Podzielona na przedziały pierwotna hodowla neuronów mysich przy użyciu plastikowych chipów mikroprzepływowych

Weźmy plastikowy chip mikroprzepływowy składający się ze zbiorników i przedziałów somatycznych, a także zbiorników i komór aksonalnych, połączonych mikrorowkami.

Dodaj roztwór do wstępnej powłoki, aby nasycić komory i rowki, zapobiegając uwięzieniu pęcherzyków powietrza.

Zassać roztwór, pozostawiając główne komory wypełnione. Umyć buforem.

Pokryj studzienki syntetycznym polimerem, który ułatwia adhezję neuronów. Przemyć buforem i dodać pożywkę hodowlaną, aby zapobiec wyschnięciu wióra.

Aby wysiać zawiesinę neuronów hipokampa szczura, odessaj pożywkę.

Załadować zawiesinę do zbiorników somatycznych. Neurony wchodzą do przedziału somatycznego i przyczepiają się do niego.

Dodaj pożywkę do hodowli neuronów do studzienek i inkubuj. Czynniki wzrostu obecne w pożywce ułatwiają wzrost neuronów.

Stopniowo neurony rozszerzają swoje aksony, które wrastają do przedziału aksonalnego przez mikrorowki.

Wąskość rowków zapobiega przedostawaniu się ciał komórek nerwowych, zapewniając fizyczną separację regionów somatycznych i aksonalnych.

Na początek umieść sterylny wielokomorowy chip na szalce Petriego. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu do powlekania wstępnego do lewego górnego dołka chipa i pozwól mu przepłynąć przez główny kanał do sąsiedniej studzienki. Następnie napełnij lewą dolną studzienkę chipa 100 mikrolitrami roztworu do wstępnego powlekania.

Tym razem odczekaj pięć minut, aby roztwór przepłynął przez mikrorowki. Teraz dodaj 100 mikrolitrów roztworu do powlekania wstępnego do prawej górnej studzienki i pozwól mu przepłynąć przez główny kanał do sąsiedniej studni. Po 90 sekundach napełnij dolną prawą studzienkę 100 mikrolitrami roztworu do wstępnego powlekania i inkubuj chip przez 10 minut.

Ostrożnie odchylić końcówkę pipety od głównego kanału i zassać roztwór z każdej studzienki. Następnie natychmiast dodaj 150 mikrolitrów PBS do lewego górnego dołka i odczekaj 1,5 minuty. Następnie dodaj 150 mikrolitrów PBS do lewego dolnego dołka i odczekaj pięć minut, aby płyn przepłynął przez mikrorowki.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów PBS do prawego górnego i prawego dolnego dołka w tej kolejności. Po 10 minutach ponownie zassać PBS i powtórzyć kroki mycia po raz drugi. Po drugim płukaniu zassać PBS do studzienek, tak jak poprzednio, odchylając końcówkę pipety od otworu kanału.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów 0,5 mg na ml roztworu poli-D-lizyny do lewego górnego dołka chipa. Odczekaj 1 i 1/2 minuty, a następnie napełnij lewą dolną studzienkę 100 mikrolitrami roztworu poli-D-lizyny. Powtórz ten proces na prawej połowie chipa. Zamknij szalkę Petriego, a następnie umieść chip w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę.

Po inkubacji dwukrotnie przepłukać chip PBS, jak opisano wcześniej. Następnie odessaj PBS z urządzenia. Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych do lewego górnego dołka chipa. Po 1 i 1/2 minuty dodaj multimedia do lewego dolnego dołka.

Odczekaj pięć minut, aby media przepłynęły przez mikrorowki, a następnie powtórz proces napełniania po prawej stronie chipa. Przygotuj zawiesinę komórkową zdysocjowanych neuronów hipokampa szczura zgodnie z ustalonymi protokołami. Usuń większość nośnika z każdej studzienki chipa, ale pozostaw kanały wypełnione.

Następnie natychmiast załaduj 5 mikrolitrów zawiesiny komórek do prawego górnego dołka i kolejne 5 mikrolitrów zawiesiny komórek do prawego dolnego dołka. Podczas ładowania kuwet skieruj końcówkę pipety w stronę głównego kanału. Po załadowaniu komórek przenieś chip do stolika mikroskopowego, aby upewnić się, że neurony znajdują się w głównym kanale.

Po odczekaniu 5 minut, aż komórki się przyłączą, dodaj około 150 mikrolitrów pożywki do hodowli neuronów do każdej z górnych i dolnych prawych studzienek. Następnie dodaj 150 mikrolitrów pożywki do każdej z górnych i dolnych lewych studzienek. Przykryj szalkę Petriego i umieść chip na nawilżonej tacy w inkubatorze o temperaturze 5% dwutlenku węgla i temperaturze 37 stopni Celsjusza.