Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Ogólnym celem tej techniki jest wykorzystanie izolacji immunomagnetycznej do selekcji oligodendrocytów O4-dodatnich od nowonarodzonych szczeniąt myszy do analizy ich hodowli in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurologii związane z badaniem chorób wpływających na mielinę i mielinizację. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona przygotowanie końcowej hodowli oligodendrocytów o czystości większej niż 80% w ciągu około godzinnych godzin.

Zacznij od użycia małych nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej skóry głowy myszy w ciągu pięciu do siedmiu dni po urodzeniu. Cofnij płat skóry, aby odsłonić czaszkę, i ostrożnie przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej od otworu z tyłu do obszaru czołowego. Od otworu w tylnej części czaszki przetnij w kierunku każdego oczodołu wzdłuż podstawy kości i użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie odsunąć korę mózgową od śródmózgowia.

Następnie przenieś korę do 60-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego siedem mililitrów B-27 Neurobasal A Medium. Kiedy wszystkie mózgi zostaną zebrane, przenieś korę do nowego 60-milimetrowego naczynia do hodowli tkanek zawierającego pięć mililitrów buforu dysocjacyjnego i użyj ostrza skalpela numer 15, aby pokroić korę na jeden sześcienny milimetrowy kawałek. Inkubuj fragmenty mózgu w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 20 minut.

Następnie dodaj jeden mililitr bydlęcej surowicy wzrostowej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej przenieś zawiesinę tkanki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i delikatnie rozdziel tkankę mózgową sześć do ośmiu razy za pomocą pipetowania. Pozwól, aby zdysocjowane kawałki tkanki osiadły przez dwie do trzech minut.

Następnie przenieść supernatant do świeżej probówki. Następnie dodaj trzy mililitry pożywki Neurobasal A, uzupełnionej bydlęcą surowicą wzrostu i DNazą I do tkanek i użyj pięciomililitrowej pipety, aby delikatnie zdysocjować tkanki za pomocą większego pipetowania. Widzisz, odpowiednia siła pipetowania ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wysokiej wydajności żywotnych komórek.

Jeśli pipetowanie jest zbyt trudne, żywotność może być niska. Natomiast jeśli pipetowanie jest zbyt delikatne, wydajność komórkowa może być niska. Pozwól kawałkom tkanki osiąść przez kolejne dwie do trzech minut.

Następnie przenieś supernatant do nowej probówki i dodaj do tkanki trzy mililitry świeżej pożywki Neurobaseal A, uzupełnionej bydlęcą surowicą wzrostu i DNazą I. Delikatnie oddzielić tkankę mózgową za pomocą końcówki pipety P-1000, aż nie pozostanie żaden duży fragment tkanki, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Użyj pipety o pojemności 10 mililitrów, aby przefiltrować roztwór komórkowy przez sitko o średnicy 70 mikronów do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i doprowadzić końcową objętość zawiesiny jednokomórkowej do 30 mililitrów za pomocą świeżej pożywki Neurobaseal A, uzupełnionej surowicą wzrostu bydła i DNazą I. Podziel zawiesinę komórkową na dwie 15-mililitrowe stożkowe probówki, i osadzać komórki nerwowe przez wirowanie.

Usuń wszystkie oprócz ostatnich pięciu do 10 mikrolitrów mętnego supernatantu i dodaj trzy mililitry pożywki Neurobaseal A uzupełnionej bydlęcą surowicą wzrostu do komórek. Ostrożnie ponownie zawiesić osad komórek i zwiększyć ostateczną objętość do 15 mililitrów za pomocą świeżego podłoża Neurobasal A zawierającego 10% surowicy wzrostu bydła. Przefiltruj roztwór komórkowy przez sitko o średnicy 40 mikronów do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i zwiększ końcową objętość do 30 mililitrów za pomocą świeżej pożywki Neurobaseal A zawierającej 10% surowicy wzrostu bydła.

Następnie podziel przefiltrowaną zawiesinę komórek między dwie stożkowe probówki o pojemności 15 mililitrów w celu odwirowania. i ponownie zawiesić granulki w 2,5 mililitra lodowatego bufora do magnetycznego sortowania komórek przed połączeniem komórek. Po zliczeniu ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w 90 mikrolitrach świeżego magnetycznego bufora do sortowania komórek na jeden raz 10 do siedmiu komórek.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów kulek anty-04 na jeden razy 10 do siedmiu komórek i wymieszaj roztwór komórkowy z delikatnym trzepaniem. Po 15 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym trześnięciem co pięć minut, delikatnie dodaj dwa mililitry magnetycznego bufora do sortowania komórek na jeden razy 10 do siedmiu komórek w celu przepłukania przez odwirowanie i wyrzuć supernatant przez ostrożne zasysanie próżniowe. Ponownie zawiesić granulat w 500 mikrolitrach świeżego magnetycznego bufora do sortowania komórek na każde 10 do siedmiu komórek i umieścić kolumnę sortującą kulki magnetyczne o odpowiedniej wielkości w odpowiednim separatorze magnetycznym.

Umieść sitko o średnicy 40 mikronów na kolumnie i wstępnie przepłucz sitko trzema mililitrami magnetycznego buforu do sortowania komórek, pozwalając buforowi przepływać przez kolumnę bez wyschnięcia kolumny. Dodaj komórki do sitka, a następnie przepłucz je jednym mililitrem za pomocą magnetycznego bufora do sortowania komórek. Przemyć kolumnę trzy razy trzema mililitrami buforu do sortowania komórek magnetycznych na mycie i jeden raz pożywką do proliferacji oligodendrocytów.

Następnie przenieś kolumnę do 15-mililitrowej probówki i użyj tłoka, aby natychmiast przepłukać pięć mililitrów świeżej pożywki proliferacyjnej oligodendrocytów przez kolumnę. Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do odpowiedniej gęstości posiewu i zastąpić lamininę z wstępnie pokrytych szkiełek nakrywkowych na 24-dołkowej płytce ze 100 mikrolitrami pożywki do proliferacji oligodendrocytów. Inkubować oligodendrocyty w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 nie dłużej niż 45 minut, aby zwiększyć przyczepność oligodendrocytów do szkiełek nakrywkowych.

Następnie zalej każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 500 mikrolitrami pożywki do proliferacji oligodendrocytów na 24-godzinną inkubację. Następnego dnia zastąp supernatanty pożywką różnicującą oligodendrocyty i włóż komórki z powrotem do inkubatora, aż będą gotowe do utrwalenia. 24 godziny po posiewie komórki wydają się być dwu- lub trójbiegunowe w mikroskopii z kontrastem fazowym, co jest charakterystyczną cechą proliferujących oligodendrocytów we wczesnym stadium.

Barwienie immunofluorescencyjne pokazuje, że 24 godziny po posiewie większość tych pre-oligodendrocytów wykazuje również znakowanie NG2 i O4, podczas gdy znakowanie GFAP i przeciwciałem anty-01 jest znacznie mniej powszechne, co sugeruje, że większość komórek na tym etapie ae pre-oligodendrocyty z kilkoma niedojrzałymi lub dojrzałymi oligodendrocytami. Po 72 godzinach morfologia oligodendrocytów wydaje się być bardziej złożona niż po 24 godzinach, a częstość komórek dodatnich dla wczesnego markera oligodendrocytów, NG2, jest znacznie mniejsza. Ponadto większość komórek wykazuje znakowanie O4, a prawie połowa komórek jest wybarwiona na obecność przeciwciała 01 na tym etapie, co sugeruje, że komórki różnicują się w bardziej dojrzały fenotyp.

Warto zauważyć, że obecność astrocytów pozostaje niezwykle niska. Wyniki te wskazują, że z biegiem czasu immunomagnetycznie izolowane oligodendrocyty są w stanie różnicować się in vitro do trzeciego etapu dojrzewania przy bardzo małym zanieczyszczeniu innych typów komórek, takich jak astrocyty. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować pierwotne oligodendrocyty od nowonarodzonych szczeniąt myszy za pomocą izolacji immunomagnetycznej.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Dzięki za oglądanie. Powodzenia w eksperymentach.