Name: Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj szybką izolację immunomagnetyczną pierwotnych oligodendrocytów myszy do badań nad mielinizacją. Ta metoda zapewnia ponad 80% czystość komórek w około godzinę, umożliwiając badanie biologii komórkowej i chorób demielinizacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) i National Institutes of Health (R03NS06740402). Autorzy dziękują dr Ivanowi Hernandezowi i członkom jego laboratorium za udostępnienie przestrzeni laboratoryjnej, sprzętu i porad.

Myszy użyte w tym badaniu były opiekowane zgodnie z wytycznymi SUNY Downstate Medical Center Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) numer protokołu 15-10492.
UWAGA: Pierwotne oligodendrocyty zostały wyizolowane od noworodków (P5-P7 typu dzikiego C57Bl/6N) myszy. Na tym etapie niedojrzałe OL stanowią ponad 80% istoty białej gryzoni, zapewniając wysoką wydajność komórkową. Wszystkie kompozycje i odczynników są dostępne na końcu tabeli materiałów.
1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
UWAGA: Szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (PDL)/lamininą powinny być przygotowane przed izolacją OL.
<ol>
	<li>Umieść niemieckie szklane szkiełka nakrywkowe #1 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 35 ml 70% EtOH, aby je wyczyścić.</li>
	<li>Zamknij probówkę, umieść ją w mieszadle nutacyjnym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, delikatnie kołysząc. Szkiełka nakrywkowe można inkubować przez noc.</li>
	<li>Wyrzuć 70% EtOH.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy wodą dejonizowaną, za każdym razem usuwaj wodę przy zasysaniu próżniowym.</li>
	<li>Dodaj 30-35 ml PDL 50 μg/ml do szkiełek nakrywkowych w probówce o pojemności 50 ml, wystarczająco dużo, aby przykryć szkiełka nakrywkowe.</li>
	<li>Umieścić probówkę o pojemności 50 ml zawierającą szkiełka nakrywkowe na mieszadle nutującym i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, delikatnie kołysząc.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy wodą dejonizowaną, usuwając wodę za każdym razem za pomocą zasysania próżniowego.</li>
	<li>Przenieść szkiełka nakrywkowe na 60-milimetrowe szalki Petriego zawierające wodę dejonizowaną.</li>
	<li>Za pomocą końcówki pipety P200 ułóż szkiełka nakrywkowe jako warstwę pokrywającą całą powierzchnię szalki Petriego.</li>
	<li>Ostrożnie usuń wodę z naczyń za pomocą aspiracji próżniowej.</li>
	<li>Usuń nadmiar wody wokół szkiełek nakrywkowych i pozostaw je do wyschnięcia na noc przy otwartej pokrywie i pod światłem UV w kapturze. 
	UWAGA: Szkiełka nakrywkowe ze szkła powlekanego PDL można przechowywać w temperaturze 4 °C na sterylnych szalkach Petriego przez okres do trzech miesięcy.</li>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe na płytkach 24-dołkowych, po jednej na dołek, za pomocą cienkich kleszczyków.</li>
	<li>Przesuń szkiełka nakrywkowe na środek studni, upewniając się, że krawędzie nie dotykają ściany studni.</li>
	<li>Dodać 100 μl 10 μg/ml lamininy rozcieńczonej w B27NBMA (patrz tabela materiałów), zaczynając od środka każdego szkiełka nakrywkowego i przesuwając się okrężnie w kierunku krawędzi, aby pokryć całą powierzchnię. 
	UWAGA: Ponieważ laminina bierze udział w utrzymaniu OL i sprzyja różnicowaniu się do dojrzałych OL, jest ważnym czynnikiem przeżycia OL w hodowli in vitro41,42,43,44.</li>
	<li>Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę lub do momentu, gdy OL będą gotowe do posiewu.</li>
</ol>
2. Dysocjacja kory mózgowej myszy
<ol>
	<li>Składanie w ofierze 5-7-dniowych szczeniąt myszy C57Bl/6N po urodzeniu przez szybkie ścięcie nożyczkami uprzednio oczyszczonymi w 70% etanolu. 
	UWAGA: Do każdego preparatu użyto kory mózgowej od 5-6 nowonarodzonych szczeniąt myszy. Średnio jeden mózg myszy daje 1-1,5 x 106 OL.</li>
	<li>Przetnij skórę głowy wzdłuż linii środkowej małymi nożyczkami preparacyjnymi i cofnij się, aby odsłonić czaszkę.</li>
	<li>Ostrożnie przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej, zaczynając od otworu w tylnej części czaszki w kierunku obszaru czołowego, podnosząc nożyczkami, aby uniknąć uszkodzenia mózgu. Następnie, korzystając z otworu w tylnej części czaszki, przeciąć w kierunku każdego oczodołu wzdłuż podstawy czaszki.</li>
	<li>Użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie odsunąć korę mózgowia od śródmózgowia i przenieś je do 60-milimetrowej naczynia do hodowli tkankowej zawierającej 7 ml B27NBMA. Powtórz kroki od 2.2 do 2.4 dla każdego mózgu, łącząc wypreparowaną korę mózgową.</li>
	<li>Przenieś korę do nowego 60-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego 5 ml buforu dysocjacyjnego (B27NBMA, 20-30 U/ml papainy i 2,500 U DNazy I).</li>
	<li>Pokrój korę na małe kawałki o wielkości około 1 mm3 za pomocą ostrza skalpela #15 i inkubuj przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Dodać 1 ml surowicy wzrostu bydła (BGS), aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.</li>
	<li>Przenieść korę wraz z pożywką dysocjacyjną do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Delikatnie rozpocznij dysocjację tkanki mózgowej, powoli pipetując w górę i w dół 6-8 razy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml, zwracając uwagę na zminimalizowanie pęcherzyków.</li>
	<li>Pozwól kawałkom tkanki osiąść przez 2-3 minuty i przenieś supernatant do świeżej probówki.</li>
	<li>Dodać 3 ml B27NBMA zawierającej 10% BGS/2500 U DNazy I do osadu tkankowego.</li>
	<li>Użyj pipety serologicznej o pojemności 5 ml, aby delikatnie zdysocjować tkankę mózgową podczas pipetowania w górę i w dół 6-8 razy. Uważaj, aby zminimalizować bąbelki.</li>
	<li>Pozwól kawałkom tkanki osiąść przez 2-3 minuty.</li>
	<li>Przenieść supernatant do świeżej probówki. Dodać 3 ml B27NBMA zawierającej 10% BGS/DNazy I do osadu tkankowego.</li>
	<li>Delikatnie rozdzielić tkankę mózgową za pomocą końcówki do pipety P1000, jednocześnie pipetując mieszaninę pożywki i tkanki mózgowej w górę iw dół. Powtarzać kroki 2.13 i 2.14 do momentu, gdy nie pozostaną żadne duże kawałki tkanki lub do wyczerpania B27NBMA zawierających 10% BGS/DNazy I, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Uważaj, aby zminimalizować bąbelki.</li>
	<li>Zawiesina komórek basenowych z poprzednimi supernatantami.</li>
	<li>Umieść sitko o średnicy 70 μm w probówce o pojemności 50 ml. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml delikatnie przepuścić zawiesinę komórek zebranych w puli przez sitko o wielkości 70 μm.</li>
	<li>Przemyć sitko do komórek, dodając 1 ml B27NBMA zawierającej 10% BGS/DNazy I.</li>
	<li>Wyrzuć sitko do komórek. Doprowadzić objętość do 30 ml za pomocą B27NBMA zawierających 10% BGS/DNazy I.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórek przez 10 minut przy 200 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant bez pozostawiania komórek wystawionych na działanie powietrza. Supernatant będzie mętny z powodu resztek komórkowych. Do granulki dodać 3 ml B27NBMA zawierającego 10% BGS.</li>
	<li>Ostrożnie oddzielić osad komórkowy za pomocą pipety P1000. Doprowadzić objętość do 15 ml za pomocą B27NBMA zawierającej 10% BGS.</li>
	<li>Przepuścić zawiesinę komórek przez świeże sitko o wielkości 40 μm.</li>
	<li>Umyj sitko do komórek, dodając 1 ml B27NBMA zawierającego 10% BGS. Wyrzuć sitko do komórek.</li>
	<li>Doprowadzić objętość do 30 ml za pomocą B27NBMA zawierających 10% BGS.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do 2 stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórek przez 10 minut przy 200 x g.</li>
	<li>Usunąć większość supernatantu, nie pozostawiając komórek wystawionych na działanie powietrza. Ponownie zawiesić granulki komórek w 5 ml lodowatego bufora do magnetycznego sortowania komórek (MCS).</li>
</ol>
3. Określanie liczby komórek i żywotności
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 100 μl zawiesiny komórek w 400 μl roztworu błękitu trypanowego w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać rozcieńczenie 1:5 w 0,4% (w/v).</li>
	<li>Wyśrodkuj szklankę nakrywkową nad komorą hemocytometru i napełnij dwie komory 10 μl rozcieńczenia komórek za pomocą pipety P10, unikając przepełnienia. Roztwór przejdzie pod szkłem nakrywkowym przez działanie kapilarne.</li>
	<li>Umieść hemocytometr na stoliku mikroskopu i wyreguluj ostrość za pomocą 40-krotnego powiększenia. 
	UWAGA: Zliczanie komórek jest rejestrowane za pomocą ręcznego licznika w każdym z pięciu kwadratów (cztery rogi i jeden środek). Tylko komórki niezdolne do życia wchłaniają barwnik i wydają się niebieskie, podczas gdy żywe i zdrowe komórki wydają się okrągłe i załamują i nie wchłaniają barwnika o niebieskim kolorze, co pozwala na określenie liczby żywotnych i całkowitych komórek na mililitr.</li>
</ol>
4. Izolacja oligodendrocytów O4+
<ol>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 10 min.</li>
	<li>Ostrożnie wyrzucić supernatant za pomocą aspiracji próżniowej, unikając wystawienia komórek na działanie powietrza.</li>
	<li>Zawiesić osad w 90 μl buforu MCS na 1 x10 7 komórek ogółem, a następnie dodać 10 μl kulek anty-O4 na 1 x 107 komórek.</li>
	<li>Wymieszaj zawiesinę komórek i kulki, delikatnie przesuwając stożkową probówkę o pojemności 15 ml palcem 4-5 razy.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 4 °C, przesuwając palcem stożkową probówkę o pojemności 15 ml 4-5 razy co 5 minut co 5 minut.</li>
	<li>Przemyj mieszankę, delikatnie dodając 2 ml buforu MCS na 1 x 107 komórek do probówki. Odwirować mieszaninę przy 200 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant ostrożnie za pomocą aspiracji próżniowej, unikając wystawienia komórek na działanie powietrza. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu MCS na każde 1 x10 7 komórek.</li>
	<li>Przymocuj separator magnetyczny do stojaka separatora magnetycznego. Przymocuj kolumnę selekcyjną do separatora magnetycznego i umieść sitko o pojemności 40 μm na górze kolumny. Umieść dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml lub jedną stożkową o pojemności 50 ml poniżej kolumny separacyjnej, aby zebrać przepływ.</li>
	<li>Wstępnie przepłukać sitko komórkowe o średnicy 40 μm i kolumnę separacyjną 3 ml buforu MCS i pozostawić bufor przez kolumnę, nie dopuszczając do jej wyschnięcia.</li>
	<li>Dodaj mieszaninę zawiesiny komórek i kulek do sitka do komórek i do kolumny wyboru.</li>
	<li>Przemyć sitko o długości 40 μm 1 ml buforu MCS.</li>
	<li>Wyrzuć sitko do komórek i pozwól, aby mieszanina komórek, kulek i buforu przepłynęła przez kolumnę, nie dopuszczając do jej wyschnięcia.</li>
	<li>Przemyć kolumnę separacyjną 3 razy 3 ml buforu MCS i 1 raz pożywką proliferacyjną OL.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę separacyjną z separatora magnetycznego, szybko umieść ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i natychmiast dodaj 5 ml pożywki proliferacyjnej OL.</li>
	<li>Umieść tłok na górze kolumny i mocno dociśnij, aby wypłukać oznaczone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Usunąć 100 μl zawiesiny komórek w celu określenia liczby komórek i żywotności za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru, jak wskazano w sekcji 3. 
	UWAGA: Żywotność komórek powyżej 80% jest uważana za dopuszczalną do kontynuowania hodowli OL, ale żywotność większa niż 90% jest optymalna.</li>
</ol>
5. Posiewanie izolowanych oligodendrocytów O4+
<ol>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórek do pożądanej gęstości posiewu (5 x 105 komórek na szkiełko nakrywkowe) za pomocą pożywki do proliferacji OL. 
	UWAGA: Gęstość wysiewu OL jest bardzo ważna, dlatego przed przystąpieniem do pracy należy potwierdzić odpowiednią gęstość komórek za pomocą mikroskopu kultur tkankowych. Gęstość wysiewu poniżej 10 000 komórek/szkiełek nakrywkowych może prowadzić do słabej przeżywalności komórek. Przy gęstości posiewu od 10 000 do 25 000 zróżnicowanie morfologiczne OL jest powolne45. Talerzujemy OL z gęstością wysiewu co najmniej 50 000 komórek/szkiełek nakrywkowych, aby zapewnić przeżycie komórek.</li>
	<li>Przenieść 24-dołkowe płytki zawierające szkiełka nakrywkowe pokryte lamininą z inkubatora do kaptura do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Usunąć lamininę z każdego szkiełka nakrywkowego i zastąpić ją 100 μl zawiesiny OL.</li>
	<li>Inkubować OL w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 przez maksymalnie 45 minut, aby zwiększyć przyczepność OL do szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Po inkubacji wyjąć 24-dołkowe płytki z inkubatora. Zalać każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 500 μl pożywki proliferacyjnej OL.</li>
	<li>Umieścić OL z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 na dodatkowe 24 godziny.</li>
	<li>24 godziny po posianiu OL usunąć pożywki proliferacyjne i zastąpić je pożywkami różnicującymi OL w celu wywołania różnicowania.</li>
	<li>Umieść OL z powrotem w inkubatorze i nie usuwaj, dopóki komórki nie będą gotowe do utrwalenia. 
	UWAGA: Zmiany pH są szkodliwe dla OL i zmniejszają żywotność komórek, dlatego należy unikać niepotrzebnego usuwania kultur OL z inkubatora.</li>
</ol>
6. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>W celu wykrycia markerów powierzchniowych komórek (NG2, O1 i O4) należy usunąć pożywkę z dołków.</li>
	<li>Dodać 250 μl supernatantów mysiego hybrydoma zawierających pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko O1 (nierozcieńczonemu)13 i O4 (nierozcieńczone)13 i poliklonalnego królika przeciwko NG2 (1:150 rozcieńczony w B27NBMA). 
	UWAGA: Jeśli mają być stosowane dostępne na rynku przeciwciała anty-O1 i anty-O4, zaleca się stosowanie rozcieńczeń sugerowanych przez producenta.</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym maksymalnie przez 45 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .</li>
	<li>Umyć dwukrotnie 0,05% Tween-20/1X PBS. Utrwal komórki 4% paraformaldehydem (4% PFA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj trzy razy po 5 minut z 0,05% Tween-20/1X PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć Alexa 488-sprzężone z kozią przeciwciałem anty-mysim IgM lub anty-króliczym przeciwciałem drugorzędowym IgG (1:400) w B27NBMA.</li>
	<li>Usuń 0,05% Tween-20/1X PBS z szkiełek nakrywkowych. Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Umyj trzy razy po 5 minut z 0,05% Tween-20/1X PBS.</li>
	<li>W przypadku podwójnego barwienia w celu wykrycia markerów wewnętrznych (GFAP) należy usunąć 0,05% Tween-20/1X PBS i zablokować/przeniknąć komórki buforem blokowym/permeabilizacyjnym przez 15 minut w temperaturze pokojowej. W przeciwnym razie przejdź do kroku 6.17.</li>
	<li>Usunąć bufor blokowy/permeabilizacyjny i dodać 250 μl anty-GFAP kurczaka (1:100) rozcieńczonego w buforze blokowym/permeabilizacyjnym.</li>
	<li>Inkubować komórki z anty-GFAP przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj trzy razy po 5 minut z 0,05% Tween-20/1X PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć sprzężone z Alexa 594 kozie przeciwciało anty-drugorzędowe IgG kurczaka (1:400) w B27NBMA.</li>
	<li>Usuń 0,05% Tween-20/1X PBS z szkiełek nakrywkowych. Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Umyj trzy razy po 5 minut z 0,05% Tween-20/1X PBS.</li>
	<li>Przeciwbarwić 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) i zamontować ogniwa za pomocą pożywki montażowej zapobiegającej blaknięciu zawierającej DAPI.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka nakrywkowe do utwardzenia przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zobrazuj barwione komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. 
	UWAGA: W tym protokole komórki zostały zobrazowane w 40-krotnym powiększeniu przy użyciu jednolitego czasu ekspozycji.</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

W niniejszym komunikacie przedstawiamy metodę skutecznej izolacji wysoce oczyszczonych, niedojrzałych kultur oligodendrocytów myszy. W porównaniu z poprzednio opublikowanymi protokołami39,40, metoda ta przyniosła wyższą czystość przy znacznie niższym poziomie astrocytów GFAP-dodatnich i bardzo niskim odsetku innych niescharakteryzowanych komórek. Ważne jest, aby podkreślić, że są to niedojrzałe OL już zaangażowane w linię oligodendroglialną. W związku z tym komór...

Oligodendrocyty (OLs) są komórkami mielinizującymi ośrodkowego układu nerwowego (CNS)1. Izolacja i hodowla pierwotnych oligodendrocytów w ściśle kontrolowanym środowisku stanowi cenne narzędzie do badań in vitro nad rozwojem oligodendroglei, jak również nad biologią chorób demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane2. Wymaga to zastosowania wydajnej i niezawodnej metody izolacji i hodowli oligodendrocytów3. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy ekspresję charakterystycznego markera powierzchniowego oligodendrocytów do wdrożenia zmodyfikowanej techniki izolacji, która jest szybka i specyficzna.
Zidentyfikowano cztery odrębne etapy dojrzewania oligodendrocytów, z których każdy charakteryzuje się ekspresją specyficznych markerów powierzchni komórkowych dla danego stadium rozwojowego (Rysunek 1). Markery powierzchni komórkowych te mogą być rozpoznawane przez specyficzne przeciwciała4,5 i mogą służyć do izolowania oligodendrocytów na konkretnych etapach. W pierwszym stadium komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPCs) wykazują zdolność do proliferacji i migracji oraz specyficznie eksponują receptor czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF-Rα)6, gangliozyd A2B5, proteoglikan NG27,8, polisjalowy kwas neuronalną cząsteczkę adhezyjną9 oraz białko wiążące kwasy tłuszczowe 7 (FABP7)10. OPCs mają morfologię bipolarną z kilkoma krótkimi wypustkami wychodzącymi z przeciwległych biegunów ciała komórki, co jest charakterystyczne dla prekursorowych komórek nerwowych11.
<img alt="Schemat etapów różnicowania oligodendrocytów z markerami komórkowymi E13, P2, P7, P17." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ekspresja markerów powierzchni komórkowych podczas rozwoju oligodendrocytów u myszy. Markery powierzchniowe komórek OL, takie jak A2B5, GalC (O1), NG2, O4 i PDGF-Rα, mogą być wykorzystane do specyficznej izolacji oligodendrocytów na określonym etapie rozwoju przy użyciu specyficznych przeciwciał. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.</a>
W drugim etapie OPC przekształcają się w preoligodendrocyty i wykazują na błonie komórkowej nie tylko markery OPC, ale także sulfatydę (sulfatowany galaktolipid) rozpoznawaną przez przeciwciało O412,13 oraz białko GPR1714, które utrzymuje się do etapu niedojrzałego oligodendrocytu (OL). Na tym etapie preoligodendrocyty wytwarzają krótkie wypustki wielobiegunowe. Preoligodendrocyty stanowią główną populację OL w 2. dobie postnatalnej (P2) w istocie białej mózgu zarówno szczura, jak i myszy, z niewielką populacją niedojrzałych OL15.
W trzecim stadium niedojrzałe OL nadal wykazują ekspresję O4, tracą ekspresję markerów A2B5 i NG2 oraz zaczynają wykazywać ekspresję galaktocerebrosydu C16. Na tym etapie OL są zdeterminowane do linii oligodendroglialnej i stają się komórkami pomitotycznymi z długimi, rozgałęzionymi wypustkami17,18. Niedojrzałe OL stanowią ponad 80% białej istoty gryzoni w dniu P7, a w tym czasie obserwuje się pierwsze komórki MBP+15,19,20,21. W związku z tym izolacja OL w dniu P7 może zapewnić wysoką wydajność komórkową.
W końcowym, czwartym etapie rozwoju OL, dojrzałe OL wykazują ekspresję białek mielinizujących (białka podstawowego mieliny (MBP), białka proteolipidowego (PLP), glikoproteiny związanej z mieliną (MAG) i glikoproteiny mieliny oligodendrocytów (MOG)22,23,24,25,26. Na tym etapie dojrzałe OL wysuwają błony, które tworzą zwarte osłony owijające aksony i są zdolne do mielinizacji. Zgadza się to z obserwacją, że w mózgu szczura i myszy komórki MBP+ stają się coraz liczniejsze w dniu P1419,20,21.
Od czasu pierwszej izolacji oligodendrocytów dokonanej przez Fewstera i współpracowników w 1967 roku27, wdrożono kilka metod izolacji OL z OUN gryzoni, w tym immunopanning28,29,30, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) z wykorzystaniem swoistych antygenów powierzchniowych komórek28,31, różnicową wirowkę w gradiencie gęstości32,33,34,35 oraz metodę wstrząsania opartą na różnicowej adhezji różnych komórek glejowych OUN36,37. Jednakże istniejące metody hodowli mają swoje ograniczenia, szczególnie w zakresie czystości, wydajności oraz czasu wymaganego do przeprowadzenia procedur38. W związku z tym konieczne jest opracowanie bardziej wydajnych metod izolacji oligodendrocytów.
W niniejszej pracy przedstawiamy prostą i wydajną metodę selekcji do immunomagnetycznej izolacji preoligodendrocytów etapu trzeciego O4+ z noworodków myszy. Metoda ta jest modyfikacją technik opisanych przez Emery et al.39 oraz Dincman et al.40 i pozwala na uzyskanie preparatu oligodendrocytów o czystości powyżej 80% w czasie około 4 h.

<table><tbody><tr><td>Pipety serologiczne 10ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10ml końcówka Luer-Loc</td><td>BD, Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15ml probówki stożkowe</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>40&micro; m sitko do komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>22368547</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50ml</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>5ml pipety serologiczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych 60mm</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>70&micro; Sitko do komórek m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-królicze IgM (H+L) drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-królicze IgM (H+L) drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-kurze IgG (H + L)</td><td>wtórne Invitrogen</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki anty-O4 - Anty-O4MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-543</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin ludzki</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Autofil kompletny zespół filtra butelkowego, filtr 0,22um, 250ml</td><td>USA Scientific</td><td>6032-1101</td><td></td></tr><tr><td>Autofil kompletny filtr górny do butelki montaż, filtr 0,22um, 250ml</td><td>USA Scientific</td><td>6032-1102</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Bydlęca surowica wzrostu (BGS)</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-50</td><td></td></tr><tr><td>d-Biotyna</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Dezoksyrybonukleaza I (DNAza I)</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td> Mikroskop epifluorescencyjny <td>S311</td><td></td></tr><tr><td>z kamerą Olympus DP70</td><td>Olympus</td><td>Bx51</td><td></td></tr><tr><td>Feather jednorazowe skalpele</td><td>Andwin Scientific</td><td>EF7281C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>Niemieckie szkiełka nakrywkowe, grubość #1, średnica 12mm okrągłe</td><td>NeuVitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało GFAP</td><td>Aves</td><td>GFAP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Glukoza Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Invitrogen</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Stojak separatora magnetycznego - MACS multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separator magnetyczny - separator MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex PES 0,22&micro; m jednostka filtrująca</td><td>Millipore</td><td>SLG033RS</td><td></td></tr><tr><td>Media montażowe- Prolong Gold z DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-cysteina (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Naturalna laminina mysia</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrofina-3 (NT-3)</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało NG2</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>PBS bez Ca2+ i Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lizyna</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescyna</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna selekcyjna-Kolumny LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Pierwiastki śladowe B</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trijodotyronina (T3)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Trypan Blue Corning</td><td></td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>B27NBMA</td><td></td><td></td><td>487,75 ml podłoże nerwowo-podstawne A; 10 ml suplementu B27; 1 ml Primocin; 1,25 ml Glutamax; Filtruj, sterylizuj i przechowuj w temperaturze 4 &; C do momentu użycia.</td></tr><tr><td>B27NBMA + 10% BGS</td><td></td><td></td><td>27 ml B27NBMA; 3 ml Surowica wzrostu bydła</td></tr><tr><td>Roztwór roztworu CNTF (10 &mikro; g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Zamów w Peprotech (450-50). Uzupełnić w stężeniu 0,1-1 mg/ml zgodnie z zaleceniami producenta s instrukcja (może się różnić w zależności od partii) w buforze (np. DPBS + 0,2% BSA). Przechowywać w temperaturze -80 °C. Roztwór roboczy (10 &mikro; g/ml, 1000X) 1. Zrobić na 0,2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) w roztworze DPBS i wysterylizować filtrem. 2. Rozcieńczyć podwielokrotność głównego półproduktu do 10&mikro; g/ml w sterylnym, schłodzonym 0,2% BSA/DPBS. 3. Podwielokrotność (20&mikro; l / rurka) i zatrzaskowe zamrażanie w ciekłym azocie. 4. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>roztwór podstawowy d-biotyny (50 &mikro; g/ml; 5000X)</td><td></td><td></td> <td>Ponownie zawiesić d-biotynę (Sigma-B4639) w podwójnie destylowanym H2O przy 50 &mikro; g/ml (np. 2,5 mg w 50 ml ddH2O). Ponowne zawieszenie może wymagać sporej ilości wzburzenia/wirowania lub łagodnego ocieplenia w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Jeśli d-biotyna nadal nie ulega rozpuszczeniu, dobrze jest przygotować mniej stężoną (np. 10&micro; g/ml) i dodać większą objętość do B27NBMA (1/1000) zamiast 1/5000). Przechowywać w temperaturze 4&deg;C.</td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>podstawowy DNazy I</td><td>1. Rozpuścić w 12 500 j. Deoksyrybonukleaza I / ml w HBSS schłodzony na lodzie. 2. Sterylizuj filtr na lodzie 3. Podwielokrotność przy 200 &mikro; l i zamrozić na noc w temperaturze -20&deg;C. 4. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze od -20 do -30&deg;C.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (bez Ca2+ i Mg2+)</td><td></td><td></td> <td>Rozpuść saszetkę w 1 litrze wody, aby uzyskać 1 litr pożywki przy 9,6 grama proszku na litr pożywki. Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy forskoliny (4,2 mg/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Dodać 1 ml sterylnego DMSO do 50 mg Forskolina w butelce (Sigma-F6886) i pipetować do momentu ponownego zawieszenia. Przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać 11 ml sterylnego DMSO, aby uzyskać 4,2 mg/ml. Podwielokrotność (np. 20 &mikro; l) i przechowywać w temperaturze -20& stopni C.</td></tr><tr><td>Hank' s sole zrównoważone (HBSS) (Sigma</td><td></td><td></td><td>1. Odmierz 900 ml wody (temperatura 15-20 &deg; C) w cylindrze i delikatnie wymieszać. 2. Dodaj moc i mieszaj aż do rozpuszczenia. 3. Wypłucz oryginalne opakowanie niewielką ilością wody, aby usunąć wszelkie ślady proszku. 4. Dodaj do roztworu w kroku 2. 5. Dodaj 0,35 g wodorowęglanu sodu (7,5% w/v) na każdy litr końcowej objętości. 6. Mieszaj, aż się rozpuści. 7. Dostosuj pH buforu, mieszając do 0,1-0,3 jednostki poniżej pH = 7,4, ponieważ może wzrosnąć podczas filtracji. Zaleca się stosowanie 1N HCl lub 1N NaOH w celu dostosowania pH 8. Dodaj więcej wody, aby uzyskać ostateczną objętość do 1 l, 9. Sterylizować przez filtrację przy użyciu membrany o porowatości 0,22 mikrona. 10. Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Podstawowy roztwór insuliny (4000 &mikro; g/ml)</td><td></td><td></td><td>Rozmrozić butelkę i porcję 25 &mikro; l na probówkę do mikrowirówki i przechowywać w temperaturze -20°C.</td></tr><tr>Roztwór <td></td><td></td><td>laminy</td><td>Powoli rozmrażaj lamininę na zimno (2&deg; C do 8&deg; C) aby uniknąć tworzenia się żelu. Następnie podwielokrotność do rurek polipropylenowych. Przechowywać w 5&deg; C do -20&deg; C w podwielokrotnościach (np. 20 &mikro; l) i nie zamrażać/rozmrażać wielokrotnie. Laminina może być przechowywana w tych temperaturach do sześciu miesięcy.</td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td> do <td>magnetycznego sortowania komórek (MCS)</td><td>Przygotować roztwór zawierający sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pH 7,2 i 0,5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 mM EDTA, 5&mikro; g/ml insuliny, 1 g/l glukozy. Sterylizować i odgazowywać przez filtrację buforu, przepuszczając go przez 0,22 &mikro; m Filtr Millex. Przechowywać bufor w temperaturze 4&deg; C do czasu użycia</td></tr><tr><td>roztworu podstawowego N-acetylo-L-cysteiny (NAC) (5 mg/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Rozpuścić N-acetylo-L-cysteinę (Sigma-A8199) w stężeniu 5 mg/ml w DMEM (np. 50 mg NAC w 10 ml B27NBMA). Filtr sterylizuje i porcjuje (np. 20 &mikro; l). Przechowywać w temperaturze -20&deg;C.</td></tr><tr><td>NT3 roztwór podstawowy (1 &mikro; g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td> <td>Główna kolba: Zamówienie od Peprotech (450-03). Uzupełnić w ilości 0,1 do 1 mg/ml zgodnie z zaleceniami producenta s instrukcje (mogą się różnić w zależności od partii), w buforze (np. DPBS + 0,2% BSA). Przechowywać w temperaturze -80&deg;C. Zapas roboczy (1&micro; g/ml; 1000X): 1. Zrobić na 0,2% BSA w roztworze DPBS i wysterylizować filtrem. 2. Rozcieńczyć podwielokrotność głównego podproduktu do 1 &mikro; g/ml w sterylnym, schłodzonym 0,2% BSA/DPBS. 3. Podwielokrotność (np. 20&micro; l / rurka) i zatrzaskowe zamrażanie w ciekłym azocie. 4. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80&deg;C.</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy PDGF (10 &mikro; g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td> <td>Zapas główny: Zamów w Peprotech (100-13A). Uzupełnić w ilości 0,1 do 1 mg/ml zgodnie z zaleceniami producenta s instrukcje (mogą się różnić w zależności od partii) w buforze (np. DPBS) + 0,2% BSA). Przechowywać w temperaturze -80&deg;C. Zapas roboczy (1&micro; g/ml; 1000X): 1. Zrobić na 0,2% BSA w roztworze DPBS i wysterylizować filtrem. 2. Rozcieńczyć podwielokrotność głównego zapasu do 1&mikro; g/ml w sterylnym, schłodzonym 0,2% BSA/DPBS. 3. Podwielokrotność (np. 20&micro; l / rurka) i zatrzaskowe zamrażanie w ciekłym azocie. 4. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80&deg;C.</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna (1 mg / ml; 100X)</td><td></td><td></td> <td>Zawiesić poli-D-lizynę o masie cząsteczkowej 70-150 kD (Sigma P6407) przy 0,5 mg / ml w 0,15 M kwasie borowym o pH 8,4 (np. 50 mg w 50 ml buforu boranowego). Sterylizacja filtra i podwielokrotność (np. 100&mikro; l/rurka). Przechowywać w temperaturze -20&deg;C. Przed użyciem rozcieńczyć 100X (1mg/ml) do 50 &mikro; g/ml w sterylnej wodzie.</td></tr><tr>Pożywki <td></td><td></td> do <td>proliferacji oligodendrocytów</td><td>patrz <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">Tabela uzupełniająca 1</a></td></tr><tr><td>Pożywki</td><td></td><td></td> różnicujące oligodendrocyty <td>patrz <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">Tabela uzupełniająca 1</a></td></tr><tr><td>Suplement Sato (100X)</td><td></td><td></td><td>patrz <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">Tabela uzupełniająca 1</a></td></tr><tr><td>Bibliografia: lista odczynników i receptur została zaczerpnięta z protokołów opisanych wcześniej przez Emery'ego i in. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Oczyszczanie komórek linii oligodendrocytów z kory myszy przez immunopanning. Protokół Cold Spring Harb. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) oraz Dincman i in. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, SR Izolacja komórek prekursorowych oligodendrocytów myszy korowej. J Metody neurosce. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Efektywna i solidna izolacja i hodowla pierwotnych oligodendrocytów (OL) jest cennym narzędziem do badań in vitro rozwoju oligodendroglii, jak również biologii chorób demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane i choroba Pelizaeus-Merzbacher (PMLD). W tym miejscu przedstawiamy prostą i skuteczną metodę selekcji immunomagnetycznej izolacji komórek preoligodendrocytów O4 + w trzecim etapie od nowonarodzonych szczeniąt myszy. Ponieważ niedojrzałe OL stanowią ponad 80% istoty białej mózgu gryzonia w 7. dniu po urodzeniu (P7), ta metoda izolacji nie tylko zapewnia wysoką wydajność komórkową, ale także specyficzną izolację OL już zaangażowanych w linię oligodendroglialną, zmniejszając możliwość wyizolowania komórek zanieczyszczających, takich jak astrocyty i inne komórki, z mózgu myszy. Metoda ta jest modyfikacją opisanych wcześniej technik i zapewnia czystość preparatu oligodendrocytów powyżej 80% w ciągu około 4 godzin.

Celem niniejszego badania było opracowanie ulepszonej metody izolacji pierwotnych oligodendrocytów mysich O4+ , wymagającej jak najmniejszej manipulacji komórkami docelowymi. Cała procedura, od eutanazji szczeniąt do wysiania komórek na szkiełka podstawowe, trwa około 4 h, a przedstawione tutaj dane reprezentują trzy niezależne eksperymenty. Po dysocjacji tkanki w każdym niezależnym eksperymencie wyizolowano średnio 4,3 ± 0,46 x 107 komórek przy żywotności 91% ± 5,6%...

Opisujemy immunomagnetyczną izolację pierwotnych oligodendrocytów myszy, która pozwala na szybką i specyficzną izolację komórek do hodowli in vitro.

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Ogólnym celem tej techniki jest wykorzystanie izolacji immunomagnetycznej do selekcji oligodendrocytów O4-dodatnich od nowonarodzonych szczeniąt myszy do analizy ich hodowli in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurologii związane z badaniem chorób wpływających na mielinę i mielinizację. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona przygotowanie końcowej hodowli oligodendrocytów o czystości większej niż 80% w ciągu około godzinnych godzin.Zacznij od użycia małych nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej skóry głowy myszy w ciągu pięciu do siedmiu dni po urodzeniu. Cofnij płat skóry, aby odsłonić czaszkę, i ostrożnie przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej od otworu z tyłu do obszaru czołowego. Od otworu w tylnej części czaszki przetnij w kierunku każdego oczodołu wzdłuż podstawy kości i użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie odsunąć korę mózgową od śródmózgowia.Następnie przenieś korę do 60-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego siedem mililitrów B-27 Neurobasal A Medium. Kiedy wszystkie mózgi zostaną zebrane, przenieś korę do nowego 60-milimetrowego naczynia do hodowli tkanek zawierającego pięć mililitrów buforu dysocjacyjnego i użyj ostrza skalpela numer 15, aby pokroić korę na jeden sześcienny milimetrowy kawałek. Inkubuj fragmenty mózgu w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 20 minut.Następnie dodaj jeden mililitr bydlęcej surowicy wzrostowej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej przenieś zawiesinę tkanki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i delikatnie rozdziel tkankę mózgową sześć do ośmiu razy za pomocą pipetowania. Pozwól, aby zdysocjowane kawałki tkanki osiadły przez dwie do trzech minut.Następnie przenieść supernatant do świeżej probówki. Następnie dodaj trzy mililitry pożywki Neurobasal A, uzupełnionej bydlęcą surowicą wzrostu i DNazą I do tkanek i użyj pięciomililitrowej pipety, aby delikatnie zdysocjować tkanki za pomocą większego pipetowania. Widzisz, odpowiednia siła pipetowania ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wysokiej wydajności żywotnych komórek.Jeśli pipetowanie jest zbyt trudne, żywotność może być niska. Natomiast jeśli pipetowanie jest zbyt delikatne, wydajność komórkowa może być niska. Pozwól kawałkom tkanki osiąść przez kolejne dwie do trzech minut.Następnie przenieś supernatant do nowej probówki i dodaj do tkanki trzy mililitry świeżej pożywki Neurobaseal A, uzupełnionej bydlęcą surowicą wzrostu i DNazą I. Delikatnie oddzielić tkankę mózgową za pomocą końcówki pipety P-1000, aż nie pozostanie żaden duży fragment tkanki, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Użyj pipety o pojemności 10 mililitrów, aby przefiltrować roztwór komórkowy przez sitko o średnicy 70 mikronów do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i doprowadzić końcową objętość zawiesiny jednokomórkowej do 30 mililitrów za pomocą świeżej pożywki Neurobaseal A, uzupełnionej surowicą wzrostu bydła i DNazą I. Podziel zawiesinę komórkową na dwie 15-mililitrowe stożkowe probówki, i osadzać komórki nerwowe przez wirowanie.Usuń wszystkie oprócz ostatnich pięciu do 10 mikrolitrów mętnego supernatantu i dodaj trzy mililitry pożywki Neurobaseal A uzupełnionej bydlęcą surowicą wzrostu do komórek. Ostrożnie ponownie zawiesić osad komórek i zwiększyć ostateczną objętość do 15 mililitrów za pomocą świeżego podłoża Neurobasal A zawierającego 10% surowicy wzrostu bydła. Przefiltruj roztwór komórkowy przez sitko o średnicy 40 mikronów do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i zwiększ końcową objętość do 30 mililitrów za pomocą świeżej pożywki Neurobaseal A zawierającej 10% surowicy wzrostu bydła.Następnie podziel przefiltrowaną zawiesinę komórek między dwie stożkowe probówki o pojemności 15 mililitrów w celu odwirowania. i ponownie zawiesić granulki w 2,5 mililitra lodowatego bufora do magnetycznego sortowania komórek przed połączeniem komórek. Po zliczeniu ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w 90 mikrolitrach świeżego magnetycznego bufora do sortowania komórek na jeden raz 10 do siedmiu komórek.Następnie dodaj 10 mikrolitrów kulek anty-04 na jeden razy 10 do siedmiu komórek i wymieszaj roztwór komórkowy z delikatnym trzepaniem. Po 15 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym trześnięciem co pięć minut, delikatnie dodaj dwa mililitry magnetycznego bufora do sortowania komórek na jeden razy 10 do siedmiu komórek w celu przepłukania przez odwirowanie i wyrzuć supernatant przez ostrożne zasysanie próżniowe. Ponownie zawiesić granulat w 500 mikrolitrach świeżego magnetycznego bufora do sortowania komórek na każde 10 do siedmiu komórek i umieścić kolumnę sortującą kulki magnetyczne o odpowiedniej wielkości w odpowiednim separatorze magnetycznym.Umieść sitko o średnicy 40 mikronów na kolumnie i wstępnie przepłucz sitko trzema mililitrami magnetycznego buforu do sortowania komórek, pozwalając buforowi przepływać przez kolumnę bez wyschnięcia kolumny. Dodaj komórki do sitka, a następnie przepłucz je jednym mililitrem za pomocą magnetycznego bufora do sortowania komórek. Przemyć kolumnę trzy razy trzema mililitrami buforu do sortowania komórek magnetycznych na mycie i jeden raz pożywką do proliferacji oligodendrocytów.Następnie przenieś kolumnę do 15-mililitrowej probówki i użyj tłoka, aby natychmiast przepłukać pięć mililitrów świeżej pożywki proliferacyjnej oligodendrocytów przez kolumnę. Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do odpowiedniej gęstości posiewu i zastąpić lamininę z wstępnie pokrytych szkiełek nakrywkowych na 24-dołkowej płytce ze 100 mikrolitrami pożywki do proliferacji oligodendrocytów. Inkubować oligodendrocyty w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 nie dłużej niż 45 minut, aby zwiększyć przyczepność oligodendrocytów do szkiełek nakrywkowych.Następnie zalej każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 500 mikrolitrami pożywki do proliferacji oligodendrocytów na 24-godzinną inkubację. Następnego dnia zastąp supernatanty pożywką różnicującą oligodendrocyty i włóż komórki z powrotem do inkubatora, aż będą gotowe do utrwalenia. 24 godziny po posiewie komórki wydają się być dwu- lub trójbiegunowe w mikroskopii z kontrastem fazowym, co jest charakterystyczną cechą proliferujących oligodendrocytów we wczesnym stadium.Barwienie immunofluorescencyjne pokazuje, że 24 godziny po posiewie większość tych pre-oligodendrocytów wykazuje również znakowanie NG2 i O4, podczas gdy znakowanie GFAP i przeciwciałem anty-01 jest znacznie mniej powszechne, co sugeruje, że większość komórek na tym etapie ae pre-oligodendrocyty z kilkoma niedojrzałymi lub dojrzałymi oligodendrocytami. Po 72 godzinach morfologia oligodendrocytów wydaje się być bardziej złożona niż po 24 godzinach, a częstość komórek dodatnich dla wczesnego markera oligodendrocytów, NG2, jest znacznie mniejsza. Ponadto większość komórek wykazuje znakowanie O4, a prawie połowa komórek jest wybarwiona na obecność przeciwciała 01 na tym etapie, co sugeruje, że komórki różnicują się w bardziej dojrzały fenotyp.Warto zauważyć, że obecność astrocytów pozostaje niezwykle niska. Wyniki te wskazują, że z biegiem czasu immunomagnetycznie izolowane oligodendrocyty są w stanie różnicować się in vitro do trzeciego etapu dojrzewania przy bardzo małym zanieczyszczeniu innych typów komórek, takich jak astrocyty. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować pierwotne oligodendrocyty od nowonarodzonych szczeniąt myszy za pomocą izolacji immunomagnetycznej.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Dzięki za oglądanie. Powodzenia w eksperymentach.

rapid-specific-immunomagnetic-isolation-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie opisujemy protokół izolacji komórek CD11b, w tym mikrogleju, z mózgów młodych myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie. Tkanki mózgowe są homogenizowane w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek, które są inkubowane z mikrokulkami pokrytymi przeciwciałem anty-CD11b, a następnie rozdzielane na podstawie kolumny magnetycznej w celu oczyszczenia populacji komórek CD11b +.

Izolacja magnetyczna mikrogleju z mózgów młodych myszy

Ten film demonstruje technikę izolacji i hodowli komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) z kory mózgowej szczeniąt myszy.

Izolowanie i hodowla komórek prekursorowych oligodendrocytów z kory mózgowej szczeniąt myszy

Ten film demonstruje metodę izolowania pierwotnych komórek oligodendrocytów z zawiesiny komórek nerwowych uzyskanej od mysiego szczeniaka za pomocą separacji magnetycznej. Technika ta wykorzystuje kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami specyficznymi dla antygenów oligodendrocytów, co umożliwia selektywną izolację tych komórek.

Izolowanie mysich pierwotnych oligodendrocytów za pomocą kulek immunomagnetycznych

Ten film demonstruje protokół ekstrakcji komórek mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgach myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek. Protokół obejmuje preparację uszkodzonej tkanki mózgowej zawierającej komórki mikrogleju, potraktowanie tkanki określonymi enzymami w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki oraz wykorzystanie kulek magnetycznych specyficznych dla receptora mikrogleju do wyizolowania komórek mikrogleju.

Izolowanie mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgu myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek aktywowanych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.

Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Opisujemy protokół izolowania komórek mikrogleju z podwzgórza myszy (lub równoważnych małych struktur mózgu) za pomocą magnetycznie aktywowanego sortowania komórek (MACS), w stosunkowo krótkim czasie. Mikroglej podwzgórza sortowany przez MACS może być używany do analizy ex vivo i może być posiany w celu przeprowadzenia testów in vitro.

Izolacja mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie

Poznaj szybką izolację immunomagnetyczną pierwotnych oligodendrocytów myszy do badań nad mielinizacją. Ta metoda zapewnia ponad 80% czystość komórek w około godzinę, umożliwiając badanie biologii komórkowej i chorób demielinizacyjnych.

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Przeglądaj więcej filmów