Techniki analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i analiza krążenia pęcherzyków zewnątrzkomórkowych we krwi za pomocą dwóch różnych metod. Do indywidualnej metody wykrywania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Osocze ubogie w płytki krwi lub PPP jest najpierw izolowane z próbki krwi.

PPP jest następnie barwiony interesującymi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem. W przypadku metody wykrywania opartej na kulkach pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są inkubowane z kulkami, a następnie pęcherzyki związane z kulkami są barwione odpowiednimi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem. Ostatecznie zawartość krążących pęcherzyków zewnątrzkomórkowych można określić na podstawie analizy próbek za pomocą cytometrii przepływowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia elektronowa lub separacja kulek magnetycznych, jest to, że jest ona znacznie szybsza i pozwala na ocenę całej populacji eskalów zewnątrzkomórkowych, a nie ogranicza się do określonych subpopulacji. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ sukces tej metody wymaga ścisłego przestrzegania zademonstrowanych manewrów i parametrów ustawień cytometru Aby uzyskać wysokiej jakości dane przy minimalnej codziennej zmienności, zacznij od odwirowania próbek krwi pełnej w celu oddzielenia osocza od płaszcza Buffy i czerwonych krwinek. Następnie przenieś 1,2 mililitra porcji supernatantu osocza do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych, uważając, aby nie naruszyć dolnych warstw zawierających kożuchy i krwinek czerwonych, a następnie ponownie odwiruj supernatant w celu usunięcia wszelkich płytek krwi i dużych fragmentów komórek.

Pod koniec wirowania ostrożnie przenieś wszystkie oprócz ostatnich 200 mikrolitrów próbek PPP do nowych probówek, uważając, aby nie naruszyć granulek. Następnie kilkakrotnie wymieszaj osocze w górę iw dół i przenieś 320 mikrolitrów każdej próbki do górnego rzędu płytki 96-dołkowej. Aby wybarwić próbki, połącz przeciwciała będące przedmiotem zainteresowania dla każdego z trzech paneli w indywidualne odśrodkowe probówki filtracyjne o temperaturze zerowej 22 mikrometry i odwiruj przeciwciała za pomocą wirówki o stałym kącie i jednej prędkości.

Gdy całe przeciwciało przejdzie przez filtr, dodaj odpowiednią ilość mieszaniny do każdej studzienki płytki 96-dołkowej, jak pokazano na rysunku. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej wymieszaj próbki PPP, a następnie przenieś 100 mikrolitrów każdej próbki do przeciwciał w drugim rzędzie. Następnie ponownie wymieszaj próbki, zmień końcówki i przenieś 100 mikrolitrów próbki do każdego z dwóch następnych rzędów przeciwciał, jeśli to konieczne.

Do eksperymentu. Inkubować płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza po 30 minutach w ilości 220 mikrolitrów PBS na studzienkę, aby wiosłować od szóstego do ósmego w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej o regulowanej szerokości, przenieś zawartość każdej studzienki do odpowiedniej odśrodkowej rurki filtracyjnej bez wymiany końcówek.

Użyj 200 mikrolitrów PBS z jednego z rzędów mycia, aby przepłukać studzienki, z których właśnie usunięto próbki. Następnie przenieś roztwór płuczący do tych samych filtrów, do których wcześniej dodano próbki PPP, i zamknij filtry odśrodkowe. Po przeniesieniu wszystkich barwionych próbek PPP wraz z roztworami do płukania, należy odwirować próbki w wirówce ze stałym wirnikiem.

Po odwirowaniu upewnij się, że na filtrach nie pozostał żaden płyn. Następnie ponownie zawiesić górną część filtrów w 300 mikrolitrach PBS i przenieść zawieszoną zawartość do wstępnie oznakowanych probówek w celu natychmiastowej analizy cytometrycznej przepływu. Mycie wybarwionych próbek za pomocą filtrów odśrodkowych zwiększa separację między sygnałami tła a dodatnimi sygnałami znacznikowymi.

Należy jednak pamiętać, że niektóre z mniejszych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, w tym egzosomy, mogą zostać utracone przez drzwi filtra Aby przeanalizować próbki, najpierw ustaw parametry napięcia rozproszenia przodu i bocznego na skalę logarytmiczną i wybierz najniższe progi dozwolone przez cytometr dla każdego parametru. Następnie, pracując w rurze o punkcie zerowym 22 mikrometrach, przefiltrowany PBS dostosowuje te napięcia do najwyższych wartości, które wykluczają większość szumów tła. Następnie uruchom rurkę zawierającą mieszaninę koralików, jeden mikrometr i mniej, i narysuj bramkę wokół populacji koralików na wykresie punktowym z przodu po stronie, aby uchwycić wszystkie zdarzenia pod koralikami o długości jednego mikrometra.

Teraz ustaw natężenie przepływu cytometru na niskie i użyj koralików, aby dostosować pokrętło natężenia przepływu na cytometrze do żądanej szybkości zdarzenia. Następnie, używając rurki z tęczowymi cząstkami fluorescencyjnymi rozcieńczonymi w PBS, uzyskaj 5 000 zdarzeń, rejestrując średnią intensywność wartości dla rozproszenia po stronie rozproszenia do przodu i każdego kanału koloru. Po ustawieniu wszystkich parametrów uruchom każdą próbkę dokładnie przez jedną lub dwie minuty Po zakończeniu pierwszego odczytu dla każdej probówki, wymieszaj 20 mikrolitrów 10% MP 40 z każdą próbką i ponownie odczytuj probówki przez ten sam czas, aby umożliwić odjęcie pozytywnych zdarzeń wykrytych w lizowanej próbce przez równy okres czasu.

Aby wykryć pęcherzyki zewnątrzkomórkowe za pomocą wychwytywania na podstawie kulek, zacznij od dwukrotnego umycia niepowlekanych sześciomikrometrowych kulek polistyrenowych pożywką RPMI, a następnie Resus w dwóch mililitrach tego samego. Następnie dodać 6 000 koralików do każdej nowej rurki faksowej do probówki kontroli ujemnej po 400 mikrolitrach pożywki do wszystkich pozostałych probówek po 200 mikrolitrów PPP lub ultrawirówek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, w zależności od potrzeb, i 200 mikrolitrów pożywki. Dostosuj końcową objętość w każdej tubie do 400 mikrolitrów.

Z większą ilością nośników. Inkubuj probówki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na shakerze. Następnego ranka umyj koraliki dwoma mililitrami pożywki.

Odessać supernatant i zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 400 mikrolitrów 5% albuminy surowicy bydlęcej na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po trzech godzinach umyj kulki w dwóch kolejnych mililitrach podłoża i ponownie zawieś granulki w 100 mikrolitrach świeżego podłoża. Teraz przefiltruj przeciwciała i dodaj odpowiednią objętość przefiltrowanego koktajlu przeciwciał do każdej probówki, a następnie po 30 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj kulki w kolejnych dwóch mililitrach pożywki.

Tym razem ponownie zawiesić granulki w 400 mikrolitrach pożywki i natychmiast przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej, dostosowując parametry rozproszenia do przodu wewnątrz do najniższego progu dozwolonego przez cytometr przepływowy, jak właśnie pokazano. Na koniec zbierz populację koralików singletowych i uzyskaj 2000 zdarzeń na próbkę. Zarówno metody wykrywania indywidualnego, jak i oparte na kulkach mogą być stosowane do wykrywania obecności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w próbkach PPP, jak pokazano na tych wykresach kropkowych W przypadku indywidualnego testu wykrywania, kontrolka zlizowana jest używana do ustawienia bramek dla odpowiedniej próbki niewymienionej.

Większość zdarzeń powinna mieścić się w bramie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Na przykład na tym rysunku te wykresy dwuparametrowe wykazały wykrycie markerów, CD 1 0 8 A i CD 2 35 A, które są dwoma markerami czerwonych krwinek, o których wiadomo, że współistnieją na komórkach. Zgodnie z oczekiwaniami, ponad połowa pozytywnych zdarzeń na pęcherzykach zewnątrzkomórkowych jest dodatnia dla obu markerów, podczas gdy na tych wykresach parametrów ekspresja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych dwóch markerów, o których wiadomo, że nie współistnieją na komórkach, wykazuje odrębne oddzielne populacje dodatnie przy użyciu metody wykrywania opartej na kulkach.

Nie ma separacji między populacjami dodatnimi i ujemnymi, a zdarzenia pojawiają się w podwójnie dodatnich kwadrantach, mimo że zwykle nie występują one na tych samych typach komórek ze względu na fakt, że oba typy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wiążą się z jednym koralikiem. Dlatego dane z tej metody najlepiej analizować przy użyciu histogramów nałożonych na dane kontroli ujemnej, z widocznym przesunięciem wyrażenia markera obserwowanym w próbkach z koralikami w porównaniu z kontrolami po opanowaniu. Technika ta może być wykorzystana do analizy 12 próbek krwi z trzema panelami przeciwciał w ciągu trzech do czterech godzin przy użyciu indywidualnej metody wykrywania lub w ciągu półtora dnia za pomocą metody perełkowej, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o konsekwentnym traktowaniu każdej próbki, upewnić się, że natężenie przepływu cytometru i intensywność fluorescencji zostały prawidłowo dostosowane na początku każdego eksperymentu, aby dopasować je do ustawień eksperymentalnych z poprzedniego dnia, zwłaszcza w przypadku przeprowadzania wielu próbek w ciągu wielu dni.