Techniki analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja i analiza krążących pęcherzyków zewnątrzkomórkowych we krwi przy użyciu dwóch różnych metod. W przypadku metody detekcji poszczególnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, w pierwszej kolejności z próbki krwi izoluje się osocze ubogie w płytki krwi (PPP).

Następnie PPP barwi się przeciwciałami sprzężonymi z odpowiednim fluorochromem. W przypadku metody detekcji opartej na kuleczkach, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe inkubuje się z kuleczkami, a następnie pęcherzyki związane z kuleczkami barwi się odpowiednimi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem. Ostatecznie zawartość krążących pęcherzyków zewnątrzkomórkowych można określić poprzez analizę próbek metodą cytometrii przepływowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak mikroskopia elektronowa czy separacja za pomocą kulek magnetycznych, jest znacznie krótszy czas analizy oraz możliwość oceny całkowitej populacji zewnątrzkomórkowych pęcherzyków, zamiast ograniczania się do konkretnych subpopulacji. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ sukces procedury wymaga ścisłego przestrzegania zaprezentowanych manewrów oraz parametrów konfiguracji cytometru. Aby uzyskać wysokiej jakości dane z minimalną zmiennością dzienną, należy rozpocząć od odwirowania próbek krwi pełnej w celu oddzielenia osocza od warstwy leukocytarnej i erytrocytów. Następnie należy przenieść aliquoty 1,2 ml nadsączu osocza do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml, dbając o to, aby nie naruszyć dolnych warstw zawierających warstwę leukocytarną i erytrocyty, a następnie ponownie odwirować nadsącz, aby usunąć płytki krwi oraz duże fragmenty komórek.

Po zakończeniu wirowania ostrożnie przenieś wszystkie próbki PPP do nowych probówek, z wyjątkiem ostatnich 200 µL, dbając o to, aby nie naruszyć osadów. Następnie wymieszaj osocze kilkukrotnie poprzez pipetowanie i przenieś 320 µL każdej próbki do górnego rzędu płytki 96-dołkowej. Aby zabarwić próbki, połącz przeciwciała interesujące dla każdego z trzech paneli w oddzielnych probówkach z filtrem odwirowującym o rozmiarze 0,22 µm i odwiruj przeciwciała w wirówce z kątem stałym i jedną prędkością.

Gdy całe przeciwciało przejdzie przez filtr, dodaj odpowiednią ilość mieszaniny do każdego dołka płytki 96-dołkowej, zgodnie z przedstawionym na rysunku schematem. Następnie, używając pipety wielokanałowej, wymieszaj próbki PPP, a następnie przenieś 100 µL każdej próbki do przeciwciał w drugim rzędzie. Ponownie wymieszaj próbki, wymień końcówki i przenieś 100 µL próbki do każdego z dwóch kolejnych rzędów przeciwciał, zgodnie z procedurą.

W celu przeprowadzenia eksperymentu, wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza, do rzędów od szóstego do ósmego wlej po 220 µL PBS do każdego dołka, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Następnie, używając wielokanałowej pipety z regulowaną szerokością, przenieś zawartość każdego dołka do odpowiadającej mu probówki z filtrem do wirowania, nie zmieniając końcówek.

Użyj 200 µL PBS z jednego z rzędów płuczących, aby wypłukać dołki, z których przed chwilą usunięto próbki. Następnie przenieś roztwór płuczący do tych samych filtrów, do których wcześniej dodano próbki PPP, i zamknij filtry wirowkowe. Gdy wszystkie zabarwione próbki PPP zostaną przeniesione wraz z roztworami płuczącymi, odwiruj próbki w wirówce z rotorem stałym.

Po wirowaniu należy upewnić się, że na powierzchni filtrów nie pozostał płyn. Następnie należy resuspender materiał z wierzchołków filtrów w 300 µL PBS i przenieść resuspensję do uprzednio oznakowanych probówek w celu natychmiastowej analizy cytometrycznej. Przemycie zbarwionych próbek przy użyciu filtrów odwirowujących zwiększa separację między tłem a sygnałami markerów dodatnich.

Należy jednak zauważyć, że niektóre z mniejszych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, w tym egzosomy, mogą zostać utracone przez pory filtra. Aby przeanalizować próbki, najpierw należy ustawić parametry napięcia dla rozproszenia przedniego i bocznego w skali logarytmicznej i wybrać najniższe progi dopuszczalne przez cytometr dla każdego parametru. Następnie, podczas analizy probówki z filtrowanym PBS (0,22 µm), należy dostosować napięcia do najwyższych wartości, które wykluczają większość szumu tła. W kolejnym kroku należy przeanalizować probówkę zawierającą mieszaninę kulek o rozmiarze 1 µm i mniejszych oraz wyznaczyć bramkę wokół populacji kulek na wykresie rozproszenia przedniego względem bocznego, aby uchwycić wszystkie zdarzenia odpowiadające kulkom o rozmiarze do 1 µm.

Następnie ustaw przepływ cytometru na niski i za pomocą kulek dostosuj pokrętło prędkości przepływu w cytometrze do pożądanej częstotliwości zdarzeń. Następnie, używając probówki z tęczowymi cząstkami fluorescencyjnymi rozcieńczonymi w PBS, zarejestruj 5 000 zdarzeń, zapisując średnią intensywność wartości dla rozproszenia przedniego (forward scatter), rozproszenia bocznego (side scatter) oraz każdego kanału kolorystycznego. Po ustawieniu wszystkich parametrów analizuj każdą próbkę przez dokładnie jedną lub dwie minuty. Po zakończeniu pierwszego odczytu dla każdej probówki, dodaj 20 µL 10% MP 40 do każdej próbki, a następnie ponownie odczytaj zawartość probówek przez ten sam czas, aby umożliwić odjęcie zdarzeń pozytywnych wykrytych w próbce poddanej lizie w analogicznym przedziale czasowym.

Aby wykryć pęcherzyki zewnątrzkomórkowe za pomocą wychwytu na kuleczkach, należy rozpocząć od dwukrotnego przemycia niepowlekanych polistyrenowych kuleczek o średnicy 6 µm pożywką RPMI, a następnie zawiesić je w 2 mL tej samej pożywki. Następnie do każdej nowej probówki typu fax należy dodać 6 000 kuleczek; do probówki z kontrolą negatywną dodać 400 µL pożywki, a do pozostałych probówek 200 µL PPP lub ultracentryfugowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, zależnie od potrzeb, oraz 200 µL pożywki. Objętość końcową w każdej probówce należy dostosować do 400 µL.

Z dodatkiem większej ilości pożywki. Inkubować probówki przez noc w temperaturze four degrees Celsius na wytrząsarce. Następnego ranka przemyć kulki dwiema mililitrami pożywki.

Odsajmij supernatant i zablokuj wiązania niespecyficzne, dodając 400 µL 5% bovine serum albumin, a następnie inkubuj na wytrząsarce w temperaturze 4 °C przez trzy godziny. Po trzech godzinach przemyj kuleczki w dodatkowych dwóch mililitrach pożywki i resuspenduj osady w 100 µL świeżej pożywki. Następnie przefiltruj przeciwciała i dodaj odpowiednią objętość przefiltrowanego koktajlu przeciwciał do każdej probówki, a po 30 minutach w temperaturze 4 °C przemyj kuleczki w kolejnych dwóch mililitrach pożywki.

Tym razem zawiesić osady w 400 µL medium i natychmiast poddać próbki analizie metodą cytometrii przepływowej, ustawiając parametry rozproszenia światła przedniego (forward scatter) na najniższym progu dopuszczalnym przez cytometr, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Na koniec wyznaczyć bramkę dla populacji pojedynczych kuleczek (singlets) i zarejestrować 2000 zdarzeń na próbkę. Zarówno metoda detekcji indywidualnej, jak i metoda oparta na kuleczkach, mogą być wykorzystywane do wykrywania obecności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w próbkach PPP, co zilustrowano na tych wykresach kropkowych. W przypadku testu detekcji indywidualnej kontrola liza służy do ustawienia bramek dla odpowiadającej jej próbki nieprzylistowanej.

Większość zdarzeń powinna mieścić się w bramce pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Na przykład na niniejszej rycinie dwuparametrowe wykresy obrazują detekcję markerów CD 1 0 8 A oraz CD 2 35 A, będących dwoma markerami erytrocytów, o których wiadomo, że współistnieją na komórkach. Zgodnie z oczekiwaniami, ponad połowa zdarzeń dodatnich wśród pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jest dodatnia dla obu markerów, natomiast na tych wykresach dwuparametrowych ekspresja dwóch markerów w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych, o których wiadomo, że nie współistnieją na komórkach, wykazuje wyraźne, oddzielne populacje dodatnie przy zastosowaniu metody detekcji opartej na kuleczkach.

Nie występuje rozdzielenie populacji dodatniej i ujemnej, a zdarzenia pojawiają się w kwadrantach podwójnie dodatnich, mimo że zazwyczaj nie występują one na tych samych typach komórek, co wynika z faktu, że oba typy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wiążą się z jednym koralikiem. W związku z tym dane uzyskane tą metodą najlepiej analizować za pomocą histogramów z nałożonymi danymi kontroli ujemnej, obserwując wyraźne przesunięcie w ekspresji markera w próbkach z koralikami w porównaniu z kontrolami. Po opanowaniu techniki można ją wykorzystać do analizy 12 próbek krwi z trzema panelami przeciwciał w czasie od trzech do czterech godzin przy zastosowaniu metody detekcji pojedynczej lub w ciągu półtora dnia przy użyciu metody z koralikami, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować spójność w traktowaniu każdej próbki oraz upewnić się, że prędkość przepływu w cytometrze i intensywność fluorescencji zostały prawidłowo dostrojone na początku każdego eksperymentu, tak aby odpowiadały ustawieniom z dnia poprzedniego, szczególnie w przypadku analizy wielu próbek w ciągu wielu dni.