JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 4:39 min. • July 8th, 2025
Weźmy korę szczeniaka myszy.
Dodaj enzym proteolityczny, który trawi macierz zewnątrzkomórkową tkanki. Następnie mechanicznie oddysocjuj tkankę, rozluźniając komórki.
Dodaj pożywkę glejową i DNazę, aby zdegradować wszelkie zanieczyszczające DNA.
Mechanicznie dysocjuj tkankę, aby uwolnić neurony i komórki glejowe.
Gdy niestrawiona tkanka opadnie, zbierz pożywkę zawierającą komórki i odwiruj. Usunąć supernatant.
Ponownie zawiesić komórki w pożywce glejowej i umieścić je w kolbie pokrytej białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej.
Inkubować. Astrocyty przylegają silniej do pokrytej powierzchni niż inne komórki. Pożywki glejowe sprzyjają przeżyciu tylko komórek glejowych.
Wymień nośnik, aby usunąć zanieczyszczenia.
Inkubować z wytrząsaniem w celu odłączenia leżących nad nimi komórek prekursorowych oligodendrocytów, OPC i mikrogleju.
Przenieś pożywkę z komórkami na płytkę hodowlaną.
Inkubować z wytrząsaniem, aby ułatwić różnicową adhezję mikrogleju.
Przenieść nieprzylegający supernatant OPC na płytkę wielodołkową pokrytą poli-D-lizyną. Inkubować w celu przestrzegania OPC.
Zastąp nośnik nośnikiem OPC, co pozwoli na wzrost OPC.
Dodaj 1 mililitr 0,05% trypsyny z 0,53 milimolowym EDTA do każdej probówki z tkanką. Rozetrzeć mieszaninę 10-mililitrową pipetą około 20 razy. Następnie przenieś zawiesinę komórek do pustej 50-mililitrowej stożkowej probówki.
Roztwór inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 15 minut, delikatnie mieszając lizaty po ośmiu minutach. Po inkubacji dodaj 5 mililitrów MGM i 200 mikrolitrów DNazy-I do każdej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 50 mikrogramów na mililitr. Każdą lizację należy rozcierać 10 razy za pomocą 10-mililitrowej pipety.
Następnie pozostaw zawiesinę komórek na trzy minuty w temperaturze pokojowej, aby niezdysocjowana tkanka mogła osiąść na dnie probówki. Przenieś zawiesiny komórek do nowych 50-mililitrowych stożkowych probówek, pozostawiając niezdysocjowaną tkankę. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad komórkowy w 5 mililitrach MGM i rozetrzyj go 20 razy.
Zawiesiny komórek należy umieścić na powlekanych kolbach T-25 i inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby przeprowadzić izolację komórek prekursorowych oligodendrocytów, potrząsaj komórkami przez 15 godzin. Następnie usunąć supernatant z kolby i ułożyć go na sterylnej szalce Petriego.
Inkubować supernatant w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut, mieszając po 15 minutach w celu usunięcia pozostałego mikrogleju. Usunąć nieprzylegający supernatant komórek. Policz komórki i ułóż je na powierzchni pokrytej poli-D-lizyną w żądanym stężeniu.
Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na co najmniej jedną godzinę. Następnie delikatnie odessaj 95% pożywki i powoli dodaj ciepłą pożywkę OPC, pipetując ją do ścianki studzienki, aby zminimalizować zakłócenia OPC.