Name: Zoptymalizowane metody modelowania barwienia i proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników śledzących komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: Poznaj metodę barwienia komórek fluorescencyjnymi barwnikami śledzącymi i analizę cytometrią przepływową z wykorzystaniem oprogramowania do modelowania szczytów. Technika ta umożliwia bezpośrednią ilościową ocenę podziałów komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby w szczególności podziękować następującym osobom za ich wkład techniczny i intelektualny w opracowanie tych metod na przestrzeni lat: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science oraz PTI Research), Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.) oraz Mary Waugh (Dartmouth Medical School). Chciałyby również podziękować studentom klasy Bowdoin z 2006 roku uczestniczącym w corocznych kursach Metod Badań i Zastosowań Cytometrii Przepływowej, którzy wygenerowali dane przedstawione na Rycini 2.
Cytometria przepływowa została przeprowadzona w Laboratorium Cytometrii Przepływowej Instytutu Nowotworów Roswell Park, które powstało częściowo dzięki grantom na sprzęt z programu NIH Shared Instrument Program i otrzymuje wsparcie z grantu Core Grant (5 P30 CA016056-29) z National Cancer Institute dla Instytutu Nowotworów Roswell Park, a także w Laboratorium Zasobów Cytometrii Przepływowej i Sortowania Komórek Centrum Nowotworów Abramson Uniwersytetu Pensylwanii, które powstało częściowo dzięki grantom na sprzęt z programu NIH Shared Instrument Program i otrzymuje wsparcie z grantu NIH #2P30 CA016520 z National Cancer Institute. Prace przedstawione na Rysunkach 3 i 5 były również częściowo wspierane przez grant SBIR EB00228 z National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) przyznany dla PTI Research, Inc.

1. Ogólne znakowanie błony za pomocą barwnika do śledzenia komórek PKH26 (Ref. 25; Rysunek 1)
<ol>
	<li>W krokach 1.1–1.9 stosować technikę sterylną. Przygotować ok. 107 mononuklearnych komórek krwi obwodowej człowieka lub limfocytów (hPBMC, hPBL), korzystając ze standardowej metody laboratoryjnej z dodatkowym wirowaniem przy 300 x g w celu zminimalizowania zanieczyszczenia płytkami krwi. Resuspendować komórki do stężenia 107/ml w HBSS+1% BSA i umieścić na lodzie, odstawiając 500 μl alikwotu (5x106 komórek) do użycia w Kroku 2.</li>
	<li>Przenieść 5x106 komórek (500 μl) do stożkowatej probówki polipropylenowej o wymiarach 12 x 75 mm. Przemyć raz 3,5 ml HBSS. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając nie więcej niż 15-25 μl pozostałej cieczy, dbając o to, aby nie usunąć komórek. Tę probówkę wykorzystać do przygotowania 2-krotnej zawiesiny komórek w Kroku 1.4.</li>
	<li>Podczas przemywania komórek w Kroku 1.2, dodać 0,5 ml rozcieńczalnika C do znakowania (z zestawu PKH26GL) do stożkowatej probówki polipropylenowej 12 x 75 mm. Tę probówkę wykorzystać do przygotowania 2-krotnego roztworu PKH26 w Kroku 1.5.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml rozcieńczalnika C do znakowania do osadu z przemytych komórek z Kroku 1.2, a następnie odessać i dozować zawiesinę 3-4 razy w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny komórkowej (2-krotne stężenie komórek). Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza i nadmiernego mieszania, co może zmniejszyć żywotność i odzysk komórek.</li>
	<li>Niezwłocznie po przygotowaniu 2-krotnej zawiesiny komórek w Kroku 1.4, przygotować 2-krotny (4 μM) roztwór barwnika, dodając 2,0 μl zapasu barwnika PKH26 o stężeniu 1,0 mM w etanolu (z zestawu PKH26GL) do probówki z rozcieńczalnikiem C przygotowanej w Kroku 1.3, a następnie wymieszać w wstrząsarce typu vortex w celu uzyskania jednorodności.</li>
	<li>Niezwłocznie po przygotowaniu 2-krotnego roztworu barwnika w Kroku 1.5, szybko przenieść 2-krotną zawiesinę komórek z Kroku 1.4 do 2-krotnego roztworu barwnika, jednocześnie odsysając i dozując zawiesinę 3-4 razy, aby całkowicie rozproszyć komórki w barwniku. Nie należy: dodawać barwnika 1,0 mM bezpośrednio do komórek; wlewać 2-krotnej zawiesiny komórek do 2-krotnego roztworu barwnika; ani dodawać 2-krotnej zawiesiny komórek do 2-krotnego roztworu barwnika podczas mieszania w vortexie. Ponieważ barwienie następuje niemal natychmiastowo, takie metody dają mniej jednorodne natężenie barwienia niż metoda zalecana (Rycina 2).</li>
	<li>Po 1 min dodać 1,0 ml surowicy inaktywowanej termicznie lub HBSS+5% BSA, aby zatrzymać pobieranie barwnika przez błony komórkowe. Niedostateczna ilość białka stwarza ryzyko powstania agregatów barwnika, które mogą osadzać się wraz z komórkami podczas etapów przemywania i powodować niezamierzone znakowanie innych komórek obecnych w eksperymencie. Jeśli jako odczyn zatrzymujący ma być użyte medium z 10% surowicą inaktywowaną termicznie (CM) lub HBSS+1% BSA, barwienie należy przeprowadzić w stożkowatej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml i dodać co najmniej 5,0 ml odczynu zatrzymującego, aby zapewnić adsorpcję całego niewkorzystanego barwnika.</li>
	<li>Odwirować znakowane komórki przez 5 min przy ~400 x g. Ostrożnie odessać supernatant, nie usuwając komórek. Przemyć osad dwukrotnie 4 ml CM lub HBSS+1% BSA, dobrze rozbijając osad przed ponownym wirowaniem. Aby zminimalizować przenoszenie barwnika zaadsorbowanego na ściankach probówki i maksymalnie zwiększyć wydajność przemywania, po pierwszej resuspensji przenieść komórki do nowej probówki polipropylenowej. Uwaga: prawidłowo zabarwione komórki będą wykazywać wyraźny różowy odcień w osadzie.</li>
	<li>Resuspendować przemyty osad komórkowy w 1,0 ml HBSS+1% BSA. Policzyć komórki, określić stopień ich odzysku i dostosować objętość, aby uzyskać końcowe stężenie 107/ml. Przy ostrożnym odsysaniu odzysk komórek powinien wynosić ≥85%. Jeśli odzysk komórek wynosi &lt; 70%, przed dalszym postępowaniem należy ustalić przyczynę. Pobrać 150 μl alikwotu (1,5x106 komórek) i umieścić na lodzie do użycia w Kroku 2.</li>
</ol>
2. Przygotowanie instrumentu i kontroli konfiguracji analizy (Tabela 1)
<ol>
	<li>Do każdej z pięciu probótek Eppendorf 1,8 ml (oznaczonych numerami 1, 3, 4, 5 i 7) odnieś 50 μl (5x105) niebarwionych komórek z zawiesiny komórkowej przygotowanej w kroku 1.1. Do trzech probótek (2, 6 i 8) odnieś 50 μl (5x105) komórek PKH26pos z kroku 1.9.</li>
	<li>Do probótek 1-8 dodaj 10 μl bloku IgG (100 μg IgG na probówkę; patrz tabela odczynników) i inkubuj przez 10 min w temperaturze pokojowej (20-25 °C).</li>
	<li>Do probótek 4, 5, 7 i 8 dodaj nasycającą ilość przeciwciał wskazanych w Tabeli 1; wszystkie próbki (probótki 1-8) inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem.</li>
	<li>Do wszystkich próbek dodaj 1,5 ml HBSS+1% BSA, odwirowaj komórki (5 min @ 400 x g) i przemyj raz 1,5 ml HBSS+1% BSA, ostrożnie aspirując znad osadu, aby uniknąć utraty komórek.</li>
	<li>Każdą próbkę resuspenduj w 500 μl HBSS+1% BSA. Jeśli jest to wymagane do analizy na użytym cytometrze, przenieś próbki do probótek z okrągłym dnem o wymiarach 12 x 75 mm. Do probótek 3, 6, 7 i 8 dodaj 10 μl codziennego roztworu roboczego 7-AAD o stężeniu 100 μg/ml (patrz tabela odczynników), zgodnie ze wskazaniami w Tabeli 1. Inkubuj na lodzie przez 30 min przed użyciem do konfiguracji cytometru przepływowego i weryfikacji barwienia (Krok 3).</li>
</ol>
3. Konfiguracja cytometru przepływowego i weryfikacja barwienia
<ol>
	<li>Zweryfikuj prawidłowe działanie cytometru przepływowego, stosując ustalone w laboratorium procedury codziennej kontroli jakości. Upewnij się, że sygnały są łatwo wykrywalne w każdym z używanych okien spektralnych oraz że odpowiedzi detektorów są liniowo proporcjonalne do intensywności sygnału w oknie wykorzystywanym do monitorowania proliferacji14.</li>
	<li>Nacquired dane FSC vs. SSC dla Probówki 1, korzystając z liniowych skal wyświetlania. Dostosuj wzmocnienie każdego detektora tak, aby populacja limfocytów znajdowała się w dolnym lewym kwadracie wykresu kropkowego, nie wykraczała poza skalę w żadnym z parametrów i nie była ucinana przez próg detekcji (thresholding). Zbierz niebramkowane dane FSC vs. SSC dla wszystkich próbek w Krokach 3.3 – 3.7.</li>
	<li>Nacquired dane dla Probówki 1, nie stosując kompensacji kolorów i korzystając z logarytmicznych skal wyświetlania dla wszystkich 4 detektorów fluorescencji. Dostosuj wysokie napięcie (HV) każdego detektora tak, aby autofluorescencja niebarwionych limfocytów mieściła się w skali, przy czym w pierwszym kanale powinno gromadzić się niewiele lub żadne komórki. Wyznacz granicę analizy dla każdego histogramu odpowiadającą najjaśniejszym 2% niebarwionych komórek.</li>
	<li>Bez stosowania kompensacji kolorów i przy ustawieniach HV ustalonych w Krokach 3.2 i 3.3, naacquired dane dla Probówki 2, zbierając FSC, SSC oraz sygnały ze wszystkich 4 detektorów fluorescencji. W przypadku detektora służącego do monitorowania fluorescencji PKH26 sprawdź, czy wszystkie komórki PKH26pos pojawiają się w skali jako pojedynczy symetryczny pik w 3rd-4th dekadzie, z niewielką ilością lub brakiem komórek w ostatnim kanale. Jeśli występują wiele pików lub kształt piku jest skośny, powtórz Krok 1, zwracając szczególną uwagę na minimalizację ilości soli i technikę mieszania (Rysunek 2). W razie potrzeby dostosuj stężenie barwnika.</li>
	<li>Przy ustawieniach ustalonych w Kroku 3.3, naacquired dane dla Probówki 3, zbierając FSC, SSC oraz sygnały ze wszystkich 4 detektorów fluorescencji. W przypadku detektora służącego do monitorowania fluorescencji 7-AAD sprawdź, czy komórki 7-AADpos znajdują się powyżej granicy 2% ustalonej w Kroku 3.3 (t.j. czy komórki nieżywe są dobrze oddzielone od żywych komórek 7-AADneg).</li>
	<li>Przy ustawieniach ustalonych w Kroku 3.3, naacquired dane dla Probówki 4, zbierając FSC, SSC oraz sygnały ze wszystkich 4 detektorów fluorescencji. Sprawdź, czy komórki CD8pos są dobrze oddzielone od komórek niebarwionych (t.j. znajdują się powyżej granicy 2% ustalonej w Kroku 3.3 dla detektora FITC). Powtórz czynność dla Probówki 5 i upewnij się, że komórki CD8pos są dobrze oddzielone od komórek niebarwionych (t.j. znajdują się powyżej granicy 2% ustalonej w Kroku 3.3 dla detektora APC).</li>
	<li>Przy ustawieniach ustalonych w Kroku 3.3, naacquired dane dla Probówek 6, 7 i 8, zbierając FSC, SSC oraz sygnały ze wszystkich 4 detektorów fluorescencji.</li>
	<li>Wykorzystaj pliki w trybie list (list mode) zebrane dla Probówek 1-5 oraz oprogramowanie do kompensacji kolorów, aby stworzyć macierz nakładania się kolorów dla każdego fluorochromu w detektorach używanych do monitorowania trzech pozostałych fluorochromów. Zastosuj tę macierz do pliku w trybie list dla Próbki 6 i zweryfikuj, czy obecność znakowania PKH26 nie zmienia możliwości wykrywania komórek 7-AADpos.</li>
	<li>Zastosuj macierz nakładania się kolorów z Kroku 3.8 do pliku w trybie list dla Próbki 7 i sprawdź, czy: a) na wykresie kropkowym FITC vs. APC można zidentyfikować 3 dobrze oddzielone subpopulacje (CD3negCD4neg, CD3posCD4neg oraz CD3posCD4pos); oraz b) obecność przeciwciał anti-CD3-FITC i anti-CD4-APC nie zmienia możliwości wykrywania komórek 7-AADpos. Jeśli obecność anti-CD3-FITC zmienia górną granicę 2% dla danych zebranych na detektorze PKH26, skoryguj granicę zgodnie z potrzebami.</li>
	<li>Zastosuj macierz nakładania się kolorów z Kroku 3.8 do pliku w trybie list dla Próbki 8. Jeśli obecność znakowania PKH26 zmienia granicę 2% dla detektorów FITC, 7-AAD lub APC w stosunku do granic ustalonych przy użyciu kontroli autofluorescencji w Kroku 3.3, skoryguj granice w razie potrzeby, korzystając z Probówki 7 z Tabeli 1, i zweryfikuj, czy nadal możliwe jest rozróżnienie komórek CD3posCD4pos, CD3posCD4neg oraz CD3negCD4neg przy użyciu skorygowanych granic.</li>
</ol>
4. Wybór modelu proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych poprzez rozcieńczanie barwnika
<ol>
	<li>Wyznacz odstępy między generacjami, który zależą od liczby kanałów i dekad logarytmicznych w cytometrze. W instrumentach cyfrowych wartość ta, zazwyczaj 4 lub 5 dekad, jest określona przez liczbę koszy (bins) w cyfrowym procesorze sygnałów. W instrumentach analogowych, gdzie liczba dekad rzadko jest liczbą całkowitą, dokładne modelowanie wymaga eksperymentalnego wyznaczenia precyzyjnej liczby dekad. W tym celu dane z mieszaniny skalibrowanych kulek fluorescencyjnych o przypisanych przez producenta intensywnościach względnych są pozyskiwane przy tych samych ustawieniach wysokiego napięcia detektora, które zastosowano w eksperymencie. Położenie pików kulek pozwala na kalibrację skali logarytmicznej w przeliczeniu na zakres intensywności na dekadę logarytmiczną. Konkretnie wykonuje się to poprzez wykreślenie numeru kanału dla każdego typu kulek względem logarytmu wartości przypisanej przez producenta. Nachylenie linii prostej najlepiej dopasowanej do danych z kulek wskazuje liczbę jednostek intensywności względnej na kanał. Wartość ta, pomnożona przez liczbę kanałów, będzie stanowiła liczbę dekad logarytmicznych dla pełnej skali, z której można obliczyć liczbę kanałów odpowiadającą dwukrotnemu spadkowi intensywności (tj. odstęp między generacjami potomnymi)14.</li>
	<li>Zdecyduj, czy zastosować stały odstęp między generacjami, czy pozwolić na odstęp zmienny. Ustawienie Standard (stałe) wykorzystuje wartość odstępu generacyjnego wyznaczoną w kroku 4.5 do określenia położenia każdej generacji i jest zazwyczaj stosowane, gdy histogram nie posiada wyraźnych pików. Ustawienie Float pozwala na wyznaczenie pozycji każdego piku generacyjnego na podstawie kształtu histogramu i jest zazwyczaj stosowane, gdy widoczne są rozróżnialne piki generacyjne.</li>
	<li>Zdecyduj, czy zastosować stałą szerokość piku dla wszystkich generacji, czy szerokość zmienną. Stała szerokość wykorzystuje SD obliczoną dla niestymulowanej próbki kontrolnej do modelowania wszystkich generacji i jest zazwyczaj wybierana, gdy próbka nie posiada rozróżnialnych pików generacyjnych. Szerokość zmienna pozwala programowi na niezależną zmianę SD dla każdej generacji i najlepiej sprawdza się przy rozróżnialnych pikach generacyjnych.</li>
	<li>Uruchom program zawierający moduł analizy proliferacji (w tym przypadku ModFit LT wersja 3.3). Załaduj plik stymulowanych komórek PKH26pos ze zbioru danych do analizy (np. stymulowaną 96-godzinną hodowlę komórek PKH26pos z barwieniem kontrastowym zgodnie z procedurą dla probówki nr 8 w Tabeli 1).</li>
	<li>Wybierz parametry analizy, w tym przypadku PKH26 (585/42) z bramkowaniem na żywe (7-AADneg) limfocyty CD3pos oraz FSC vs. SSC w celu wykluczenia małych zanieczyszczeń i dużych agregatów (Rysunek 3). Definiując te obszary, należy pamiętać o uwzględnieniu obszaru wysokiego rozproszenia światła w przód, gdzie zazwyczaj znajdują się blasty, oraz zwrócić uwagę, że ekspresja CD3 może być obniżona w hodowlach stymulowanych.</li>
	<li>Utwórz nowy model proliferacji za pomocą Kreatora Proliferacji (Proliferation Wizard). Używając opcji Open Data File (karta Start), załaduj plik kontrolny niestymulowanych komórek PKH26pos i określ położenie kanału piku w rozkładzie rodzicielskim odpowiadające niepodzielonym komórkom.</li>
	<li>Przeanalizuj plik dla niestymulowanej kontroli PKH26pos, odnotowując wartości położenia piku rodzicielskiego i jego szerokości (odchylenia standardowego). Jeśli pożądana jest stała szerokość piku (SD), zaznacz Lock SD.</li>
	<li>Załaduj kontrolę PKH26neg (np. 96-godzinną hodowlę komórek PKH26neg z barwieniem kontrastowym zgodnie z procedurą dla probówki nr 7 w Tabeli 1). Dostosuj liczbę generacji, ustawiając kanał piku dla najsłabiej fluorescencyjnej generacji powyżej kontroli PKH26neg. Wyznacza to liczbę generacji potomnych, które model może dokładnie dopasować, co zazwyczaj wynosi od 6 do 9 generacji.</li>
	<li>Otwórz plik danych dla próbki stymulowanej (np. stymulowanej 96-godzinnej hodowli komórek PKH26pos z barwieniem kontrastowym zgodnie z procedurą dla probówki nr 8 w Tabeli 1) i potwierdź, że obszary dla położenia piku rodzicielskiego oraz SD zdefiniowane w kroku 4.7 nie uległy zmianie. Jeśli pożądany jest stały odstęp generacyjny, wybierz opcję modelu Standard; w przeciwnym razie wybierz opcję Floating.</li>
	<li>Przeanalizuj każdy plik eksperymentalny w zbiorze danych, korzystając z tego samego modelu zdefiniowanego w kroku 4.9. W celu uzyskania najlepszego dopasowania, określanego zarówno wizualnie, jak i za pomocą zredukowanej wartości chi kwadrat (RCS), mogą być konieczne niewielkie korekty położenia piku rodzicielskiego.</li>
	<li>Zapisz wymagane wskaźniki proliferacji wynikające z najlepszego dopasowania dla każdego pliku eksperymentalnego w zbiorze danych. Pełny opis możliwych wskaźników znajduje się w ref. 22.</li>
</ol>

<ol><li>Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A. Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoon%2C+RY+%22Living+Color%3A+Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting+Protocols%22">Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols</a>. Diamond, R. A., DeMaggio, S. , Springer-Verlag. New York, NY. 302-352 (2000).</li>
<li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+2007%3A+A+Proliferation+of+Probes+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications.</a> Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).</li>
<li>Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+lymphocyte+proliferation%2C+survival+and+differentiation+using+CFSE+time-series+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data.</a> Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking%2C+Persistence%2C+and+Activation+State+of+Adoptively+Transferred+Allogeneic+and+Autologous+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8%2B+T+Cell+Clones+during+Acute+and+Chronic+Infection+of+Rhesus+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques.</a> J. Immunol. 184, 303-314 (2010).</li>
<li>Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Quiescent+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Homing+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties.</a> Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).</li>
<li>Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+aneuploid+populations+within+developing+tumors+are+the+major+determinants+of+tumor+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy.</a> Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).</li>
<li>Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+Molecular+Heterogeneity+of+Breast+Cancers+Correlates+with+Their+Cancer+Stem+Cell+Content%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li>
<li>Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fournié, J. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).</li>
<li>Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+precursor+analysis+of+T-cell+responses+to+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen.</a> J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).</li>
<li>Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cell-tracking+dyes+to+determine+proliferation+precursor+frequencies+of+antigen-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells.</a> Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).</li>
<li>Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-related+immunity+in+prostate+cancer+patients+treated+with+human+recombinant+granulocyte+monocyte-colony+stimulating+factor+%28GM-CSF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF).</a> Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).</li>
<li>Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellVue+Claret%2C+a+New+Far-Red+Dye%2C+Facilitates+Polychromatic+Assessment+of+Immune+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+assay+for+quantitation+of+rare+antigen-specific+T-cells%3A+using+cell-tracking+dyes+to+calculate+precursor+frequencies+for+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation.</a> Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).</li>
<li>Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+lipophilic+tracking+dyes+for+monitoring+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation.</a> Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).</li>
<li>Wallace, P. K., Tario, J. D. Jr, Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., ,, Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Antigen-Driven+Responses+by+Flow+Cytometry%3A+Monitoring+Proliferation+by+Dye+Dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution.</a> Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).</li>
<li>Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Randomized+Trial+of+Ex+vivo+CD40L+Activation+of+a+Dendritic+Cell+Vaccine+in+Colorectal+Cancer+Patients%3A+Tumor-Specific+Immune+Responses+Are+Associated+with+Improved+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival.</a> Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li>
<li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Immune+Cell+Proliferation+and+Cytotoxic+Potential+Using+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry.</a> Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).</li>
<li>Fuse, S., Underwood, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Analysis+of+In+Vivo+CD8%2B+T+Cell+Cytotoxicity+Against+Multiple+Epitopes+using+Multicolor+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry.</a> Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).</li>
<li>Schütz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+artificial+antigen-presenting+cells%3A+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111, 3546-3552 (2008).</li>
<li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+cellular+proliferation+data%3A+Avoid+the+panglossian%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+%28CFSE%29+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259(2010).</li>
<li>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kits for General Cell Membrane Labeling [Internet]. , Sigma-Aldrich. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/mini26bul.Par.0001.File.tmp/mini26bul.pdf">http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/mini26bul.Par.0001.File.tmp/mini26bul.pdf</a> (2012).</li>
<li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li>
<li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory%5BTitle%5D)+AND+%22T+Cells.+Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li>
</ol>

K. Humphrey, J.D. Tario, Jr. oraz P.K. Wallace otrzymali do oceny przedkomercyjne odczynniki do śledzenia komórek od firm Life Technologies, Inc. i BD Biosciences. A.D. Bantly i J.S. Moore otrzymali do oceny przedkomercyjne odczynniki do śledzenia komórek od Life Technologies, Inc. oraz finansowanie od PTI Research, Inc. na przedkomercyjną charakterystykę różnych barwników do śledzenia komórek CellVue. K. Muirhead jest zatrudniony w SciGro, Inc., która świadczy usługi konsultacyjne dla Phanos Technologies, Inc. (właściciela barwników PKH i CellVue) oraz zapewnia wsparcie techniczne dla Sigma-Aldrich i Molecular Targeting Technologies, Inc. (dystrybutorów tych barwników). Produkcja i wolny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Sigma-Aldrich.

Metody opisane w niniejszym opracowaniu są tymi, które w naszych laboratoriach najskuteczniej zapewniają optymalne wyniki przy znakowaniu hPBMC przy użyciu barwników membranowych13,16,18 oraz przy fenotypowaniu subpopulacji limfocytów i śledzeniu ich proliferacji przy użyciu barwników membranowych lub białkowych2,11,13,16,18. Jak pokazano na rysunkach 1 i 2, jasne i jednorodne znakowanie najłatwiej uzyskać poprzez ograniczenie obecności soli fizjologicznych i zastosowanie techniki mieszania, która skutkuje szybką, homogeniczną ekspozycją wszystkich komórek na to samo stężenie barwnika. Ponieważ barwienie barwnikami membranowymi polega na wbudowywaniu się w dwuwarstwę lipidową, inne zmienne zmieniające stężenie wolnego barwnika mogą również wpływać na wydajność znakowania. Na przykład znakowanie w polistyrenowych probówkach z okrągłym dnem skutkuje mniej wydajnym wypłukiwaniem soli przed resuspensją w Diluent C, a także obniżeniem stężenia wolnego barwnika ze względu na adsorpcję barwnika na ściankach probówki, szczególnie przy niższych stężeniach barwnika. Oba czynniki mają tendencję do wywoływania szerszego rozkładu barwienia niż w przypadku znakowania w polipropylenowych probówkach z dnem stożkowym (rysunki 3, 4 oraz nieopublikowane wyniki). Wiek i rodzaj próbki mogą również wpływać na szerokość piku, nawet przy zastosowaniu zoptymalizowanych procedur barwienia. Na przykład wartości CV dla limfocytów PKH26pos wyizolowanych ze świeżo pobranej krwi mieszczą się w zakresie 14-20% (rysunek 3, Ref. 13 i nieopublikowane wyniki), podczas gdy wartości CV dla limfocytów wyizolowanych z próbek krwi 24-godzinnych lub filtrów do aferezy TRIMA mieszczą się w zakresie 25-30% (rysunek 4 i Ref. 18).
Jednorodność barwienia oraz stopień, w jakim nieżywe komórki mogą zostać wykluczone z analizy, wpływają na to, czy w profilu rozcieńczania barwnika widoczne są rozróżnialne piki komórek potomnych, co z kolei wpływa na wybór modelu proliferacji dopasowanego do zaobserwowanych danych (Rysunki 5 i 6). Chociaż w niniejszym opisie jako przykład oprogramowania służącego do generowania takich wskaźników jak indeks proliferacji (Proliferation Index) i częstotliwość prekursorów (Precursor Frequency) wykorzystano ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) (Rysunki 3, 5 i 6; Tabela 3), inne pakiety oprogramowania również zawierają moduły do analizy danych o proliferacji. Należą do nich FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) oraz FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Wszystkie te programy wykorzystują nieliniową analizę najmniejszych kwadratów, aby iteracyjnie znaleźć najlepsze dopasowanie do surowych danych poprzez zmianę położenia, wysokości i SD (lub szerokości) pików Gaussa reprezentujących kolejne pokolenia potomne. Indeks proliferacji (PI) i częstotliwość prekursorów (PF) są najczęściej stosowanymi miarami zakresu proliferacji. PI, zgodnie z definicją w ModFit, jest miarą wzrostu liczby komórek w czasie trwania analizy, analogicznie do „indeksu stymulacji” w teście wbudowywania tymidyny. PF określa frakcję komórek w populacji początkowej, które odpowiedziały na bodziec poprzez proliferację. Zaleca się jednak ostrożność podczas analizy literatury, ponieważ terminologia różni się w zależności od pakietu oprogramowania (np. FlowJo i ModFit stosują różne definicje i obliczenia dla pojęcia „indeks proliferacji”)22.
Kluczowe kwestie omówione tutaj w kontekście znakowania i analizy proliferacji za pomocą barwników błonowych występują również podczas stosowania barwników białkowych. Na przykład, aby uzyskać jednorodne rozmieszczenie i rozróżnialne piki komórek potomnych przy użyciu CFSE (Rysunek 6)2-4,13,18,24, należy zwrócić szczególną uwagę na technikę mieszania oraz na wykluczenie komórek martwych i obumierających. Ważny jest również odpowiedni dobór fluorochromów do fenotypowania i oceny żywotności, aby uniknąć nadmiernego nakładania się widm oraz niemożności rozpoznania komórek pozytywnych pod kątem przeciwciał, szczególnie w przypadku barwników białkowych emitujących w zakresie widzialnym, takich jak CFSE2-4,11,13,16,18. Zmniejszenie stężenia barwnika śledzącego redukuje problemy z kompensacją w sąsiednich kanałach spektralnych, ale ogranicza również liczbę podziałów komórkowych, które można monitorować, zanim intensywność świecenia komórek potomnych zacznie nakładać się na autofluorescencję. Alternatywnie, zastosowanie nowszych barwników do śledzenia komórek, takich jak emitujący w dalekiej czerwieni CellVue Claret (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) lub emitujący w kolorze fioletowym CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY), może zmniejszyć problemy z kompensacją (Rysunek 6). Wreszcie, choć barwniki błonowe zazwyczaj wykazują mniejszą toksyczność11,26, możliwe jest nadmierne oznakowanie komórek barwnikami z obu grup. Dlatego zawsze konieczne jest zweryfikowanie, czy zastosowane stężenie barwnika śledzącego nie zmieniło funkcjonalności śledzonych komórek (Rysunek 6)3,13,16,18.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Nabyte komercyjnie&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>7-aminoaktynomicyna D</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>A9400</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Surowica płodowa bydlęca (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-079</td><td>wolny od wapnia i magnezu, bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Globuliny ludzkie IgG z frakcji Cohn II i III</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>G-4386</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD3-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>349201</td><td>Stężenie nasycenia wyznaczone metodą miareczkowania laboratoryjnego</td></tr><tr><td>przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu CD4-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340672</td><td>Stężenie nasycenia określone metodą miareczkowania laboratoryjnego</td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie przeciw ludzkiemu CD4-PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>348799</td><td>Stężenie nasycenia określone za pomocą miareczkowania laboratoryjnego</td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu CD8-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347313</td><td>Stężenie nasycenia określone metodą miareczkowania laboratoryjnego</td></tr><tr><td>przeciwciało mysie anty-ludzkie CD8-APC</td><td>Caltag (Life Technologies)</td><td>MHCD0805</td><td>Stężenie nasycenia określone za pomocą miareczkowania laboratoryjnego</td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD19-APC</td><td>Caltag (Life Technologies)</td><td>MHCD1905</td><td>Stężenie nasycenia określone metodą miareczkowania laboratoryjnego</td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD25-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340938</td><td>Stężenie nasycenia określone metodą miareczkowania laboratoryjnego</td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu CD127-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>557938</td><td>Stężenie nasycenia wyznaczone metodą miareczkowania laboratoryjnego</td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD3</td><td>eBiosciences</td><td>16-0037-85</td><td>1,0 mg/mL; bez azotku</td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu CD28</td><td>eBiosciences</td><td>16-0289-85</td><td>1,0 mg/mL; bez azotku</td></tr><tr><td>bufor fosforanowo-solny</td><td>Gibco</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do znakowania komórek czerwoną fluorescencją PKH26 zawierający PKH26 w stężeniu 10-3M w EtOH oraz rozcieńczalnik C (Diluent C)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>PKH26GL-1KT &lt;br/&gt; lub&lt;br/&gt; MINI26-1KT</td><td>Procedury opisane w kroku 1 mają zastosowanie również do zestawów zawierających PKH67 lub inne barwniki CellVue </td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania komórek fluorochromem CellVue Claret w zakresie czerwieni dalekiej, zawierający 10-3M CellVue Claret w EtOH oraz rozcieńczalnik Diluent C</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>MINCLARET-1KT lub MIDCLARET-1KT</td><td></td></tr><tr><td>5-(i-6)-karboksyfluoresceiny diestrynian, ester sukcynimidylowy (CFDA-SE)</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>C34554</td><td>Niefluorescencyjny; rozszczepiany przez esterazy błonowe do formy fluorescencyjnego, aminoreaktywnego estru karboksyfluoresceiny z sukcynimidem (CFSE)</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Violet</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki stożkowe 12x75 mm &lt;br/&gt; probówki polipropylenowe &amp;amp; zaślepki </td><td>VWR</td><td>60818-102</td><td>Zapewnia lepszą efektywność barwienia membranowego barwnikiem (zredukowana adsorpcja barwnika; mniejsza utrata komórek podczas aspiracji supernatantu) </td></tr><tr><td>12x75 mm z okrągłym dnem &lt;br/&gt; probówki polistyrenowe</td><td>Becton Dickinson</td><td>21008-936</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy </td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur &lt;br/&gt; LSRFortessa&lt;br/&gt;</td><td>Dowolny cytometr zdolny do detekcji FITC, PKH26 i 7-AAD (odpowiednio wzb. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm i 655 nm) oraz APC (wzb. 633-640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy </td><td>Beckman Coulter</td><td>LSRII CyAn</td><td>Dowolny cytometr zdolny do detekcji FITC, PKH26 i 7-AAD (odpowiednio: wzb. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm i 655 nm) oraz APC (wzb. 633–640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Przygotowane w laboratorium&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>7-aminoaktynominycyna D, &lt;br/&gt; stężony roztwór zapasowy</td><td>Brak danych</td><td>NA</td><td>1 mg/mL w PBS. Zamrozić w alikwotach i przechowywać w temperaturze -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>7-aminoaktynomycyna D, &lt;br/&gt; roztwór roboczy</td><td>Brak danych</td><td>ND</td><td>100 &amp;mu;g/mL w PBS; przygotowywać codziennie z mrożonego roztworu zapasowego o stężeniu 1 mg/ml. </td></tr><tr><td>Blokowanie IgG</td><td>ND</td><td>ND</td><td>HBSS + 10 mg/mL ludzkie globuliny IgG (frakcja Cohn II i III) + 10 mg/mL BSA.</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników do śledzenia komórek

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescencyjne barwniki do śledzenia komórek, w połączeniu z cytometrią przepływową i obrazową, stanowią potężne narzędzia do badania interakcji i losów różnych typów komórek in vitro oraz in vivo.1-5 Choć istnieje dosłownie tysiące publikacji wykorzystujących takie barwniki, do najczęściej spotykanych zastosowań śledzenia komórek należy monitorowanie:
<ol>
	<li>spoczynek, proliferacja i/lub różnicowanie komórek macierzystych i progenitorowych6-8</li>
	<li>antykörper-zależny transfer błonowy9 i/lub proliferacja komórek prekursorowych3,4,10-18 oraz</li>
	<li>funkcja komórek efektorowych i regulacyjnych układu odpornościowego1,18-21.</li>
</ol>
Dostępne w handlu barwniki do śledzenia komórek znacznie różnią się pod względem chemicznym i właściwości fluorescencyjnych, jednak ogromna większość z nich zalicza się do jednej z dwóch klas, w zależności od mechanizmu znakowania komórek. „Barwniki błonowe”, których typowym przedstawicielem jest PKH26, to silnie lipofilowe barwniki, które stabilnie, lecz niekowalencyjnie wbudowują się w błony komórkowe1,2,11. „Barwniki białkowe”, których typowym przedstawicielem jest CFSE, to barwniki aminoreaktywne, które tworzą stabilne wiązania kowalencyjne z białkami komórkowymi4,16,18. Każda z tych klas posiada własne zalety i ograniczenia. Kluczem do ich skutecznego zastosowania, szczególnie w badaniach wielobarwnych, w których wykorzystuje się wiele barwników do śledzenia różnych typów komórek, jest zatem zrozumienie krytycznych kwestii umożliwiających optymalne wykorzystanie każdej z tych klas2-4,16,18,24.
Protokoły zawarte w niniejszej publikacji wskazują na trzy częste przyczyny słabych lub zmiennych wyników podczas stosowania barwników do śledzenia komórek. Są to:
<ol>
	<li>Brak jasnego, jednorodnego i powtarzalnego znakowania. Jest to niezbędny punkt wyjścia dla każdego badania śledzenia komórek, jednak wymaga zwrócenia uwagi na inne zmienne w przypadku stosowania barwników membranowych niż przy użyciu barwników białkowych lub odczynników wiążących w stanie równowagi, takich jak przeciwciała.</li>
	<li>Nieoptymalne kombinacje fluorochromów i/lub brak krytycznych kontroli kompensacji. Fluorescencja barwników do śledzenia jest zazwyczaj 102 - 103 razy silniejsza niż fluorescencja przeciwciał. Niezbędne jest zatem zweryfikowanie, czy obecność barwnika do śledzenia nie upośledza możliwości wykrycia innych stosowanych sond.</li>
	<li>Brak dobrego dopasowania w oprogramowaniu do modelowania pików. Takie oprogramowanie umożliwia ilościowe porównanie odpowiedzi proliferacyjnych w różnych populacjach lub pod wpływem różnych bodźców na podstawie częstotliwości prekursorów lub innych parametrów. Uzyskanie dobrego dopasowania wymaga jednak wykluczenia martwych i obumierających komórek, które mogą zniekształcać profile rozcieńczania barwnika, oraz uzgodnienia założeń leżących u podstaw modelu z charakterystyką obserwowanego profilu rozcieńczania barwnika.</li>
</ol>
Przedstawione tutaj przykłady ilustrują, w jaki sposób zmienne te mogą wpływać na wyniki podczas stosowania barwników błonowych i/lub białkowych do monitorowania proliferacji komórek.

Skuteczne zastosowanie barwników do śledzenia komórek w celu monitorowania funkcji i proliferacji komórek odpornościowych obejmuje kilka krytycznych etapów. Opisujemy metody: 1) uzyskiwania jasnego, jednorodnego i powtarzalnego znakowania barwnikami błonowymi; 2) wyboru fluorochromów i warunków akwizycji danych; oraz 3) wyboru modelu do ilościowego określania proliferacji komórek na podstawie rozcieńczenia barwnika.

Zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników do śledzenia komórek

Fluorescencyjne barwniki do śledzenia komórek, w połączeniu z cytometrią przepływową i obrazową, stanowią potężne narzędzia do badania oddziaływań i losów...

Ogólnym celem tej metody jest wykorzystanie barwników do śledzenia komórek w celu bezpośredniego ilościowego określenia stopnia podziałów komórkowych dla różnych subpopulacji komórek odpornościowych w złożonych populacjach. Osiąga się to poprzez uprzednie znakowanie rodzimej populacji komórek barwnikiem fluorescencyjnym, który wiąże się stabilnie z białkami komórkowymi lub wnika niekowalencyjnie w błony komórkowe; śledzenie znakowanych komórek reagujących na stymulację, barwienie przeciwciałami fluorescencyjnymi oraz analiza przy użyciu wieloparametrycznej cytometrii przepływowej umożliwiają wykrycie zróżnicowanych odpowiedzi wśród analizowanych typów komórek odpornościowych. Kontrole niezbarwione barwnikiem śledzącym służą do ustalenia najniższej intensywności fluorescencji komórek potomnych, którą można odróżnić od autofluorescencji, natomiast kontrole znakowane barwnikiem, ale niestymulowane, są wykorzystywane do ustalenia intensywności fluorescencji, przy której wykrywane będą komórki niepodzielone. Stymulacja zazwyczaj prowadzi do uzyskania szerokiego zakresu intensywności, ponieważ komórki proliferujące w odpowiedzi na stymulację stają się stopniowo słabiej fluorescencyjne, czego nie obserwuje się w przypadku komórek niereagujących.Ostatecznie, wykorzystanie oprogramowania do modelowania pików w celu oszacowania względnej częstości występowania komórek w różnych generacjach pozwala na ilościowe porównanie odpowiedzi proliferacyjnych w różnych populacjach lub pod wpływem różnych bodźców, przy użyciu takich wskaźników jak indeks proliferacji lub częstość występowania prekursorów. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak wbudowywanie trytu, tymidyny lub ekspresja KI 67, jest to, że rozcieńczanie barwnika DI zapewnia bezpośredni pomiar podziału komórek, który można połączyć z innymi pomiarami cytometrycznymi, takimi jak immunofenotypowanie i produkcja cytokin. Wizualna demonstracja metody barwienia barwnikami błonowymi jest pomocna, ponieważ pobieranie barwnika przez komórki zachodzi niezwykle szybko.W związku z tym prawidłowa technika jest kluczowa dla uzyskania jasnego i jednorodnego barwienia. Po izolacji monocytów i limfocytów z krwi obwodowej człowieka należy odwirować zawiesinę przez pięć minut przy 300 ×g w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować zanieczyszczenie płytkami krwi. Następnie osad należy resuspender w stężeniu 10⁷ komórek na mililitr w HBSS z dodatkiem 1%BSA i umieścić na lodzie.Pobrać i zachować 500 µL aliquotu, następnie przenieść kolejny aliquot 500 µL komórek do stożkowej probówki polipropylenowej o wymiarach 12 × 75 mm. Dodać 3,5 ml HBSS i odwirować komórki przez pięć minut przy 400 ×g w temperaturze pokojowej. Podczas płukania dodać 0,5 ml rozpuszczalnika C (labeling vehicle) z zestawu PKH 26 GL do drugiej stożkowej probówki polipropylenowej o wymiarach 12 × 75 mm. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając nie więcej niż 15–25 µL cieczy resztkowej i dbając, aby nie usunąć komórek. Następnie dodać 0,5 ml rozpuszczalnika C (labeling vehicle) do osadu komórkowego, a następnie kilkakrotnie odessać i dozować roztwór, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.Teraz przygotuj dwa X roztwór zapasowy, dodając 2 µL PKH 26 do probówki zawierającej rozcieńczalnik C. Natychmiast przenieś pipetą zawiesinę komórkową do świeżo przygotowanego dwa X roztworu barwnika PKH 26, jednocześnie kilkakrotnie odsysając i dozując mieszaninę, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki w barwniku. Po jednej minucie dodaj 1 mL serum inaktywowanego ciepłem, aby zatrzymać pobieranie barwnika przez błony komórkowe. Po odwirowaniu komórek ostrożnie odessij nadosad, nie usuwając osadu.Następnie zdyspergować osad w czterech mililitrach pożywki kompletnej zawierającej 10% serum inaktywowane termicznie i przenieść zawiesinę komórkową do nowej probówki polipropylenowej. Przemyć komórki dwukrotnie w HBSS z dodatkiem 1% BSA; odpowiednio zbarwione komórki będą wykazywać wyraźny różowy odcień w osadzie. Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w jednym mililitrze HBSS z dodatkiem 1% BSA, należy policzyć komórki, a następnie dostosować objętość, aby uzyskać końcowe stężenie 10⁷ komórek na mililitr. Po zbarwieniu komórek zgodnie z protokołem cytometrii przepływowej opisanym w tabeli, wykorzystać pierwsze pięć probówek do ustawienia parametrów rozproszenia światła w przód (forward scatter) i w bok (side scatter) oraz sygnałów we wszystkich czterech detektorach fluorescencji.W szczególności w odniesieniu do detektora służącego do monitorowania fluorescencji PKH 26 w probówce drugiej. Należy zweryfikować, czy wszystkie komórki barwione PKH 26 pojawiają się na skali jako pojedynczy symetryczny piki w trzeciej lub czwartej dekadzie, przy niewielkiej liczbie lub braku komórek w ostatnim kanale. Następnie, przy użyciu oprogramowania do kompensacji kolorów i plików w trybie listowym zebranych dla probówek od pierwszej do piątej, należy stworzyć macierz nakładania się kolorów dla każdego fluorochromu w detektorach używanych do monitorowania trzech pozostałych fluorochromów.Następnie zastosuj tę macierz do pliku w trybie listy dla próbki szóstej, aby zweryfikować, czy obecność znakowania PKH 26 nie wpływa na możliwość wykrycia komórek dodatnich pod względem siedem A a D. Teraz zastosuj nowo utworzoną macierz nakładania kolorów do pliku w trybie listy dla probówki siódmej.Zidentyfikuj populacje CD3+ CD4- oraz CD3+ CD4+ na wykresie FE względem PC. Potwierdź, że obecność przeciwciał anty-CD3 FE oraz anty-CD4 PC nie wpływa na zdolność wykrywania komórek 7-AD+. Na koniec zastosuj macierz nakładania kolorów dla probówki siedem do pliku w trybie listy dla probówki osiem.Teraz otwórz program zawierający moduł analizy proliferacji. Załaduj z zestawu danych plik z komórkami stymulowanymi i znakowanymi PKH 26 do analizy. Następnie wybierz parametry analizy; w tym przypadku są to PKH 26 z bramkowaniem na żywe limfocyty 7-AAD negatywne i CD3 pozytywne oraz forward scatter versus side scatter w celu wykluczenia małych fragmentów debris oraz dużych agregatów.Podczas definiowania tych obszarów należy pamiętać o uwzględnieniu strefy o wysokim rozproszeniu przednim (forward scatter), w której zazwyczaj znajdują się komórki blastyczne. Następnie otwórz kreator proliferacji. Kliknij kartę start, aby otworzyć plik danych, a następnie wgraj niestymulowaną kontrolę pozytywną PKH 26.Wyznacz położenie piku rodzicielskiego odpowiadającego niepodzielonym komórkom. Przeanalizuj plik, odnotowując wartości położenia i szerokości piku rodzicielskiego. Jeśli wymagana jest stała szerokość piku, zaznacz opcję lock SD, załaduj kontrolę negatywną PKH 26 i dostosuj liczbę generacji, ustawiając kanał piku dla generacji potomnej dimus powyżej komórek kontrolnych PKH 26.Ustawia to liczbę pokoleń potomnych. Model może zostać precyzyjnie dopasowany po zakończeniu procesu. Ponownie wczytaj plik z komórkami dodatnimi dla PKH 26 po stymulacji.Jeśli widoczne są rozróżnialne piki generacyjne, wybierz ustawienie floating w opcjach modelu. Jeśli dekady logarytmiczne nie wynoszą dokładnie 4,0, dostosuj odstępy generacyjne zgodnie z opisem w artykule. Następnie przeanalizuj próbkę stymulowaną i potwierdź, że obszar pozycji piku rodzielskiego pozostaje niezmieniony.Na koniec, dla każdego pliku eksperymentalnego w zbiorze danych, wybierz opcję analizy, aby zastosować utworzony przed chwilą model i zarejestrować pożądane wskaźniki proliferacji wynikające z najlepszego dopasowania dla każdego pliku eksperymentalnego w zbiorze danych. Ta pierwsza seria danych ilustruje wpływ techniki mieszania na rozkłady fluorescencji PKH 26.Po hodowli komórki mieloidalne U 9 37 barwiono barwnikiem do śledzenia komórek zgodnie z opisaną powyżej metodą; ten pierwszy histogram przedstawia dane z grupy kontrolnej, która nie była barwiona. Ustawienia cytometru dostosowano tak, aby autofluorescencja tych komórek znajdowała się w pierwszej dekadzie, przy braku lub bardzo niewielkiej liczbie komórek gromadzących się w pierwszym kanale. Ten drugi histogram ilustruje prawidłowe barwienie PKH 26.Szybkie zmieszanie 2x komórek z 2x barwnikiem pozwoliło uzyskać rozkład fluorescencji, który był jasny, jednorodny i symetryczny, przy czym nie odnotowano komórek poza skalą przy ustawieniach przyrządu zastosowanych dla poprzedniego histogramu. Gdy 2x komórek dodano do 2x barwnika bez natychmiastowego mieszania, uzyskano bardziej niejednorodny rozkład fluorescencji. Ta niewielka subpopulacja słabo znakowanych komórek zostałaby błędnie zinterpretowana jako komórki potomne, gdyby pojawiły się w późniejszym punkcie czasowym na końcowym histogramie w tym eksperymencie; niedostateczne zmieszanie wystąpiło również w przypadku przypadkowego dodania 3 µL skoncentrowanego roztoku barwnika w etanolu bezpośrednio do 0,5 mL zawiesiny 2x komórek, co doprowadziło do uzyskania skrajnie słabego i prawostronnie skośnego rozkładu intensywności fluorescencji.Poniżej przedstawiono typowe wyniki eksperymentu z proliferacji, w którym barwione PKH 20 ludzkie mononuklearne komórki krwi obwodowej hodowano z dodatkiem lub bez dodatku czynników stymulujących: przeciwciał anty-CD3 oraz IL-2. Po 96 godzinach hodowli komórki zebrano i poddano barwieniu kontrastowemu przeciwciałami anty-CD3 FE, anty-CD19 APC oraz seven A a d.Porównano dwie różne strategie bramkowania; w pierwszej strategii bramkowania wykorzystano wykres kropkowy CD3 względem 7-AAD. 7-AAD posłużył do wyselekcjonowania żywych komórek T CD3-dodatnich i 7-AAD-ujemnych. Następnie, za pomocą regionu rozproszenia przedniego i bocznego, wykluczono duże agregaty, zachowując jednocześnie blastyczne limfocyty.Zdarzenia z bramki R1+R2 dla kontroli niezbarwionej są przedstawione przez szary histogram, natomiast komórki zabarwione PKH 26, ale niestymulowane, zaznaczono kolorem niebieskim; zwróć uwagę na jasne, symetryczne i jednorodne barwienie żywych, ale niepodzielonych limfocytów T w kontroli niestymulowanej. Dane te zostały poddane bramkowaniu w ten sam sposób, co na poprzedniej rycinie, jednak w tym przypadku komórki stymulowano przeciwciałami anty-CD3 oraz IL-2. Histogram PKH 26 dla zdarzeń z bramki R1+R2 zawiera obecnie głównie komórki podzielone o zmniejszonej intensywności barwienia, reprezentowane przez kolorowe piki odpowiadające kolejnym generacjom komórek potomnych.Chociaż w niebieskim piku rodzicielskim wciąż pozostają niektóre jasne, niepodzielone komórki. Należy zauważyć, że intensywność komórek o wysokim stopniu podziału nie nakłada się jeszcze na obszar pomiaru komórek niebarwionych, co mogłoby zaburzyć szacowanie parametrów opartych na liczbie komórek w pokoleniach potomnych o najniższej intensywności. Te same dane zostały przeanalizowane jak w dwóch poprzednich zestawach rysunków, jednak do wyboru żywotnych limfocytów T wykorzystano jedynie rozproszenie światła oraz CD3.Ta strategia bramkowania wyklucza wiele, ale nie wszystkie martwe komórki, co demonstruje niewielka pozostała populacja siedmio-AAD pozytywnych martwych komórek widoczna na wykresach kropkowych CD3 względem siedmio-AAD. Dobór fluorochromów stosowanych do immunofenotypowania może prowadzić do trudnych problemów z kompensacją przy użyciu barwników do śledzenia komórek, ponieważ intensywność barwienia niepodzielonych komórek jest bardzo wysoka. W tym eksperymencie monocyty i limfocyty krwi obwodowej w wieku 24 godzin zostały znakowane PKH 26, a następnie poddane barwieniu przeciwciałami przeciwko CD3 i CD4 oraz barwnikiem do oceny żywotności.W tej serii danych komórki znakowane 2 µM PKH 26 barwiono przeciwciałami anty-CD3 FITC oraz anty-CD4 APC, a następnie analizowano przy użyciu tej samej strategii bramkowania R1+R2 co poprzednio. Ponieważ PKH 26 wykazuje niewielki przesiew do kanału APC, zdarzenia CD4-dodatnie i CD4-ujemne były wyraźnie rozdzielone, niezależnie od zastosowania kompensacji. Dane te ilustrują, że żywe limfocyty T CD3-dodatnie i CD4-dodatnie pozostały dobrze rozdzielone nawet po zwiększeniu końcowej stężenia PKH 26 do 4 µM. Zastosowanie anty-CD4 PerCP w połączeniu z anty-CD3 FITC, 2 µM PKH 26 oraz barwnika żywotności Draq7 przyniosło znacznie gorsze wyniki ze względu na znaczny przesiew PKH 26 do kanału PerCP.Komórek CD4 dodatnich i ujemnych nie udało się rozróżnić w danych niekompensowanych, a po zastosowaniu kompensacji były one rozróżnialne jedynie w niewielkim stopniu. Zwiększenie końcowego stężenia PKH 26 do czterech mikromola doprowadziło do całkowitej utraty zdolności rozróżniania zdarzeń CD4 dodatnich od CD4 ujemnych, nawet po zastosowaniu kompensacji. Należy zauważyć, że próbki zawierające lub nie zawierające przeciwciał anty-CD4 na komórkę były w zasadzie identyczne.Podczas analizy profilu rozcieńczenia barwnika za pomocą oprogramowania do modelowania pików w celu oszacowania częstotliwości komórek w kolejnych generacjach potomnych, pozycje i/lub szerokości kolejnych pików potomnych mogą być stałe lub zmienne w stosunku do wartości dla piku rodzielskiego. Wartości te są szacowane na podstawie niepobudzonej kontroli.Na przykład ten profil intensywności PKH 26 pochodzi z niepobudzonej 96-godzinnej hodowli od respondenta o umiarkowanej reakcji i został użyty do dostarczenia kreatorowi dopasowania modelu proliferacji pierwszej szacunkowej wartości pozycji i szerokości piku reprezentującego niepodzielone komórki macierzyste. Użycie stałego ustawienia pozycji piku wymaga, aby średnia dla każdego piku generacyjnego stanowiła dokładnie połowę intensywności fluorescencji piku poprzedniego. Ustawienie zmienne (float) dla pozycji piku pozwala na zmianę końcowych pozycji pików generacyjnych w stosunku do oczekiwanych intensywności, w celu uzyskania najlepszego dopasowania.Podobnie, stałe ustawienie szerokości piku wymaga, aby szerokość każdego piku generacyjnego była taka sama, jak w przypadku piku rodzicielskiego lub piku kontrolnego niestymulowanego. Ustawienie zmienne (float) dla szerokości piku pozwala na niezależną zmianę końcowych szerokości w celu uzyskania najlepszego dopasowania w tej tabeli. Wyniki analiz poprzednich rycin dla dwóch różnych dawców są przedstawione dla tych dawców, u których widoczne były rozróżnialne piki generacyjne.Najlepsze wartości zredukowanego chi-kwadrat uzyskano, gdy zarówno pozycja, jak i szerokość piku były zmienne; w przypadku profili proliferacji, w których nie są widoczne wyraźne piki generacyjne, zaleca się stosowanie stałego ustawienia pozycji piku. Dane te ilustrują zastosowanie dwóch barwników śledzących do oddzielnego monitorowania historii proliferacji różnych typów komórek odpornościowych w cytometrycznym analizie supresji immunologicznej. Efektorowe limfocyty T (T effector cells) zaznaczone na zielono zostały znakowane CFSE, natomiast regulatorowe limfocyty T (T regulatory cells) zaznaczone na niebiesko zostały znakowane barwnikiem CellView.Populacje komórek znakowane barwnikiem Claret zmieszano w różnych proporcjach i hodowano w obecności przeciwciał anty-CD3, anty-CD28 oraz napromieniowanych komórek pomocniczych przez 96 godzin. Następnie komórki zebrać i zabarwiono przeciwciałami anty-CD4, PE size 7 oraz barwnikiem Live Dead Violet. Przedstawiono reprezentatywne dane dla stosunku komórek Treg do komórek T efektorowych wynoszącego 0,25:1, po odrzuceniu komórek wykazujących pozytywny wynik dla Live Dead Violet.Zastosowano bramkę rozproszenia światła, która obejmowała limfocyty i blasty, a wykluczała agregaty i debris, a następnie bramkę dla zdarzeń CD4-dodatnich. Barwienie Cell View Claret pozwoliło na łatwe odróżnienie żywych komórek treg od żywych komórek T efektorowych, które uległy silnej proliferacji; w związku z tym profile proliferacji CFSE DIM dla CFSE-dodatnich komórek T efektorowych oraz Cell View Claret-dodatnich komórek treg analizowano przy użyciu oprogramowania do modelowania szczytów ModFit Peak. Analizie poddano około 25 000 zdarzeń.Z tej liczby 48% stanowiły żywe efektorowe komórki T, 6% żywe komórki T reg, a pozostałą część martwe komórki, komórki akcesoryjne i debris. Obliczony indeks proliferacji, odzwierciedlający krotność wzrostu liczby komórek w okresie trwania testu, wyniósł 3,85 dla efektorowych komórek T i 1,83 dla komórek T reg. Tutaj przedstawiono wpływ stężenia komórek T reg na indeks proliferacji efektorowych komórek T obliczony na podstawie profilu rozcieńczenia barwnika CFSE.Wyniki były takie same, niezależnie od tego, czy komórki treg zostały oznakowane barwnikiem cell view claret, czy pozostawiono je niebarwione, co wskazuje, że funkcja komórek treg nie została zmieniona przez barwienie. W analizie śledzenia, zgodnie z oczekiwaniami, zakres proliferacji komórek t effector zwiększał się wraz ze spadkiem stężenia komórek treg. Obliczono również indeksy proliferacji komórek treg na podstawie profili rozcieńczenia barwnika cell view claret przy różnych stosunkach komórek treg do T effector.Zgodnie z oczekiwaniami, limfocyty Tregs wykazywały minimalną proliferację w obecności samych komórek efektorowych T wraz ze wzrostem ich stężenia. Jednakże zakres proliferacji komórek treg również uległ zwiększeniu. Po obejrzeniu filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak skutecznie wykorzystać barwniki do śledzenia komórek w celu monitorowania ich proliferacji, jak dobrać odpowiednie fluorochromy i kontrole kompensacji kolorów oraz jak wybrać właściwy model do ilościowego określania podziałów komórkowych w oparciu o rozcieńczanie barwnika.Oprócz tej procedury można zastosować inne metody w celu odpowiedzi na pytania badawcze, takie jak barwienie limfocytów T specyficznych dla antygenu lub sortowanie przepływowe w celu odzyskania komórek macierzystych, które są w stanie spoczynku lub dzielą się powoli. Bardzo dziękujemy za obejrzenie.

optimized-staining-proliferation-modeling-methods-for-cell-division

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziału komórek z wykorzystaniem barwników do śledzenia komórek

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Ten protokół opisuje wykorzystanie wychwytu bromodeoksyurydyny (BrdU), aby umożliwić czasowe śledzenie komórek, które były w fazie S w określonym momencie. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciałami ułatwia szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji

Makrofagi to plastyczne komórki układu krwiotwórczego, które odgrywają kluczową rolę w ochronnej odporności i homeostazie. W tym raporcie opisujemy zoptymalizowane techniki in vitro do fenotypowego i funkcjonalnego charakteryzowania makrofagów regulatorowych naciekających przeszczepy, które gromadzą się w przeszczepionym narządzie w warunkach tolerogennych.

Charakterystyka funkcjonalna makrofagów regulatorowych, które hamują odporność reaktywną przeszczepu

Ten protokół opisuje użycie trzech różnych metod analizy proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi. Obejmuje to stosowanie konwencjonalnego zliczania komórek, żywotności komórek na podstawie luminescencji oraz zliczania komórek za pomocą obrazowania komórek. Każdy z nich oferuje korzyści w zakresie powtarzalnego pomiaru proliferacji komórek.

Porównanie trzech różnych metod określania proliferacji komórek w liniach komórkowych raka piersi

Ten protokół opisuje, jak izolować keratynocyty skóry od modeli mysich, barwić przeciwciałami znakowanymi metalem oraz analizować barwione komórki za pomocą cytometrii masowej w celu profilowania wzorca ekspresji interesujących białek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej

Proliferacja jest kluczowym elementem funkcji komórkowej i powszechnym odczytem używanym do oceny potencjalnej toksyczności nowych leków. Pomiar proliferacji jest zatem często stosowanym testem w biologii komórki. Poniżej przedstawiamy prostą, wszechstronną metodę pomiaru proliferacji, którą można zastosować w komórkach adherentnych i nieadherentnych.

Pomiar proliferacji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych za pomocą chemii Click

Podziały komórek mogą być wizualizowane w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencyjnie znakowanych białek i mikroskopii poklatkowej. Korzystając z przedstawionego tutaj protokołu, użytkownicy mogą analizować dynamikę czasu podziału komórki, składanie wrzeciona mitotycznego oraz kongresację i segregację chromosomów. Defekty tych zdarzeń po knockdownie genu za pośrednictwem interferencji RNA (RNAi) można ocenić i określić ilościowo.

Zastosowanie komórek Drosophila S2 do obrazowania podziału komórek na żywo

Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów są wyrafinowanym systemem modelowym do badań podstawowych i translacyjnych. Ten artykuł dotyczący metod szczegółowo opisuje zastosowanie multipleksowanego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek do jednoczesnej oceny kinetycznej różnych fenotypów organoidów.

Multipleksowane obrazowanie żywych komórek w celu uzyskania odpowiedzi na leki w organoidalnych modelach raka pochodzących od pacjenta

Zaprezentowano prostą i specyficzną metodę fluorescencyjnego znakowania oraz zwiększonej detekcji białek powierzchniowych komórek bez konieczności przeprowadzenia etapu frakcjonowania. Różnice w zawartości białek powierzchniowych komórek analizowano przy użyciu elektroforezy dwuwymiarowej (2-D) oraz technologii Ettan™ DIGE.

Selektywne znakowanie białek powierzchni komórkowych z użyciem minimalnych barwników fluorescencyjnych CyDye DIGE Fluor

Poznaj metodę barwienia komórek fluorescencyjnymi barwnikami śledzącymi i analizę cytometrią przepływową z wykorzystaniem oprogramowania do modelowania szczytów. Technika ta umożliwia bezpośrednią ilościową ocenę podziałów komórek immunologicznych.

Zoptymalizowane metody modelowania barwienia i proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników śledzących komórki (Wideo) | JoVE Journal

Zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników do śledzenia komórek

Przeglądaj więcej filmów