Zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników do śledzenia komórek

Ogólnym celem tej metody jest wykorzystanie barwników do śledzenia komórek w celu bezpośredniego ilościowego określenia stopnia podziałów komórkowych dla różnych subpopulacji komórek odpornościowych w złożonych populacjach. Osiąga się to poprzez uprzednie znakowanie rodzimej populacji komórek barwnikiem fluorescencyjnym, który wiąże się stabilnie z białkami komórkowymi lub wnika niekowalencyjnie w błony komórkowe; śledzenie znakowanych komórek reagujących na stymulację, barwienie przeciwciałami fluorescencyjnymi oraz analiza przy użyciu wieloparametrycznej cytometrii przepływowej umożliwiają wykrycie zróżnicowanych odpowiedzi wśród analizowanych typów komórek odpornościowych. Kontrole niezbarwione barwnikiem śledzącym służą do ustalenia najniższej intensywności fluorescencji komórek potomnych, którą można odróżnić od autofluorescencji, natomiast kontrole znakowane barwnikiem, ale niestymulowane, są wykorzystywane do ustalenia intensywności fluorescencji, przy której wykrywane będą komórki niepodzielone. Stymulacja zazwyczaj prowadzi do uzyskania szerokiego zakresu intensywności, ponieważ komórki proliferujące w odpowiedzi na stymulację stają się stopniowo słabiej fluorescencyjne, czego nie obserwuje się w przypadku komórek niereagujących.

Ostatecznie, wykorzystanie oprogramowania do modelowania pików w celu oszacowania względnej częstości występowania komórek w różnych generacjach pozwala na ilościowe porównanie odpowiedzi proliferacyjnych w różnych populacjach lub pod wpływem różnych bodźców, przy użyciu takich wskaźników jak indeks proliferacji lub częstość występowania prekursorów. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak wbudowywanie trytu, tymidyny lub ekspresja KI 67, jest to, że rozcieńczanie barwnika DI zapewnia bezpośredni pomiar podziału komórek, który można połączyć z innymi pomiarami cytometrycznymi, takimi jak immunofenotypowanie i produkcja cytokin. Wizualna demonstracja metody barwienia barwnikami błonowymi jest pomocna, ponieważ pobieranie barwnika przez komórki zachodzi niezwykle szybko.

W związku z tym prawidłowa technika jest kluczowa dla uzyskania jasnego i jednorodnego barwienia. Po izolacji monocytów i limfocytów z krwi obwodowej człowieka należy odwirować zawiesinę przez pięć minut przy 300 ×g w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować zanieczyszczenie płytkami krwi. Następnie osad należy resuspender w stężeniu 10⁷ komórek na mililitr w HBSS z dodatkiem 1%BSA i umieścić na lodzie.

Pobrać i zachować 500 µL aliquotu, następnie przenieść kolejny aliquot 500 µL komórek do stożkowej probówki polipropylenowej o wymiarach 12 × 75 mm. Dodać 3,5 ml HBSS i odwirować komórki przez pięć minut przy 400 ×g w temperaturze pokojowej. Podczas płukania dodać 0,5 ml rozpuszczalnika C (labeling vehicle) z zestawu PKH 26 GL do drugiej stożkowej probówki polipropylenowej o wymiarach 12 × 75 mm. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając nie więcej niż 15–25 µL cieczy resztkowej i dbając, aby nie usunąć komórek. Następnie dodać 0,5 ml rozpuszczalnika C (labeling vehicle) do osadu komórkowego, a następnie kilkakrotnie odessać i dozować roztwór, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.

Teraz przygotuj dwa X roztwór zapasowy, dodając 2 µL PKH 26 do probówki zawierającej rozcieńczalnik C. Natychmiast przenieś pipetą zawiesinę komórkową do świeżo przygotowanego dwa X roztworu barwnika PKH 26, jednocześnie kilkakrotnie odsysając i dozując mieszaninę, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki w barwniku. Po jednej minucie dodaj 1 mL serum inaktywowanego ciepłem, aby zatrzymać pobieranie barwnika przez błony komórkowe. Po odwirowaniu komórek ostrożnie odessij nadosad, nie usuwając osadu.

Następnie zdyspergować osad w czterech mililitrach pożywki kompletnej zawierającej 10% serum inaktywowane termicznie i przenieść zawiesinę komórkową do nowej probówki polipropylenowej. Przemyć komórki dwukrotnie w HBSS z dodatkiem 1% BSA; odpowiednio zbarwione komórki będą wykazywać wyraźny różowy odcień w osadzie. Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w jednym mililitrze HBSS z dodatkiem 1% BSA, należy policzyć komórki, a następnie dostosować objętość, aby uzyskać końcowe stężenie 10⁷ komórek na mililitr. Po zbarwieniu komórek zgodnie z protokołem cytometrii przepływowej opisanym w tabeli, wykorzystać pierwsze pięć probówek do ustawienia parametrów rozproszenia światła w przód (forward scatter) i w bok (side scatter) oraz sygnałów we wszystkich czterech detektorach fluorescencji.

W szczególności w odniesieniu do detektora służącego do monitorowania fluorescencji PKH 26 w probówce drugiej. Należy zweryfikować, czy wszystkie komórki barwione PKH 26 pojawiają się na skali jako pojedynczy symetryczny piki w trzeciej lub czwartej dekadzie, przy niewielkiej liczbie lub braku komórek w ostatnim kanale. Następnie, przy użyciu oprogramowania do kompensacji kolorów i plików w trybie listowym zebranych dla probówek od pierwszej do piątej, należy stworzyć macierz nakładania się kolorów dla każdego fluorochromu w detektorach używanych do monitorowania trzech pozostałych fluorochromów.

Następnie zastosuj tę macierz do pliku w trybie listy dla próbki szóstej, aby zweryfikować, czy obecność znakowania PKH 26 nie wpływa na możliwość wykrycia komórek dodatnich pod względem siedem A a D. Teraz zastosuj nowo utworzoną macierz nakładania kolorów do pliku w trybie listy dla probówki siódmej.

Zidentyfikuj populacje CD3+ CD4- oraz CD3+ CD4+ na wykresie FE względem PC. Potwierdź, że obecność przeciwciał anty-CD3 FE oraz anty-CD4 PC nie wpływa na zdolność wykrywania komórek 7-AD+. Na koniec zastosuj macierz nakładania kolorów dla probówki siedem do pliku w trybie listy dla probówki osiem.

Teraz otwórz program zawierający moduł analizy proliferacji. Załaduj z zestawu danych plik z komórkami stymulowanymi i znakowanymi PKH 26 do analizy. Następnie wybierz parametry analizy; w tym przypadku są to PKH 26 z bramkowaniem na żywe limfocyty 7-AAD negatywne i CD3 pozytywne oraz forward scatter versus side scatter w celu wykluczenia małych fragmentów debris oraz dużych agregatów.

Podczas definiowania tych obszarów należy pamiętać o uwzględnieniu strefy o wysokim rozproszeniu przednim (forward scatter), w której zazwyczaj znajdują się komórki blastyczne. Następnie otwórz kreator proliferacji. Kliknij kartę start, aby otworzyć plik danych, a następnie wgraj niestymulowaną kontrolę pozytywną PKH 26.

Wyznacz położenie piku rodzicielskiego odpowiadającego niepodzielonym komórkom. Przeanalizuj plik, odnotowując wartości położenia i szerokości piku rodzicielskiego. Jeśli wymagana jest stała szerokość piku, zaznacz opcję lock SD, załaduj kontrolę negatywną PKH 26 i dostosuj liczbę generacji, ustawiając kanał piku dla generacji potomnej dimus powyżej komórek kontrolnych PKH 26.

Ustawia to liczbę pokoleń potomnych. Model może zostać precyzyjnie dopasowany po zakończeniu procesu. Ponownie wczytaj plik z komórkami dodatnimi dla PKH 26 po stymulacji.

Jeśli widoczne są rozróżnialne piki generacyjne, wybierz ustawienie floating w opcjach modelu. Jeśli dekady logarytmiczne nie wynoszą dokładnie 4,0, dostosuj odstępy generacyjne zgodnie z opisem w artykule. Następnie przeanalizuj próbkę stymulowaną i potwierdź, że obszar pozycji piku rodzielskiego pozostaje niezmieniony.

Na koniec, dla każdego pliku eksperymentalnego w zbiorze danych, wybierz opcję analizy, aby zastosować utworzony przed chwilą model i zarejestrować pożądane wskaźniki proliferacji wynikające z najlepszego dopasowania dla każdego pliku eksperymentalnego w zbiorze danych. Ta pierwsza seria danych ilustruje wpływ techniki mieszania na rozkłady fluorescencji PKH 26.

Po hodowli komórki mieloidalne U 9 37 barwiono barwnikiem do śledzenia komórek zgodnie z opisaną powyżej metodą; ten pierwszy histogram przedstawia dane z grupy kontrolnej, która nie była barwiona. Ustawienia cytometru dostosowano tak, aby autofluorescencja tych komórek znajdowała się w pierwszej dekadzie, przy braku lub bardzo niewielkiej liczbie komórek gromadzących się w pierwszym kanale. Ten drugi histogram ilustruje prawidłowe barwienie PKH 26.

Szybkie zmieszanie 2x komórek z 2x barwnikiem pozwoliło uzyskać rozkład fluorescencji, który był jasny, jednorodny i symetryczny, przy czym nie odnotowano komórek poza skalą przy ustawieniach przyrządu zastosowanych dla poprzedniego histogramu. Gdy 2x komórek dodano do 2x barwnika bez natychmiastowego mieszania, uzyskano bardziej niejednorodny rozkład fluorescencji. Ta niewielka subpopulacja słabo znakowanych komórek zostałaby błędnie zinterpretowana jako komórki potomne, gdyby pojawiły się w późniejszym punkcie czasowym na końcowym histogramie w tym eksperymencie; niedostateczne zmieszanie wystąpiło również w przypadku przypadkowego dodania 3 µL skoncentrowanego roztoku barwnika w etanolu bezpośrednio do 0,5 mL zawiesiny 2x komórek, co doprowadziło do uzyskania skrajnie słabego i prawostronnie skośnego rozkładu intensywności fluorescencji.

Poniżej przedstawiono typowe wyniki eksperymentu z proliferacji, w którym barwione PKH 20 ludzkie mononuklearne komórki krwi obwodowej hodowano z dodatkiem lub bez dodatku czynników stymulujących: przeciwciał anty-CD3 oraz IL-2. Po 96 godzinach hodowli komórki zebrano i poddano barwieniu kontrastowemu przeciwciałami anty-CD3 FE, anty-CD19 APC oraz seven A a d.

Porównano dwie różne strategie bramkowania; w pierwszej strategii bramkowania wykorzystano wykres kropkowy CD3 względem 7-AAD. 7-AAD posłużył do wyselekcjonowania żywych komórek T CD3-dodatnich i 7-AAD-ujemnych. Następnie, za pomocą regionu rozproszenia przedniego i bocznego, wykluczono duże agregaty, zachowując jednocześnie blastyczne limfocyty.

Zdarzenia z bramki R1+R2 dla kontroli niezbarwionej są przedstawione przez szary histogram, natomiast komórki zabarwione PKH 26, ale niestymulowane, zaznaczono kolorem niebieskim; zwróć uwagę na jasne, symetryczne i jednorodne barwienie żywych, ale niepodzielonych limfocytów T w kontroli niestymulowanej. Dane te zostały poddane bramkowaniu w ten sam sposób, co na poprzedniej rycinie, jednak w tym przypadku komórki stymulowano przeciwciałami anty-CD3 oraz IL-2. Histogram PKH 26 dla zdarzeń z bramki R1+R2 zawiera obecnie głównie komórki podzielone o zmniejszonej intensywności barwienia, reprezentowane przez kolorowe piki odpowiadające kolejnym generacjom komórek potomnych.

Chociaż w niebieskim piku rodzicielskim wciąż pozostają niektóre jasne, niepodzielone komórki. Należy zauważyć, że intensywność komórek o wysokim stopniu podziału nie nakłada się jeszcze na obszar pomiaru komórek niebarwionych, co mogłoby zaburzyć szacowanie parametrów opartych na liczbie komórek w pokoleniach potomnych o najniższej intensywności. Te same dane zostały przeanalizowane jak w dwóch poprzednich zestawach rysunków, jednak do wyboru żywotnych limfocytów T wykorzystano jedynie rozproszenie światła oraz CD3.

Ta strategia bramkowania wyklucza wiele, ale nie wszystkie martwe komórki, co demonstruje niewielka pozostała populacja siedmio-AAD pozytywnych martwych komórek widoczna na wykresach kropkowych CD3 względem siedmio-AAD. Dobór fluorochromów stosowanych do immunofenotypowania może prowadzić do trudnych problemów z kompensacją przy użyciu barwników do śledzenia komórek, ponieważ intensywność barwienia niepodzielonych komórek jest bardzo wysoka. W tym eksperymencie monocyty i limfocyty krwi obwodowej w wieku 24 godzin zostały znakowane PKH 26, a następnie poddane barwieniu przeciwciałami przeciwko CD3 i CD4 oraz barwnikiem do oceny żywotności.

W tej serii danych komórki znakowane 2 µM PKH 26 barwiono przeciwciałami anty-CD3 FITC oraz anty-CD4 APC, a następnie analizowano przy użyciu tej samej strategii bramkowania R1+R2 co poprzednio. Ponieważ PKH 26 wykazuje niewielki przesiew do kanału APC, zdarzenia CD4-dodatnie i CD4-ujemne były wyraźnie rozdzielone, niezależnie od zastosowania kompensacji. Dane te ilustrują, że żywe limfocyty T CD3-dodatnie i CD4-dodatnie pozostały dobrze rozdzielone nawet po zwiększeniu końcowej stężenia PKH 26 do 4 µM. Zastosowanie anty-CD4 PerCP w połączeniu z anty-CD3 FITC, 2 µM PKH 26 oraz barwnika żywotności Draq7 przyniosło znacznie gorsze wyniki ze względu na znaczny przesiew PKH 26 do kanału PerCP.

Komórek CD4 dodatnich i ujemnych nie udało się rozróżnić w danych niekompensowanych, a po zastosowaniu kompensacji były one rozróżnialne jedynie w niewielkim stopniu. Zwiększenie końcowego stężenia PKH 26 do czterech mikromola doprowadziło do całkowitej utraty zdolności rozróżniania zdarzeń CD4 dodatnich od CD4 ujemnych, nawet po zastosowaniu kompensacji. Należy zauważyć, że próbki zawierające lub nie zawierające przeciwciał anty-CD4 na komórkę były w zasadzie identyczne.

Podczas analizy profilu rozcieńczenia barwnika za pomocą oprogramowania do modelowania pików w celu oszacowania częstotliwości komórek w kolejnych generacjach potomnych, pozycje i/lub szerokości kolejnych pików potomnych mogą być stałe lub zmienne w stosunku do wartości dla piku rodzielskiego. Wartości te są szacowane na podstawie niepobudzonej kontroli.

Na przykład ten profil intensywności PKH 26 pochodzi z niepobudzonej 96-godzinnej hodowli od respondenta o umiarkowanej reakcji i został użyty do dostarczenia kreatorowi dopasowania modelu proliferacji pierwszej szacunkowej wartości pozycji i szerokości piku reprezentującego niepodzielone komórki macierzyste. Użycie stałego ustawienia pozycji piku wymaga, aby średnia dla każdego piku generacyjnego stanowiła dokładnie połowę intensywności fluorescencji piku poprzedniego. Ustawienie zmienne (float) dla pozycji piku pozwala na zmianę końcowych pozycji pików generacyjnych w stosunku do oczekiwanych intensywności, w celu uzyskania najlepszego dopasowania.

Podobnie, stałe ustawienie szerokości piku wymaga, aby szerokość każdego piku generacyjnego była taka sama, jak w przypadku piku rodzicielskiego lub piku kontrolnego niestymulowanego. Ustawienie zmienne (float) dla szerokości piku pozwala na niezależną zmianę końcowych szerokości w celu uzyskania najlepszego dopasowania w tej tabeli. Wyniki analiz poprzednich rycin dla dwóch różnych dawców są przedstawione dla tych dawców, u których widoczne były rozróżnialne piki generacyjne.

Najlepsze wartości zredukowanego chi-kwadrat uzyskano, gdy zarówno pozycja, jak i szerokość piku były zmienne; w przypadku profili proliferacji, w których nie są widoczne wyraźne piki generacyjne, zaleca się stosowanie stałego ustawienia pozycji piku. Dane te ilustrują zastosowanie dwóch barwników śledzących do oddzielnego monitorowania historii proliferacji różnych typów komórek odpornościowych w cytometrycznym analizie supresji immunologicznej. Efektorowe limfocyty T (T effector cells) zaznaczone na zielono zostały znakowane CFSE, natomiast regulatorowe limfocyty T (T regulatory cells) zaznaczone na niebiesko zostały znakowane barwnikiem CellView.

Populacje komórek znakowane barwnikiem Claret zmieszano w różnych proporcjach i hodowano w obecności przeciwciał anty-CD3, anty-CD28 oraz napromieniowanych komórek pomocniczych przez 96 godzin. Następnie komórki zebrać i zabarwiono przeciwciałami anty-CD4, PE size 7 oraz barwnikiem Live Dead Violet. Przedstawiono reprezentatywne dane dla stosunku komórek Treg do komórek T efektorowych wynoszącego 0,25:1, po odrzuceniu komórek wykazujących pozytywny wynik dla Live Dead Violet.

Zastosowano bramkę rozproszenia światła, która obejmowała limfocyty i blasty, a wykluczała agregaty i debris, a następnie bramkę dla zdarzeń CD4-dodatnich. Barwienie Cell View Claret pozwoliło na łatwe odróżnienie żywych komórek treg od żywych komórek T efektorowych, które uległy silnej proliferacji; w związku z tym profile proliferacji CFSE DIM dla CFSE-dodatnich komórek T efektorowych oraz Cell View Claret-dodatnich komórek treg analizowano przy użyciu oprogramowania do modelowania szczytów ModFit Peak. Analizie poddano około 25 000 zdarzeń.

Z tej liczby 48% stanowiły żywe efektorowe komórki T, 6% żywe komórki T reg, a pozostałą część martwe komórki, komórki akcesoryjne i debris. Obliczony indeks proliferacji, odzwierciedlający krotność wzrostu liczby komórek w okresie trwania testu, wyniósł 3,85 dla efektorowych komórek T i 1,83 dla komórek T reg. Tutaj przedstawiono wpływ stężenia komórek T reg na indeks proliferacji efektorowych komórek T obliczony na podstawie profilu rozcieńczenia barwnika CFSE.

Wyniki były takie same, niezależnie od tego, czy komórki treg zostały oznakowane barwnikiem cell view claret, czy pozostawiono je niebarwione, co wskazuje, że funkcja komórek treg nie została zmieniona przez barwienie. W analizie śledzenia, zgodnie z oczekiwaniami, zakres proliferacji komórek t effector zwiększał się wraz ze spadkiem stężenia komórek treg. Obliczono również indeksy proliferacji komórek treg na podstawie profili rozcieńczenia barwnika cell view claret przy różnych stosunkach komórek treg do T effector.

Zgodnie z oczekiwaniami, limfocyty Tregs wykazywały minimalną proliferację w obecności samych komórek efektorowych T wraz ze wzrostem ich stężenia. Jednakże zakres proliferacji komórek treg również uległ zwiększeniu. Po obejrzeniu filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak skutecznie wykorzystać barwniki do śledzenia komórek w celu monitorowania ich proliferacji, jak dobrać odpowiednie fluorochromy i kontrole kompensacji kolorów oraz jak wybrać właściwy model do ilościowego określania podziałów komórkowych w oparciu o rozcieńczanie barwnika.

Oprócz tej procedury można zastosować inne metody w celu odpowiedzi na pytania badawcze, takie jak barwienie limfocytów T specyficznych dla antygenu lub sortowanie przepływowe w celu odzyskania komórek macierzystych, które są w stanie spoczynku lub dzielą się powoli. Bardzo dziękujemy za obejrzenie.