocą jednej z dwóch metod: szachownicy lub testu zabijania czasu. W tym miejscu przedstawiamy zautomatyzowaną, wspomaganą drukarką atramentową technikę synergii tablicy szachownicowej oraz klasyczne badanie synergii zabijania czasu.

Testowanie synergii przeciwdrobnoustrojowej za pomocą zautomatyzowanej tablicy szachownicy wspomaganej drukarką atramentową i ręcznej metody zabijania czasu

Społeczności mikrobiologiczne w naturze i w laboratorium – Wywiad

Skuteczne zastosowanie barwników do śledzenia komórek w celu monitorowania funkcji i proliferacji komórek odpornościowych obejmuje kilka krytycznych etapów. Opisujemy metody: 1) uzyskiwania jasnego, jednorodnego i powtarzalnego znakowania barwnikami błonowymi; 2) wyboru fluorochromów i warunków akwizycji danych; oraz 3) wyboru modelu do ilościowego określania proliferacji komórek na podstawie rozcieńczenia barwnika.

Zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników do śledzenia komórek

Istnieje wiele różnych metod pomiaru pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą cytometrii przepływowej (FCM). Przy określaniu najodpowiedniejszej metody należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Przedstawiono dwa protokoły pomiaru EV, wykorzystujące albo indywidualną detekcję, albo podejście oparte na kulkach.

Techniki analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

Pokazujemy użycie różnych metod mikroskopowych, które są przydatne do obserwacji zwapnienia tubeworma, Hydroides elegans, a także do lokalizowania i charakteryzowania pierwszego zwapniałego materiału. Mikroskopia na żywo i mikroskopia elektronowa są używane razem w celu dostarczenia informacji funkcjonalnych i materiałowych, które są ważne w badaniu biomineralizacji.

Charakterystyka zwapnień przy użyciu technik mikroskopii optycznej i elektronowej na żywo w rurowcu morskim

Starzenie się komórek, nieodwracalny stan zatrzymania cyklu komórkowego, może być wywołane przez różne stresy komórkowe. W tym miejscu opisujemy protokoły indukowania starzenia się komórek oraz metody oceny markerów starzenia.

Techniki indukcji i ilościowego oznaczania starzenia się komórek

Tutaj prezentujemy protokół izolacji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci poprzez preparację i filtrację. Po amplifikacji próbki DNA nadają się do późniejszego sekwencjonowania i badania mutualizmu między endosymbiontami a mączlikiem.

Metody ekstrakcji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci

Poznaj aseptyczne techniki posiewu w mikrobiologii, w tym metody smugowe, zalewowe i powierzchniowe do izolacji bakterii i fagów. Te procedury umożliwiają badaczom uzyskanie czystych kultur mikroorganizmów.

Aseptyczne techniki laboratoryjne: metody galwanizacji

Przeglądaj więcej filmów