Aseptyczne techniki laboratoryjne: metody galwanizacji

[Narrator] Protokół ten obejmuje technikę aseptyczną w metodach powlekania stosowanych do izolowania, rozmnażania lub oznaczania liczby mikroorganizmów, takich jak bakterie i fagi. Procedury obejmują powlekanie smugami kultur bakteryjnych w celu wyizolowania pojedynczych kolonii. Wlać posiew w celu określenia stężenia bakterii. I rozprowadź posiew, aby wyliczyć żywotne kolonie bakterii. Miękkie nakładki agarowe służą do izolowania fagów i zliczania blaszek podczas replikowania posiewu komórek przenoszących się z jednej płytki na drugą w identycznym wzorze przestrzennym. Ostatecznie praktyczne zastosowania tych technik do hodowli mikroorganizmów obejmują zarówno identyfikację bakterii w środowisku, jak i postęp technologiczny w genetyce molekularnej i wysokoprzepustowe testy biologiczne.

- Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tych metodach galwanizacji, mogą mieć problemy, ponieważ manipulacje wymagają ostrożnych i skoordynowanych ruchów, unikając kontaktu z niesterylnymi powierzchniami. Poznanie tych rutynowych procedur wymaga szkolenia i praktyki. Procedury zademonstruje mój koordynator laboratoryjny, dr Kris Reddi.

- [Narrator] Rozpocznij pracę z mikroorganizmami od poznania zasad laboratoryjnych i środków ostrożności, w tym klasyfikacji zagrożeń biologicznych, odkażania odpadów i utylizacji. Upewnij się, że wszystkie instrumenty, roztwory i podłoża do procedur galwanizacji są sterylne. Ustal również przejrzystą przestrzeń roboczą. Wyczyść go środkiem dezynfekującym. Ustaw palnik Bunsena z rurką przymocowaną do przewodu gazowego, ułóż niezbędne zapasy z odpowiednio oznaczonymi materiałami. Przystąp do dokładnego mycia rąk mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą. Najpierw zwilż ręce ciepłą, bieżącą wodą, a następnie nałóż i dokładnie rozprowadź mydło. Energicznie pocieraj dłonie, powodując tarcie na wszystkich powierzchniach, w tym kciukach, grzbietach palców, grzbietach dłoni i pod paznokciami. Następnie dokładnie spłucz, aby usunąć resztki mydła i osusz za pomocą ręczników papierowych wydanych z uchwytu. Na koniec świeżym ręcznikiem papierowym zakręć kran. Procedura Streak Plate ma na celu wyizolowanie czystych kultur bakterii lub kolonii z mieszanych populacji poprzez prostą separację mechaniczną. Wyjmij płytkę agarową z chłodnego pudełka o temperaturze czterech stopni Celsjusza i podgrzej do temperatury pokojowej. Wybierz narzędzie z szeregu instrumentów do smugowania płytki. Upewnij się, że talerz jest suchy bez kondensacji na pokrywce. Oznacz spód płytki agarowej wokół krawędzi. Gdy jesteś biegły, użyj jednej płytki do wielu próbek. Następnie zapal palnik Bunsena, aby zapalić metalową pętlę. Zacznij od trzech do czterech cali od metalowej pętli z drutem na końcu niebieskiego stożka, najgorętszej części płomienia palnika Bunsena. Gdy metal rozgrzeje się do czerwoności, przesuń drut tak, aby płomień zbliżył się do pętli. Aby schłodzić pętlę, dotknij krawędzi podłoża agarowego, generując skwierczący dźwięk. Kontynuuj zbieranie inokulum na pętli. Podnieś dolną połowę talerza. Przesuwaj pętlę w przód iw tył od krawędzi do środka w pierwszej ćwiartce płyty. Odłóż odwrócony talerz z powrotem na pokrywkę. Ponownie zapal metalową pętlę. Obróć szalkę Petriego o 90 stopni. Dotknij pętli w pobliżu końca ostatniej smugi, używając wzoru tam iz powrotem, przetnij ostatnią połowę smug w pierwszej ćwiartce, a następnie przejdź do pustej drugiej ćwiartki. Po napełnieniu drugiego kwadrantu odłóż płytkę. Powtórz procedurę smugowania dla trzeciej i czwartej ćwiartki, unikając kontaktu z pierwszą ćwiartką. Aby pokryć smugi sterylną, płaską wykałaczką, delikatnie przytrzymaj wąski koniec między kciukiem a palcem serdecznym pod kątem od 10 do 20 stopni do podłoża, użyj szerokiego końca do smug ćwiartek. Odwróć płytkę z powrotem na pokrywkę między ćwiartkami i odpowiednio wyrzuć wykałaczkę. Przystąp do inkubacji płytek z prążkami do góry nogami. Procedura nalewania płytki wylicza całkowitą liczbę jednostek tworzących kolonie na powierzchni i w agarze pojedynczej płytki. Ustaw minutnik na 10 minut, a następnie przenieś 18 mililitrów stopionego podłoża agarowego z łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza do bloku grzewczego o temperaturze 48 stopni Celsjusza i równoważ przez 10 minut. Oznacz spód sterylnej szalki Petriego. W stosownych przypadkach należy podać współczynnik rozcieńczenia. Teraz dozuj jeden mililitr próbki do środka szalki Petriego. Zamknij pokrywę. Zdjąć nakrętkę z probówki ze stopionym agarem i przepuścić brzeg otwartej probówki przez płomień. Ostrożnie wlej agar na szalkę Petriego. Zamknij pokrywkę, a następnie wymieszaj próbkę z agarem, delikatnie obracając płytkę. Odczekaj 30 minut, aby agar zastygł. Gdy agar zastygnie, odwróć i umieść płytkę w ciepłym pomieszczeniu. Powlekanie ma na celu oddzielenie mikroorganizmów zawartych w małej objętości próbki, równomiernie rozprowadzając powstałe kolonie na powierzchni agaru. Wyrównaj talerz do temperatury pokojowej i odpowiednio oznacz. Umieść płytkę na talerzu obrotowym. Odmierzyć pipetą 0,1 mililitra próbki na środek agaru i zamknąć pokrywkę. Wyrzuć końcówkę do pojemnika na odpady. Zanurz metalowy pręt w zlewce z 70% etanolem, pokrywając całą dolną część rozsiewacza i pierwszy cal trzpienia, a następnie odcedź. Zapal nadmiar etanolu, przechodząc przez płomień palnika Bunsena. Następnie otwórz pokrywę płytki agarowej i ostudź rozsiewacz, dotykając go do agaru wzdłuż krawędzi w pobliżu krawędzi. Powoli obracaj gramofonem. Delikatnie trzymając rozsiewacz na powierzchni agaru, stopniowo równomiernie rozprowadzaj próbkę na całej płytce, wykonując ruchy w przód iw tył, podczas gdy talerz obrotowy się obraca. Zamknąć pokrywę i pozostawić próbkę do całkowitego wchłonięcia przez co najmniej pięć minut. Następnie inkubuj odwróconą płytkę. Najpierw odpowiednio oznacz płytkę agarową. Otwórz pokrywkę płytki agarowej. Następnie otwórz pojemnik ze wstępnie wysterylizowanymi szklanymi koralikami i podpal obręcz. Ostrożnie dozuj od 10 do 12 sterylnych szklanych kulek na płytkę agarową. Zamknij pokrywę talerza i podpal krawędź pojemnika na szklane koraliki przed założeniem nakrętki. Teraz odpipetuj próbkę na środek agaru. Ruchem poziomym delikatnie potrząśnij koralikami po powierzchni agaru siedem razy. Jeśli zostanie wykonana prawidłowo, zabieg brzmi jak potrząsanie marakasami. Obróć płytkę o 60 stopni i ponownie potrząśnij poziomo siedem razy. Ponownie obróć płytkę o 60 stopni i powtórz potrząsanie. Sprawdzić, czy próbka została wchłonięta. Następnie wylej zanieczyszczone kulki do oznaczonej zlewki zbiorczej zawierającej 10% wybielacza chlorowego. Inkubować odwróconą płytkę. Test płytki nazębnej jest powszechnie stosowany do wykrywania i ilościowego oznaczania fagów bakteryjnych. Hoduj bakterie wskaźnikowe do fazy wykładniczej i przechowuj na lodzie. Następnie oznacz dwie sterylne probówki do mikrowirówek fagiem i kontrolą, a następnie dodaj odpowiednio 50 mikrolitrów próbki faga lub buforu do każdej z nich. Następnie zawiruj kulturę bakteryjną w kolbie, a następnie przenieś porcję bakterii do sterylnej probówki i delikatnie zawiruj bakterie wskaźnikowe, a następnie dodaj 500 mikrolitrów bakterii do każdej probówki absorpcyjnej. Wymieszaj, delikatnie przesuwając rurki. Nigdy nie należy wirować ani energicznie pipetować próbek fagów. Mieszaninę bakterii fagowych inkubować w temperaturze odpowiedniej dla szczepu wskaźnikowego przez 20 minut. W międzyczasie przenieś dwie miękkie probówki agarowe z łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza do bloku grzewczego o temperaturze 48 stopni Celsjusza. Równoważ przez 10 minut. Oznaczyć dwie bezkondensacyjne, pozbawione składników odżywczych twarde płytki agarowe wstępnie zrównoważone do temperatury pokojowej. Wyjmij miękką probówkę agarową z bloku grzewczego i sprawdź, czy zawartość nie jest zbyt gorąca do dotknięcia. Następnie aseptycznie przenieść mieszaninę z probówki absorpcyjnej faga do miękkiej probówki agarowej. Następnie szybko obracaj między dłońmi, aby wymieszać zawartość. Trzymając probówkę w jednej ręce, drugą ręką otwórz pokrywkę twardej płytki agarowej. Natychmiast wylać całą zawartość probówki na powierzchnię twardej płytki agarowej. Kołysz talerzem szybko i delikatnie. Zamknij pokrywkę i umieść talerz na poziomie na 30 minut, aż miękki agar zastygnie. Następnie powtórz procedurę dla kontrolnej probówki absorpcyjnej, przenosząc mieszaninę kontrolną do miękkiej probówki z agarem. Wymieszaj go, wylej zawartość na twardy talerz agarowy, kołysz nim i pozwól miękkiemu agarowi zestalić się przez 30 minut. Sprawdź płytki pod kątem tworzenia się płytki nazębnej. Aby wyizolować płytkę nazębną z niejednorodnej mieszaniny, ostrożnie przebij środek sterylną wykałaczką i przenieś inokulum do sterylnej probówki mikrowirówki zawierającej 100 mikrolitrów buforu fagowego. Kontynuuj oczyszczanie tego lizatu, powtarzając test płytki nazębnej trzy do sześciu razy z seryjnymi rozcieńczeniami, jeśli to konieczne. Posiewanie replik wykorzystuje wybieralny fenotyp, umożliwiając porównanie wzrostu komórek na płytce pierwotnej z płytkami wtórnymi. Zaznacz siatkę na spodzie płyty, oznacz blachę główną i ponumeruj powstałe kwadraty. Teraz użyj techniki aseptycznej, aby wyjąć wstępnie wysterylizowaną wykałaczkę ze zlewki, przetrzyj środek każdego kwadratu próbką komórek i wyrzuć wykałaczkę do odpowiedniego pojemnika na odpady. Inkubować płytkę główną. Ułóż blachę główną i wszystkie blachy pomocnicze. Umieść znacznik orientacji z boku dolnej połowy płyt. Teraz wyjmij sterylną aksamitną szmatkę z opakowania i umieść ją na cylindrycznym bloku. Następnie umieść uchwyt, wyrównując znaki na uchwycie z tymi na bloku. Zwróć uwagę na znak orientacji na bloku i uchwycie. Następnie zdejmij pokrywkę z płyty głównej. Wyrównaj znaczniki orientacji na płycie i bloku. Opuść płytkę tak, aby powierzchnia agaru stykała się z aksamitną szmatką. Opuszkami palców delikatnie, ale równomiernie dociśnij tylną część płyty głównej, a następnie ostrożnie zdejmij ją z bloku. Upewnij się, że odcisk komórek jest widoczny na aksamicie. Załóż pokrywkę na talerz. Teraz kolejno powtórz protokół na aksamitnej szmatce z każdą z płytek wtórnych. Użyj aksamitnego wycisku komórek z płytki pierwotnej, aby zaszczepić do ośmiu płytek wtórnych uporządkowanych od najmniej do najkorzystniejszego podłoża. Na koniec, jako kontrolę pozytywną, dla ostatniej płytki w serii, należy użyć podłoża agarowego, w którym powinny rosnąć wszystkie badane szczepy. Sklej odwrócone płytki razem i inkubuj je. Sprawdź płyty wtórne pod kątem wzrostu. Wyłącz palnik Bunsena, a następnie odłóż wszystkie zapasy. Zanieczyszczoną odzież laboratoryjną, wyroby szklane i odpady niebezpieczne należy umieścić w odpowiednim pojemniku na odpady. Oczyść obszar roboczy środkiem dezynfekującym. Na koniec dokładnie umyj ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą. Serratia Marcescens to Gram-ujemna proteobacterium w kształcie pręcika, która wytwarza czerwonawy pigment zwany prodigiozyną. Jest powszechnie spotykany w łazienkach i na zasłonach prysznicowych. W tym przykładzie technika smugowo-płytkowa generuje pojedyncze kolonie w czwartej ćwiartce. Ta analiza bakterii obecnych w próbce wody pobranej z publicznej fontanny do picia wykorzystuje technikę Pour Plate. Zwróć uwagę na różnicę w wyglądzie kolonii. Kolonie powierzchniowe są duże i mają okrągły kształt, podczas gdy niektóre kolonie powierzchniowe są bardzo małe i mają nieregularny kształt. Technika Spread Plate jest ważnym elementem w eksperymentach wzbogacających, selekcyjnych i przesiewowych. Na przykład metoda copacabana jest narzędziem różnicującym w klasycznym niebiesko-białym ekranie w technologii rekombinacji DNA. T4 to zjadliwy dwuniciowy DNA, który infekuje swojego gospodarza jako Escherichia coli w celu lizy i uwolnienia faga potomnego. Ten test płytki nazębnej na agarze EHA pokazuje fagi w strefach oczyszczania o średnicy około jednego milimetra. W przypadku braku infekujących cząstek fagowych, wzrost bakterii powoduje mętne zawieszenie komórek w miękkim agarze , w którym dyskretne kolonie nie są widoczne. W technice miękkiego nakładania agaru morfologie płytki nazębnej różnią się. Na przykład w tym przypadku ten sam szczep gospodarza prątków wytwarza odrębne morfologie blaszek w obecności mikrobakterii niszczycieli fagów w porównaniu z prątkami fagów MSSS. Siła poszycia replik polega na jednoczesnym przesiewaniu dużej liczby mikroorganizmów. W tym przypadku cztery szczepy Pseudomonas zostały przetestowane w dwóch egzemplarzach pod kątem wzrostu na trzech różnych źródłach węgla. Paratemid, laktoza i glicyna. W tym przypadku płytka pierwotna jest kompletną pożywką YTA zaszczepioną czterema szczepami, jak wskazano. Szczepy wykazują zmienne wzorce wzrostu na płytkach replik z minimalnym podłożem MSA uzupełnionym acetamidem, laktozą lub glicyną z pojedynczym źródłem węgla. Wszystkie szczepy rosną na ostatniej płytce kontroli dodatniej, potwierdzając, że komórki zostały przeniesione na wszystkie płytki wtórne w tej serii. Tabelaryczne wyniki tych replik płytek zawierają szczegółowe informacje na temat jednoczesnego badania przesiewowego różnych dzikich szczepów pod kątem charakterystycznych wymagań wzrostu.

- Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać procedury galwaniczne bez zanieczyszczania pożywek lub kultur, a także stosować odpowiednią metodę powlekania dla każdego zadania eksperymentalnego w laboratorium. Osiągnięcie biegłości w tych technikach wymaga praktyki. Jednak przy odpowiednim przeszkoleniu procedury galwaniczne opisane w tym filmie staną się drugą naturą podczas pracy przy stole laboratoryjnym.