Zoptymalizowane metody modelowania barwienia i proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników śledzących komórki

Ogólnym celem tej metody jest wykorzystanie barwników śledzących komórki do bezpośredniego ilościowego określenia zakresu podziału komórek dla różnych podzbiorów komórek odpornościowych w złożonych populacjach. Osiąga się to poprzez pierwsze znakowanie populacji komórek macierzystych barwnikiem fluorescencyjnym, o którym wiadomo, że daje stabilne wiązanie z białkami komórkowymi lub interkaluje niekowalencyjnie do błon komórkowych w celu śledzenia komórek znakowanych barwnikiem, które reagują na liczniki stymulacji, barwienie przeciwciałami fluorescencyjnymi i analizę za pomocą wieloparametrowej cytometrii przepływowej umożliwia wykrycie zróżnicowanych odpowiedzi między stymulowanymi typami komórek odpornościowych, Ale niebarwione kontrole barwnika śledzącego są używane do ustalenia najniższej intensywności fluorescencji komórek potomnych, którą można odróżnić od barwnika śledzącego autofluorescencję, ale niestymulowane kontrole są następnie używane do ustalenia intensywności fluorescencji, przy której zostaną wykryte niepodzielone komórki. Stymulacja zazwyczaj powoduje szeroki zakres intensywności, ponieważ komórki proliferujące w odpowiedzi stają się coraz ciemniejsze, ale osoby, które nie reagują, tego nie robią.

Ostatecznie zastosowanie oprogramowania do modelowania pików w celu oszacowania względnej częstości występowania komórek w różnych pokoleniach może umożliwić ilościowe porównanie reakcji proliferacyjnych w różnych populacjach lub bodźcach przy użyciu takich wskaźników, jak wskaźnik proliferacji lub częstotliwość prekursorów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tritiated, inkorporacja thy lub ekspresja KI 67, jest to, że rozcieńczenie DI zapewnia bezpośrednią miarę podziału komórki, który można połączyć z innymi pomiarami cytometrii przepływowej ME, takimi jak immunofenotypowanie i produkcja cytokin. Wizualna demonstracja metody barwienia barwnikiem membranowym jest pomocna, ponieważ pobieranie barwnika przez komórki jest niezwykle szybkie.

W związku z tym dobra technika jest kluczem do uzyskania jasnego, jednorodnego barwienia. Po izolacji komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej wiruj przez pięć minut w temperaturze 300 razy G i temperaturze pokojowej, aby zminimalizować zanieczyszczenie płytek krwi. Następnie ponownie zawieś granulki w 10 do siódmych komórek na mililitr w HBSS plus 1% BSA i umieść je na lodzie.

Wyjmij i zarezerwuj Eloqua o pojemności 500 mikrolitrów, a następnie przenieś kolejną porcję komórek o pojemności 500 mikrolitrów do stożkowej rurki polipropylenowej o wymiarach 12 na 75 milimetrów. Dodaj 3,5 mililitra HBSS i wiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 400 razy G i pokojowej podczas prania, dodaj 0,5 mililitra rozcieńczalnika C z zestawu PKH 26 GL do kolejnej stożkowej rurki polipropylenowej o wymiarach 12 na 75 mililitrów, ostrożnie zasysaj super natin, pozostawiając nie więcej niż 15 do 25 mikrolitrów pozostałego płynu i uważając, aby nie usunąć żadnych komórek. Następnie dodaj 0,5 mililitra rozcieńczalnika C do osadu komórkowego i zassaj i dozuj roztwór kilka razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.

Teraz przygotuj dwa buliony XD, dodając dwa mikrolitry PKH 26 do probówki zawierającej rozcieńczalnik C. Dopiero teraz natychmiast odpipetuj zawiesinę komórek do świeżo przygotowanych dwóch roztworów barwnika XPKH 26 i jednocześnie zasysaj i dozuj domieszkanie kilka razy, aby równomiernie rozproszyć komórki w całym barwniku. Po minucie dodaj jeden mililitr inaktywowanej termicznie surowicy, aby zatrzymać wchłanianie barwnika do błon komórkowych. Po odwirowaniu komórek ostrożnie zassać supernatant bez usuwania osadu.

Następnie rozproszyć osad w czterech mililitrach kompletnego podłoża zawierającego 10% inaktywowanej termicznie surowicy i przenieść zawiesinę komórkową do świeżej probówki polipropylenowej. Umyj komórki dwukrotnie w HBSS plus 1% BSA, odpowiednio wybarwione komórki będą wykazywać wyraźny różowy odcień w granulce Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w jednym mililitrze HBSS plus 1% BSA, policz komórki, a następnie dostosuj objętość, aby uzyskać końcowe stężenie od 10 do siódmych komórek na mililitr. Po wybarwieniu komórek zgodnie z protokołem cytometrii przepływowej przedstawionym w tabeli, użyj pierwszych pięciu probówek, aby ustawić parametry rozproszenia do przodu i rozpraszania bocznego oraz sygnały we wszystkich czterech detektorach fluorescencyjnych.

W szczególności dla detektora służącego do monitorowania fluorescencji PKH 26 w rurze drugiej. Sprawdź, czy wszystkie barwione komórki PKH 26 pojawiają się na skali jako pojedynczy symetryczny pik w trzeciej do czwartej dekadzie z kilkoma lub żadnymi komórkami w ostatnim kanale. Następnie użyj oprogramowania do kompensacji kolorów i plików trybu listy zebranych dla probówek od pierwszej do piątej, aby ustalić matrycę nakładania się kolorów dla każdego fluro w detektorach używanych do monitorowania trzech pozostałych fluorochromów.

Następnie zastosuj tę macierz do pliku trybu listy dla próbki szóstej. Sprawdzenie, czy obecność oznakowania PKH 26 nie zmienia zdolności do wykrywania siedmiu komórek A i D dodatnich. Teraz zastosuj tę właśnie ustaloną macierz nakładania się kolorów do pliku trybu listy dla rury siódmej.

Zidentyfikuj CD trzy dodatnie CD cztery ujemne i CD trzy dodatnie CD cztery dodatnie populacje na wykresie FE i PC. Upewnij się, że obecność anty CD 3, FE i anty CD four A PC nie zmienia zdolności wykrywania siedmiu komórek A a D dodatnich. Na koniec zastosuj macierz nakładania się kolorów dla rury siódmej do pliku trybu listy dla rury ósmej.

Teraz otwórz program zawierający moduł analizy proliferacji. Załaduj stymulowany plik barwiony PKH 26 ze zbioru danych, który ma być analizowany. Następnie wybierz parametry do analizy w tym przypadku, PKH 26 bramkowany na żywotnych siedmiu ujemnych cd, trzech dodatnich limfocytach i rozproszeniu do przodu w stosunku do rozproszenia bocznego w celu wykluczenia małych zanieczyszczeń i dużych agregatów.

Definiując te obszary, należy pamiętać, aby uwzględnić obszar wysokiego rozproszenia z przodu, w którym zwykle występują wybuchy. Następnie otwórz kreatora proliferacji. Kliknij kartę start, aby otworzyć plik danych, a następnie załaduj niestymulowaną kontrolę pozytywną PKH 26.

Określ położenie piku rodzicielskiego odpowiadającego niepodzielonym komórkom. Przeanalizuj plik, zwracając uwagę na wartości pozycji i szerokości piku rodzicielskiego. Jeśli pożądana jest stała szerokość piku, sprawdź blokadę SD załaduj kontrolę ujemną P KH 26 i dostosuj liczbę generacji, ustawiając kanał szczytowy dla generacji potomnej dimus powyżej komórek ujemnych PKH 26.

Określa to liczbę pokoleń potomnych. Model może być dokładnie dopasowany po ukończeniu. Ponownie załaduj stymulowany plik dodatni PKH 26.

Jeśli widoczne są wyraźne szczyty pokoleniowe, wybierz opcję pływającego ustawienia pod modelem. Jeśli logarytm dekad nie wynosi dokładnie 4,0, dostosuj odstępy pokoleniowe, jak omówiono w artykule. Teraz przeanalizuj stymulowaną próbkę i potwierdź, że region dla pozycji piku rodzicielskiego pozostaje niezmieniony

Na koniec wybierz pozycję Analizuj dla każdego pliku eksperymentalnego w zestawie danych, który ma zostać zastosowany. Model właśnie utworzył i rejestruje pożądane metryki proliferacji wynikające z najlepszego dopasowania do każdego pliku eksperymentalnego w zestawie danych. Ta pierwsza seria danych ilustruje wpływ techniki mieszania na rozkład fluorescencji PKH 26.

Podczas hodowli komórki szpikowe U 9 37 zostały wybarwione barwnikiem śledzącym komórki przy użyciu właśnie opisanej metody, ten pierwszy histogram pokazuje niebarwione dane kontrolne. Ustawienia cytometru zostały dostosowane tak, aby umieścić autofluorescencję z tych komórek w pierwszej dekadzie, przy braku lub bardzo małej liczbie komórek gromadzących się w pierwszym kanale. Ten drugi histogram ilustruje dobre barwienie PKH 26.

Szybkie zmieszanie dwóch komórek x z dwoma barwnikami x dało rozkład fluorescencji, który był jasny, jednorodny i symetryczny, ale nie zawierał komórek poza skalą przy ustawieniach instrumentu użytych dla poprzedniego histogramu. Gdy dwie komórki x dodano do dwóch barwników x bez natychmiastowego mieszania, uzyskano bardziej niejednorodny rozkład fluorescencji. Ta mała subpopulacja słabo oznakowanych komórek zostałaby błędnie zinterpretowana jako komórki potomne, gdyby były obecne w późniejszym punkcie czasowym na końcowym histogramie z tego eksperymentu, słabe mieszanie wystąpiło również, gdy trzy mikrolitry skoncentrowanego barwnika etanolowego zostały przypadkowo dodane bezpośrednio do 0,5 mililitra zawiesiny dwóch komórek x, co dało wyjątkowo ciemny i skośny w prawo rozkład intensywności fluorescencji.

Oto typowe wyniki eksperymentu proliferacji, w którym hodowano ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej barwione PKH 20 ze stymulatorem lub bez. Pokazane są odczynniki Anti CD three i IL dwa. Po 96 godzinach hodowli komórki pobrano i wybarwiono przeciw anty CD, trzema FE anty CD 19 A PC i siedmioma A a d.

Dwie różne strategie bramkowania zostały porównane w pierwszej strategii bramkowania, wykres punktowy CD trzy kontra siedem. AA D użyto do wybrania żywych siedmiu a d ujemnych CD trzech dodatnich limfocytów T. Region rozproszenia przedniego i bocznego został następnie wykorzystany do wyodrębnienia dużych agregatów, przy jednoczesnym uwzględnieniu limfocytów wybuchowych.

R jeden plus R dwa bramkowane zdarzenia dla niebarwionej kontroli są reprezentowane przez szary histogram i PKH 26 barwione, ale niestymulowane komórki są w niebieskiej nucie, jasnym, symetrycznym, jednorodnym barwieniu dla żywotnych, ale niepodzielonych komórek T w niestymulowanej kontroli. Dane te zostały bramkowane w taki sam sposób, jak na poprzednim rysunku, ale w tym przypadku komórki były stymulowane anty CD 3 i IL 2. Histogram PKH 26 dla zdarzeń bramkowanych R jeden plus R dwa zawiera teraz głównie podzielone komórki o zmniejszonej intensywności reprezentowanej przez kolorowe piki dla każdego pokolenia potomnego.

Chociaż niektóre jasne, niepodzielone komórki nadal pozostają w niebieskim piku rodzicielskim. Należy zauważyć, że intensywność silnie podzielonych komórek nie pokrywa się jeszcze z regionem, w którym mierzone są niebarwione komórki, co zakłóciłoby oszacowanie wskaźników na podstawie liczby komórek w pokoleniach potomnych o najniższej intensywności. Te same dane zostały przeanalizowane, co poprzednie dwa zestawy figurek, ale tylko rozproszenie światła i CD trzy zostały użyte do selekcji żywotnych limfocytów T.

Ta strategia bramkowania wyklucza wiele, ale nie wszystkie martwe komórki, jak pokazuje niewielka populacja resztkowa siedmiu martwych komórek A a D dodatnich pozostających na wykresach kropkowych CD trzy w porównaniu z siedmioma A A D. Wybór fluorochromów stosowanych do immunofenotypowania może stwarzać trudne problemy z kompensacją podczas korzystania z matryc śledzących komórki, ponieważ intensywność barwienia niepodzielonych komórek jest niezwykle jasna. W tym eksperymencie 24-godzinne komórki jednojądrzaste krwi obwodowej znakowano PKH 26, a następnie barwieno przeciw przeciwciałami przeciwko CD 3 i CD 4 oraz barwnikiem żywotności.

W tej serii danych komórki oznaczone dwoma mikromolowymi PKH 26 zostały wybarwione przeciw CD trzy FZ siedem A A D i anty CD cztery A PC, a następnie przeanalizowane przy użyciu tej samej strategii bramkowania R jeden plus R dwa jak poprzednio, ponieważ PKH 26 w niewielkim stopniu nakłada się na kanał A PC, CD cztery pozytywne i negatywne zdarzenia zostały jasno rozwiązane, niezależnie od tego, czy zastosowano kompensatę, czy nie. Dane te ilustrują, w jaki sposób żywotne limfocyty T CD trzy dodatnie CD cztery pozostawały dobrze rozwiązane, nawet gdy końcowe stężenie PKH 26 zostało zwiększone do czterech mikromolowców. Zastosowanie anty CD 4 na CP w połączeniu z anty CD three FE dwa mikromolowe PKH 26 i matryca żywotności do pro 3 dało znacznie gorsze wyniki ze względu na znaczne nakładanie się PKH 26 na kanał CP.

CD cztery dodatnie i ujemne komórki nie mogły być oddzielone od siebie w nieskompensowanych danych i były tylko marginalnie rozdzielone po zastosowaniu kompensacji. Zwiększenie końcowego stężenia PKH 26 do czterech mikromolowców spowodowało całkowitą utratę zdolności do oddzielenia CD 4 dodatnich od CD 4 zdarzeń ujemnych, nawet po zastosowaniu kompensacji. Zauważ, że próbki, w tym lub bez anty CD 4 na CP, były zasadniczo identyczne.

Gdy profil rozcieńczenia barwnika jest analizowany przy użyciu oprogramowania do modelowania pików w celu oszacowania częstotliwości komórek w kolejnych generacjach potomnych, pozycje i/lub szerokości kolejnych pików potomnych mogą być stałe lub pływające. W odniesieniu do wartości dla piku rodzicielskiego. Wartości te są szacowane na podstawie niestymulowanej kontroli.

Na przykład, ten profil intensywności PKH 26 pochodzi z niestymulowanej 96-godzinnej hodowli od osoby umiarkowanie reagującej i został wykorzystany do dostarczenia kreatorowi proliferacji mod fit pierwszego oszacowania położenia i szerokości piku reprezentującego niepodzielone komórki rodzicielskie. Zastosowanie stałego ustawienia dla pozycji piku wymaga, aby średnia dla każdego piku pokoleniowego była dokładnie równa połowie intensywności fluorescencji poprzedniego piku. Ustawienie pływaka dla pozycji szczytowej pozwala na końcowe pozycje pików pokoleniowych różniące się od oczekiwanej intensywności w razie potrzeby, aby uzyskać najlepsze dopasowanie.

Podobnie, stałe ustawienie szerokości piku wymaga, aby szerokość każdego piku pokoleniowego była taka sama, jak piku rodzicielskiego lub niekontrolowanego piku kontrolnego. Ustawienie pływaka dla szerokości piku pozwala na niezależną zmianę ostatecznych szerokości w zależności od potrzeb, aby uzyskać najlepsze dopasowanie do tego stołu. Wyniki analiz poprzednich danych liczbowych dla dwóch różnych dawców przedstawiono dla tych dawców, u których widoczne były wyraźne szczyty pokoleniowe.

Najlepsze zredukowane wartości chi-kwadrat uzyskano, gdy zarówno pozycja piku, jak i szerokość mogły unosić się w przypadku profili proliferacji, w których wyraźne piki pokoleniowe nie są widoczne, zaleca się stałe ustawienie pozycji piku. Dane te ilustrują użycie dwóch barwników śledzących do oddzielnego monitorowania historii proliferacji różnych typów komórek odpornościowych w teście immunosupresji z cytometrią przepływową. Komórki efektorowe T pokazane na zielono zostały oznaczone CFSE, a komórki regulatorowe T pokazane na niebiesko zostały oznaczone widokiem komórki.

Populacje komórek znakowanych Claret mieszano w różnych proporcjach i hodowano w obecności anty CD 3, anty CD 28 i napromieniowanych komórek pomocniczych przez 96 godzin. Następnie komórki zostały zebrane i wybarwione anty CD 4, PE wielkości 7 i żywym martwym fiołkiem. Tu. Reprezentatywne dane dla stosunku efektorów treg do T wynoszącego 0,25 do jednego przedstawiono po bramkowaniu żywych martwych fioletowych komórek dodatnich.

Zastosowano bramkę rozpraszania światła, która zawierała limfocyty i blasty, ale wykluczyła agregaty i szczątki, a następnie bramkę zawierającą zdarzenia dodatnie CD four. Barwienie bordowe w widoku komórki pozwoliło na łatwe odróżnienie żywotnych komórek treg od żywotnych komórek efektorowych T, które były wysoce proliferowane, a zatem profile proliferacji CFSE DIM dla dodatnich komórek efektorowych T CFSE i widok komórki Dodatnie komórki Treg Claret analizowano przy użyciu oprogramowania do modelowania pików mod fit. Przeanalizowano około 25 000 zdarzeń.

Spośród nich 48% stanowiły żywotne efektory T, 6% stanowiły żywotne T reg, a reszta to martwe komórki, komórki pomocnicze i szczątki. Obliczony wskaźnik proliferacji, który odzwierciedla krotny wzrost liczby komórek w okresie testu, wynosił 3,85 dla efektorów T i 1,83 dla Treg. W tym miejscu przedstawiono wpływ stężenia komórek tregs na wskaźnik proliferacji komórek efektorowych T obliczony na podstawie profilu rozcieńczenia barwnika CFSE.

Wyniki były takie same, niezależnie od tego, czy komórki treg zostały oznaczone bordowym widokiem komórki, czy pozostały niebarwione, co wskazuje, że funkcja treg nie została zmieniona przez barwienie. Dzięki śledzeniu zgodnie z oczekiwaniami, zakres proliferacji tektorów zwiększał się wraz ze zmniejszaniem się stężenia komórek Treg. Wskaźniki proliferacji komórek Treg obliczono również na podstawie profili rozcieńczania barwnika bordowego w widoku komórki przy różnych proporcjach efektorów treg do T.

Zgodnie z oczekiwaniami, Tregi uległy minimalnej proliferacji przy braku komórek efektorowych T wraz ze wzrostem stężenia komórek efektorowych T. Jednak zakres proliferacji komórek treg również wzrósł. Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie używać barwników śledzących komórki do monitorowania proliferacji komórek, jak wybrać odpowiednie fluorochromy i kontrole kompensacji kolorów oraz jak wybrać odpowiedni model do ilościowego określania podziału komórek na podstawie rozcieńczenia barwnika.

Wraz z tą procedurą można zastosować inne metody, aby odpowiedzieć na pytania eksperymentalne, takie jak barwienie limfocytów T specyficznych dla antygenu lub sortowanie przepływowe w celu odzyskania komórek macierzystych, które są w stanie spoczynku lub powoli się dzielą. Bardzo dziękuję za oglądanie.