Mikrofabrykowane detektory w postaci macierzy słupków (mPADs): podejście do izolowania sił mechanicznych

Witajcie, jestem Nathan Snia Decky, a wraz ze mną są dziś Wes Ligan, Robbie Desai oraz Mike Yang. Pochodzimy z laboratorium Chrisa Chena na University of Pennsylvania. W tym filmie przedstawimy naszą metodę pomiaru sił przyciągania komórkowego przy użyciu mikrofabrykowanej macierzy słupków.

Siły trakcyjne są generowane poprzez oddziaływania miozyny i aktyny i odgrywają ważną rolę w naszej fizjologii. Podczas rozwoju umożliwiają one komórkom przemieszczanie się z jednego miejsca w drugie w celu formowania wczesnych struktur naszych tkanek. Pomagają one również w procesie gojenia, ponieważ są niezbędne do zamykania się ran oraz migracji i pełzania leukocytów w organizmie.

Niestety te same siły mogą być szkodliwe dla naszego zdrowia w przypadku przerzutów nowotworowych lub wzrostu naczyń krwionośnych w kierunku guza. Istnieje zatem bardzo niewiele metod, które pozwalają na rzeczywisty pomiar tych sił trakcyjnych w sposób ilościowy, zwłaszcza w skali mikro i nano pojedynczych komórek. Większość powszechnych metod badania komórek in vitro wykorzystywała szalki z dna szklanego lub szalki polistyrenowe, jednak są to podłoża bardzo sztywne i nie pozwalają one na fizyczny pomiar sił trakcyjnych oraz odkształceń wywoływanych przez komórkę.

W związku z tym, bez zastosowania fizycznego odczytu, zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw sił trakcyjnych było bardzo trudne. Dlatego w laboratorium Chrisa Chena opracowaliśmy technikę, która pozwala nam pokonać te ograniczenia. Nasza metoda opiera się na pionowej macierzy elastycznych wsporników, których sztywność i skala rozmiarów są dobrane w taki sposób, aby pojedyncze komórki rozprzestrzeniały się na wielu wspornikach, powodując ich ugięcie w tym procesie.

Wymiary, których używamy najczęściej, to cylindryczne słupki o średnicy 3 µm i wysokości 10 µm, rozmieszczone w układzie prostokątnym z odstępem 9 µm od środka do środka. Wymiary te można jednak zmieniać, aby dostosować je do różnych badań komórkowych. Zaczynamy od sztywnej matrycy krzemowej, którą widać tutaj, a następnie przenosimy ją na elastyczne wsporniki PDMS, widoczne tutaj.

Wykorzystując tę technikę możemy mierzyć ugięcia poszczególnych belek wspornikowych pod mikroskopem i na tej podstawie wyznaczyć siły trakcyjne komórek o wielkości i kierunku niezbędnym do wywołania takich ugięć. Przekształciliśmy te podłoża w podkładki M służące jako detektory w postaci macierzy mikrosłupków, a w tym filmie pokażemy, jak wykonać podkładki M, zaczynając od matrycy silikonowej, poprzez replikację z PDMS, aż po końcowe obliczenia modulacji i kurczliwości komórkowej. Cześć, znajdujemy się teraz w czystym pomieszczeniu naszego laboratorium.

Jest to pomieszczenie wolne od kurzu i zaciemnione, które umożliwia nam wykonanie słupków z SU-8, służących jako matryca krzemowa. Zaczynamy od płytki krzemowej, którą powlekamy fotorezystem SU-8; SU-8 jest rezystem negatywowym i jest światłoczuły. W związku z tym, gdy naświetlamy go przez maskę fotograficzną, światło nadaje kształt mikro-słupkom, tworząc strukturę trójwymiarową, w postaci słupków SU-8, z których następnie odlewamy PDMS.

Po zakończeniu wszystkich procesów podłoże krzemowe będzie wyglądać w ten sposób; widoczne są na nim już wytworzone struktury w postaci mikrofilarów i mikrosłupków. Aby przygotować matryce, zaczynamy od czystego podłoża krzemowego, które zostało oczyszczone poprzez siedmiominutową obróbkę ozonem, a następnie odwodnione przez 30 minut w temperaturze 120 °C. Następnie naniesiemy metodą spin-coatingu SU-8 2002, aby utworzyć bardzo cienką warstwę bazową dla słupków.

Ponieważ będziemy nanosić SU-8 metodą wirowania, założę maskę przeciwgazową. Wkładam wafel do tego uchwytu, usuwam z niego wszelkie zanieczyszczenia i umieszczam go na wirówce, sprawdzając, czy jest wycentrowany. Następnie wylewamy SU-8 2002 na jego powierzchnię. Po tym etapie rozpoczynamy wirowanie wafla. Następnie umieszczamy go na płycie grzewczej w celu przeprowadzenia wstępnego wygrzewania (soft bake).

Przez kolejną minutę kontynuujemy tę procedurę. Następnie przenosimy próbkę na płytkę grzejną ustawioną na 95 °C i inkubujemy przez dwie minuty.

Po zakończeniu tego etapu przejdziemy do naświetlania powierzchniowego w masce maskowniku. Zatem nanieśliśmy właśnie pierwszą warstwę SU-8 na ten podłoże krzemowe i teraz musimy poddać cały wafer naświetlaniu powierzchniowemu, aby stworzyć pierwszą warstwę bazową dla mikrosłupków. W tym celu należy zastosować dawkę naświetlania wynoszącą 70 mJ.

Musimy zatem zmierzyć rzeczywiste natężenie światła w naszym ekspozytorze masek. W tym celu umieszczamy miernik w ekspozytorze masek, a następnie poddajemy go naświetlaniu.

Tutaj znajduje się światło UV. Umieszczamy podłoże krzemowe w urządzeniu do wyrównywania masek. Tym razem nie używamy maski, aby móc naświetlić całą warstwę filmu.

Załóżmy migawkę, ustawmy czas naświetlania na jedną minutę i rozpocznijmy naświetlanie. Po upływie jednej minuty system kończy pracę i możemy wyjąć wafelek. Teraz musimy przeprowadzić wygrzewanie po naświetlaniu.

Właśnie zakończyliśmy naświetlanie wafla i teraz zastosujemy wysoką temperaturę, aby wywołać reakcję sieciowania dla tej pierwszej warstwy SU-8. Umieszczamy go na płycie grzejnej o temperaturze 65°C na jedną minutę, a następnie przenosimy na płytę grzejną o temperaturze 95°C na dwie minuty. Po zakończeniu tego dwuminutowego procesu wyłączamy płytę grzejną i pozwalamy waflu ostygnąć do temperatury pokojowej, co zajmuje około 30 minut.

Nałożyliśmy drugą warstwę SU-8 na ten podłoże krzemowe. Teraz musimy ją naświetlić przez maskę fotolitograficzną. Tym razem użyjemy filtra UV, aby zablokować głębokie promieniowanie UV.

Jest to szkło optyczne firmy Hoya, które jest dostępne w sprzedaży, ale tym razem musimy ponownie zmierzyć natężenie. Użyjemy więc luksomierza lub zastosujemy filtr u góry, aby zmierzyć natężenie światła po przefiltrowaniu. Następnie włożymy maskę do urządzenia do wyrównywania masek.

Ten przełącznik wytwarza podciśnienie, które utrzymuje maskę na miejscu. Następnie umieścimy ją w alignerze masek. Potem nałożymy na wierzch filtr, a następnie włożymy podłoże krzemowe.

Chcemy upewnić się, że kontakt jest prawidłowy, dlatego dociskamy go, a następnie rozpoczynamy naświetlanie. Po naświetlaniu wyjmujemy wafer z urządzenia do litografii. W ten sposób otrzymujemy obszary, które zostały selektywnie naświetlone. Przenosimy go teraz do pieca lub na płyty grzejne w celu przeprowadzenia wygrzewania po naświetlaniu.

Właśnie zakończyliśmy końcowe wygrzewanie po naświetlaniu (post-exposure bake), a teraz przystąpimy do wywoływania tego wafla, aby uzyskać struktury trójwymiarowe. W tym celu wypłuczemy go i wywołamy w PGMEA, co usunie nienaświetlone SU-8. Zaczynamy od umieszczenia wafla w naczyniu z PGMEA na dwie minuty przy łagodnym mieszaniu.

Pozostawię to na dwie minuty. Następnie przeniesiemy próbkę do drugiej szalki z P-G-M-E-A. Pozwoli to usunąć nasycony P-G-M-E-A z SU eight.

Po 10 sekundach przeniesiemy go do IPA. Pozwala to na wypłukanie P-G-M-E-A. Pozostawiamy go w tym roztworze przez 20 sekund, ponownie stosując delikatne mieszanie.

Obecnie mamy wolnostojące struktury słupków. Umieścimy je w heksanie, który charakteryzuje się niskim napięciem powierzchniowym. Przepłuczemy próbki przez pięć sekund najpierw w jednej, a następnie w drugiej porcji heksanu, po czym będziemy mogli je osuszyć strumieniem powietrza.

Właśnie zakończyliśmy wywoływanie wafla, a teraz umieścimy go na płycie grzewczej i będziemy powoli zwiększać temperaturę do 150°C. Wyższa temperatura powoduje dalsze sieciowanie SU-8, co zwiększa jego sztywność strukturalną; pozostawiamy go na płycie grzewczej na całą noc, zazwyczaj od 14 do 20 godzin. Następnie wyłączymy płytę grzewczą i pozwolimy waflu ponownie ostygnąć do temperatury pokojowej.

Zatem to, co musimy teraz zrobić, to pociąć ten wafelek do mniejszego rozmiaru. Chcemy w zasadzie przeciąć ten wafelek krzemowy i stworzyć mały chip obejmujący jedynie ten wewnętrzny wzór. Będzie on wyglądał podobnie do tej struktury, w której zostanie zastosowana żywica epoksydowa.

Następnie przykleimy ten chip do szkiełka przedmiotowego w ten sposób, co zapewni stabilne podparcie konstrukcyjne. Cięcie wafla jest w pewnym sensie sztuką, ale w praktyce można to zrobić, używając skrybera diamentowego i rozpoczynając od jednej krawędzi.

Ze względu na płaszczyzny krystaliczne, należy wykonać niewielkie nacięcie. Powoduje to powstanie pęknięcia, w które można następnie uderzyć tym narzędziem. Możemy to oddzielić i wykonywać kolejne cięcia, aż uzyskamy taką małą strukturę. Następnie szybko umieszcza się chip krzemowy na szkle i montuje go w odpowiednim miejscu. Pozostawia się go do utrwalenia.

Po zakończeniu procesu otrzymają się urządzenie podobne do tego. Zamocowaliśmy krzemową matrycę na tym szkiełku przedmiotowym, a teraz nałożymy powłokę z floy, która ułatwi późniejsze oddzielenie tej struktury od PDMS. Umieścimy chip w tym eksykatorku, a następnie naniemy kilka kropli trichlorosilanu do wnętrza eksykatorka.

Wykonujemy to wewnątrz dygestorium, ponieważ produktem ubocznym jest gaz chlorowodorowy, który jest bardzo żrący. Następnie zamykamy pokrywę, podłączamy urządzenie do pompy próżniowej i pozostawiamy je pod próżnią, aby proces osadzania trwał przez noc, co pozwoli na uzyskanie jednorodnej powłoki na całym waflu krzemowym. Cześć, jestem Wesley Ligan.

Jestem studentem studiów doktoranckich w laboratorium Christophera Chena. Na tym etapie Nate pokazał Państwu, jak stworzyć silikonową matrycę dla naszych podłoży ED. Jednak zanim będziemy mogli użyć tego narzędzia do pomiaru kurczliwości komórkowej, konieczne jest najpierw powielenie sztywnych struktur fotolitograficznych przy użyciu elastomerycznego polimeru silikonowego.

Naszym pierwszym zadaniem jest wykonanie negatywowego odlewu silikonowej matrycy, którą przygotowaliśmy wcześniej. Wykorzystujemy w tym celu elastomer silikonowy zwany PDMS lub polidimetylosiloksanem. Do polimeru PDMS dodajemy teraz czynnik sieciujący w stosunku 10:1.

Po odważeniu roztworu należy dokładnie wymieszać polimer PDMS z czynnikiem sieciującym. Mieszanie to wprowadza do roztworu liczne pęcherzyki powietrza, dlatego na tym etapie konieczne jest odgazowanie go w eksykatorze próżniowym.

Gdy PDMS zostanie całkowicie odgazowany, a wszystkie pęcherzyki powietrza wypłyną na powierzchnię i pękną, można go wyjąć z eksykatora próżniowego. Teraz możemy wykorzystać tę mieszaninę PDMS i czynnika sieciującego do wykonania negatywowej formy z naszego wzorca krzemowego. W tym celu używamy aluminiowej foremki do pieczenia, w której centralnie umieszczamy zamocowany wzorzec krzemowy.

Następnie ostrożnie wlewamy roztwór polimeru DGA do naczynia na wafel krzemowy, starając się zapobiec powstawaniu dodatkowych pęcherzyków powietrza. Zazwyczaj dążymy do tego, aby warstwa polimeru miała grubość około 1/4 cala. Można zauważyć, że proces ten nieuchronnie wprowadza do mieszaniny kilka pęcherzyków powietrza.

Teraz odstawiamy naczynie na około 30 minut, aby pęcherzyki powietrza mogły wypłynąć na powierzchnię i pęknąć. Widać, że po odstawieniu wciąż znajduje się kilka pęcherzyków powietrza na powierzchni PDMS. Ponieważ jednak znajdują się one na górnej powierzchni, możemy teraz użyć krótkiego podmuchu azotu, aby usunąć wszystkie pozostałe pęcherzyki.

W celu pełnego sieciowania roztworu PDMS i sieciowania (CROSSLINKER) oraz wytworzenia sztywnej formy negatywowej naszego wzorca krzemowego, wypiekamy go w temperaturze 110 °C przez 20 minut. Można zauważyć cienką warstwę PDMS na powierzchni podłoża silikonowego. Przed oddzieleniem obu warstw konieczne jest najpierw odcięcie tej warstwy.

Następnie możemy zaszczepić tę górną warstwę i ostrożnie oddzielić ją od podłoża krzemowego. W tym momencie możemy odwrócić i bardzo powoli odkleić negatywowe podłoże krzemowe, czyli negatywowe podłoże PDMS, od formy krzemowej. Robimy to, przytrzymując jeden koniec i delikatnie odrywając podłoże PDMS.

Można zauważyć postęp frontu w miarę oddzielania się podłoża od formy silikonowej. Po przygotowaniu negatywowej formy z PDMS na podstawie formy silikonowej, możemy podzielić ją na cztery oddzielne formy negatywowe w celu wykonania końcowych podłoży podkładów. Na tym etapie ważne jest, aby nie dotykać górnej powierzchni podłoża negatywowego pincetą ani rękawiczkami, aby uniknąć uszkodzenia powierzchni.

W tym momencie przygotowaliśmy cztery oddzielne formy negatywowe z silikonowej matrycy składającej się z otworów o średnicy 3 µm i głębokości 9 µm. Aby odtworzyć wypukłe powierzchnie wsporników, możemy ponownie wykonać odlewy z tych form negatywowych, wykorzystując PDMS firmy PDI. Jednak zanim to zrobimy, konieczne jest uprzednie nadanie tym formom negatywowym właściwości nieprzylepnych poprzez pokrycie ich fluoro-silanem.

Proces ten przeprowadzamy w komorze plazmowej o mocy 100 W przy pełnej mocy przez jedną minutę. Po odpompowaniu zawartości komory ponownie uruchamiamy plazmę, co generuje pole gazu jonowego, które trawni górną powierzchnię PDMS i zwiększa jej przyleganie do cząsteczek fluoro Cy Lane. Po usunięciu negatywowych form z desykatora próżniowego można zauważyć, że otrzymaliśmy macierz otworów o głębokości 3 µm na 10 µm w nieprzylepnej warstwie PDMS.

Aby zregenerować pionowe wsporniki wykorzystywane w podłożach mpad, konieczne jest ponowne odlewanie z użyciem tej samej mieszaniny PDMS, co pozwoli na uzyskanie wolnostojącej macierzy pozytywowych wsporników elastomerowych, będących identycznym odbiciem wcześniej wykonanego wzorca krzemowego. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest przeniesienie nieprzylegających form negatywowych na uchwyt montażowy wykonany z pasków PDMS i szkiełka przedmiotowego do mikroskopu. Cel zastosowania tego oprzyrządowania stanie się jasny w następnym kroku.

W tym momencie na górną powierzchnię każdej z form negatywowych możemy nanieść małą kroplę tej samej, uprzednio odgazowanej mieszaniny PDMS i utwardzacza w stosunku 10:1. Należy użyć niewielkiej ilości PDMS, aby nie wypłynęła ona poza krawędź form negatywowych. W tym momencie.

Aby bardziej równomiernie rozprowadzić PDMS na górnej powierzchni form, możemy chwycić jedną z nich pęsetą, odwrócić ją i zetknąć z sąsiednią formą, ostrożnie rozprowadzając PDMS tak, aby całkowicie pokrył cały podłoże. Należy zachować szczególną ostrożność na tym etapie, aby nie wprowadzić dodatkowych pęcherzyków powietrza do górnej warstwy roztworu PDMS; następnie czynność tę można powtórzyć z pozostałymi dwiema formami. Po uzyskaniu bardziej jednorodnej powłoki PDMS na górnej powierzchni, możemy umieścić ten uchwyt w eksykatorze próżniowym, aby dodatkowo usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły zostać uwięzione w filmie PDMS na wierzchu naszych form negatywowych.

Proces ten trwa zazwyczaj około 30 minut. Podczas odgazowywania form negatywowych możemy wyczyścić szklane podłoża o wymiarach 22 na 22 milimetrów, które posłużą jako końcowe miejsce montażu padów. Pierwszym krokiem w tym procesie jest przedmuchanie podłoży sprężonym azotem w celu usunięcia cząsteczek kurzu.

Szklane laminki zostaną poddane działaniu plazmy gazowej, co spowoduje wypalenie powierzchni i zwiększy jej przyczepność do PDMS, który przykleimy w kolejnym kroku. Po pozostawieniu górnej warstwy PDMS do DGAs na około 30 minut oraz aktywacji plazmowej szklanych laminek, możemy usunąć szablon i doprowadzić górną powierzchnię szklanych laminek, która była wystawiona na działanie plazmy gazowej, do kontaktu z warstwą PDMS znajdującą się na wierzchu form negatywowych. Zazwyczaj pomocne jest doprowadzenie najpierw jednej krawędzi szklanej laminki do kontaktu z PDMS, a następnie pozwolenie reszcie laminki na osadzenie się w SH, tak aby PDMS rozprzestrzenił się w formie arkusza.

Pomaga to zredukować pęcherzyki powietrza wprowadzone do folii PDMS. Na tym etapie możemy delikatnie nacisnąć pęsetą górną powierzchnię szkiełka nakrywkowe, aby usunąć nadmiar PDMS oraz dosunąć szkiełko do krzyża z PDMS w centrum szablonu. Zapobiegnie to przemieszczaniu się szkiełka podczas utwardzania PDMS.

Powtarzamy tę procedurę dla pozostałych podłoży. Na tym etapie możemy przenieść cały szablon do piekarnika i wypalać w temperaturze 110 °C przez 22 godziny. Po ostygnięciu całego układu do temperatury pokojowej możemy wyjąć podłoża, odwrócić je i ostrożnie oddzielić negatywową formę od szklanego okienka podstawowego.

Ważne jest, aby wykonywać tę czynność powoli i równomiernie, aby uniknąć zmiażdżenia słupków lub ich oderwania od szklanego podłoża. Możemy zauważyć, że po oddarciu negatywowej formy otrzymujemy macierz wsporników, która dokładnie odwzorowuje matrycę krzemową, z tą różnicą, że teraz są one wykonane z elastycznego elastomeru PDMS. W tym momencie omówiliśmy sposób generowania matrycy krzemowej dla naszych podłoży Emad.

Następnie zastosowaliśmy proces odlewania replikacyjnego, aby stworzyć dokładną kopię z wykorzystaniem polimeru elastomerowego PDMS, dzięki czemu wsporniki stały się elastyczne, co pozwala komórce na rozprzestrzenianie się, kurczenie i w ten sposób uginanie wsporników. Na tym etapie nasze podłoża są gotowe do przygotowania pod kątem hodowli komórkowej. Po zapoznaniu się ze sposobem wytwarzania i powielania form do tworzenia EDS, wykonamy jeszcze kilka kroków, aby uczynić EDS funkcjonalnymi, co umożliwi nam hodowlę komórek i późniejszą analizę sił trakcyjnych.

Zanim jednak to zrobimy, musimy wykonać trzy czynności. Po pierwsze, musimy sprawić, aby końcówki słupków były adhezyjne dla komórek. Po drugie, musimy oznakować PDMS fluorescencyjnie, aby ułatwić wizualizację i analizę ugięć słupków.

Po trzecie, musimy sprawić, aby ścianki boczne oraz podstawa słupków były nieprzylepne dla komórek, tak aby siły trakcyjne były wywierane wyłącznie na końcówkach słupków. W kolejnych minutach zobaczymy, jak przebiegają te etapy z wykorzystaniem strategii opartej na mikro druku kontaktowym. Jednak najpierw, następnym krokiem jest usunięcie nadmiaru PDMS z powierzchni.

Zatem, jak wspomniałem, pierwszym krokiem jest pobranie podłoża EDS, którego przygotowanie i przycinanie zostało przed chwilą zaprezentowane. Nadmiar PDMS, który powstał w wyniku utwardzania szklanego szkiełka nakrywkowego przeciwko negatywowej formie, należy odciąć za pomocą ostrego ostrza brzytwy. Nadmiar PDMS usuwa się poprzez pionowe przyłożenie ostrza brzytwy do podłoża przy krawędzi filarów, a następnie zeskrobanie go.

Można przytrzymać szkiełko nakrywkowe jednym palcem, aby zapobiec jego przesunięciu. W efekcie otrzymujemy podłoże M pad oczyszczone z zanieczyszczeń, co zapewnia łatwy dostęp do powierzchni. W kolejnym kroku musimy wykonać mikrokontaktowy druk MPAs, aby nadać końcówkom słupków właściwości adhezyjne.

Aby to osiągnąć, musimy najpierw przygotować stempli, a proces ten jest bardzo prosty. Mieszamy PDMS, stosując zamiast proporcji 10:1 stosunek 1:30:1. Wlewamy mieszaninę do szalki Petriego tak, aby wysokość PDMS wynosiła około 1 cm.

Pozostawcie go do odpowietrzenia, aby pęcherzyki powietrza wypłynęły na powierzchnię PDMS, a następnie przeprowadźcie reakcję sieciowania w piekarniku w temperaturze 60 stopni przez jedną godzinę. Po wyjęciu naczynia z piekarnika i jego ochłodzeniu można przystąpić do wycinania stempli. Ponownie, używając tego samego rodzaju żyletki, należy po prostu ciąć, naciskając pionowo w dół przez PDMS, aż do kontaktu z dnem szalki Petriego.

Teraz należy zwrócić uwagę na orientację stempla. Powierzchnią stempla będzie ta strona PDMS, która została odlana przy dnie szalki Petriego, aby pozostała płaska. Zatem w tym wyciętym dużym kwadracie PDMS powierzchnia stempla jest obecnie skierowana do góry.

Obecnie stempel ten jest znacznie większy niż podkładki M, więc przytnę go ponownie do rozmiaru pojedynczej podkładki M za pomocą żyletki. Ponieważ bardzo trudno jest określić prawidłową orientację stempla na oko, zrobię małe wcięcie z tyłu stempla, czyli od strony niebędącej stroną roboczą, w ten sposób. Następnie mogę usunąć stempel z większej płytki. Mam teraz stempel A-P-D-M-S do kolejnego kroku.

Należy oczyścić stempli PDMS. Jest bardzo prawdopodobne, że podczas ich wycinania na stemplach PDMS osiadł kurz z otoczenia. Proces ten polega na umieszczeniu odpowiedniej liczby stempli PDMS w naczyniu krystalizacyjnym i zalaniu ich 100% etanolem.

Należy dodać tyle etanolu, aby pokrył powierzchnię stempli, przy czym dokładna ilość dodanego etanolu nie ma znaczenia. Następnie należy umieścić dysk krystalizacyjny w rotatorze i poddać stemple sonikacji przez pięć minut. Po upływie pięciu minut zakończymy sterylizację stempli i przeprowadzimy pozostałą część mikrodośladu kontaktowego, czyli funkcjonalizację podkładek M, w sterylnej komorze do hodowli tkanek.

Obecnie znajdujemy się w komorze do hodowli tkankowej, gdzie możemy dokończyć sterylizację stempli. W tym celu wyjmujemy stemple z naczynia do krystalizacji, zanurzamy je w naczyniu z etanolem, aby wypłukać wszelkie pozostałości zanieczyszczeń, a na koniec zanurzamy je w naczyniu z wodą, aby usunąć etanol. Następnie, za pomocą strumienia azotu, osuszamy stemple, aż do całkowitego usunięcia widocznych kropel.

W kolejnym kroku należy nanieść na stemplowanie roztwór białka. Wykorzystywany roztwór białka to 50 µg/ml fibryny w wodzie DEl. Należy pobrać niewielką ilość roztworu białka do pipety i nanieść krople roztworu na powierzchnię stempla.

Należy to zrobić, nanosząc niewielkie kropelki na krawędź powierzchni stempla. Najpierw powtórz tę czynność dla wszystkich używanych stempli; powinno to zostać wykonane z wyprzedzeniem. Kolejnym krokiem po naniesieniu kropek na krawędzie wszystkich stempli jest połączenie tych kropelek i wypełnienie powierzchni stempla roztworem białka.

Powodem zastosowania tej metody jest fakt, że roztwór białka w kropelkach oraz pod nimi sprawia, iż powierzchnia stempla staje się hydrofilowa, co ułatwia rozprowadzanie białka macierzy pozakomórkowej. Należy powtórzyć tę czynność dla wszystkich używanych stempli. Po rozprowadzeniu roztworu białka na powierzchni stempli ostatnim etapem ich nanoszenia jest upewnienie się, że krawędzie są pokryte. Aby to osiągnąć, należy po prostu przechylić pipetę i prowadzić ją wzdłuż powierzchni stempla w taki sposób, aby stykała się ona jednocześnie z narożnikiem stempla z PDMS oraz z roztworem białka.

Ponownie powtórz tę czynność dla wszystkich krawędzi wszystkich stempli, które nakładasz atramentem. Po zakończeniu nakładania atramentu na stemple, odstawiamy je i pozostawiamy w komorze do hodowli tkankowych na jedną godzinę, aby ułatwić całkowłą absorpcję białka na powierzchni stempla. Po odczekaniu godziny, aż białka zostaną wchłonięte przez powierzchnię stempli, należy je wypłukać wodą, a następnie osuszyć strumieniem azotu.

Aby to zrobić, należy użyć sterylnej wody i wlać ją do naczynia zawierającego stempla. Należy uważać, aby nie wlewać wody bezpośrednio na powierzchnię stempla; w razie potrzeby można użyć pipety. Dokładna ilość wody nie jest istotna, o ile poziom wody znajdzie się powyżej roztworu białka.

Następnie, za pomocą sterylnej pincety, należy pobrać jedną stempelkę, zanurzyć ją w nowym naczyniu z wodą, a następnie delikatnie osuszyć strumieniem azotu. Ponownie, o wyschnięciu świadczyć będzie moment, w którym na stempelce nie będą już widoczne krople roztworu białka. Czynność tę należy powtórzyć dla wszystkich przetwarzanych po kolei stempelkek.

Teraz, gdy opuszki zostały wypłukane i osuszone, należy aktywować podłoża mpad poprzez traktowanie ich ozonem UV. Przez siedem minut zdejmuję pokrywkę z dania Petriego. Ponieważ polistyren pochłania promieniowanie UV, umieszczam danie w urządzeniu do traktowania ozonem UV, zamykam szufladę, ustawiam czas na siedem minut i uruchamiam proces.

Powracamy teraz do komory z laminarnym przepływem powietrza, aby wykonać odbicie na podłożach mpad, które zostały przed chwilą poddane działaniu ozonu UV. W tym celu za pomocą pęsety podnieś wypłukane i osuszone stemplowanie. Stemplami można manipulować, trzymając je za boki, jednak nie należy dotykać ich powierzchni roboczej.

Należy wyregulować stempel w pęsecie tak, aby strona z białkiem była dostępna. Następnie odwraca się pęset, pamiętając, że strona z białkiem jest skierowana w dół, i powoli doprowadza stempel do kontaktu z eds. Stemple od 1 do 30 są dość lepkie, więc może być konieczne użycie drugiej pary pęset, aby zwolnić stempel z pęsety.

Stempel można opuścić z wysokości od około dwóch milimetrów do około ośmiu milimetrów na emedy. Następnie należy przechylić naczynie z emedami i delikatnie docisnąć pęsetą, aby nawiązać kontakt między stemplami a edami. O nawiązaniu kontaktu można się dowiedzieć na jeden z dwóch sposobów.

Pierwsza metoda polega na obserwacji powierzchni ED przez bok stempla. Może to być trudne do zauważenia na nagraniu, ale patrząc bezpośrednio, wyraźnie widzę, że stempel styka się z powierzchnią. Drugim sposobem na zapewnienie kontaktu z p jest wyjęcie szalki Petriego z komory do hodowli tkankowej z zamkniętą pokrywką i obejrzenie jej pod mikroskopem odwróconym.

Dzięki wizualizacji wzorów interferencyjnych za pomocą mikroskopu powinni Państwo być w stanie określić, czy i w którym momencie stempel styka się z podłożem ed. Po stwierdzeniu kontaktu stempel musi pozostać w kontakcie z podłożem ed przez kilka sekund. Jest to zatem moment, w którym należy usunąć stempel.

Aby to zrobić, przygnij krawędzie za pomocą jednej pęsety i jednym płynnym ruchem odklej stempel. Należy monitorować, które krawędzie zostały ostemplowane oraz których stempli użyto wcześniej. Powtórz tę procedurę raz dla każdego EMPA dla każdego podłoża, którego zamierzasz użyć.

Po wykonaniu stemplowania EMPA kolejnym krokiem jest ich sterylizacja, a następnie inkubacja w barwniku lipofilowym o nazwie dye eye. Dai jest cząsteczką lipofilową znakowaną fluorescencyjnie, dzięki czemu dyfunduje ona do PDMS w określonym czasie, co pozwala nam na wizualizację odkształceń słupków pod mikroskopem. W związku z tym wezmę każdy podłoże EMPA po kolei i zanurzę je w 100% etanolu, 70% etanolu, wodzie DI, wodzie DI, wodzie DI, wodzie DI.

I na koniec, roztwór dii o stężeniu five microgram per mil. Roztwór DII jest fluorescencyjny, więc aby zminimalizować jego ekspozycję na światło otoczenia i ograniczyć fotowyblaknięcie, przykrywamy szalki folią aluminiową podczas inkubacji w komorze do hodowli tkanek przez jedną godzinę. Po upływie godziny inkubacji podkładek EM w roztworze DAI, możemy usunąć folię aluminiową i wypłukać roztwór DAI.

Płuczemy je, wykonując trzy kolejne zanurzenia w sterylnej wodzie, a na koniec zanurzamy w roztworze 0,2% onic F1 27. Jest to stężenie 0,2% wagowo w objętości. Podczas wszystkich etapów zanurzania ważne jest, aby zminimalizować czas ekspozycji podkładek EM na powietrze. Ma to na celu zapobieganie uszkodzeniu podłoży ED, a w szczególności zapobieganie zapadnięciu się dwóch słupków na siebie.

0,2% roztwór F1 27 to trójblokowy kopolimer składający się z domen hydrofilowych i hydrofobowych. Domena hydrofilowa jest znana z tego, że zapobiega absorpcji białek, a co za tym idzie – adhezji komórek, podczas gdy domena hydrofobowa wiąże się z hydrofobowym PDMS. W związku z tym, po namoczeniu PDMS w F1 27, kopolimer F1 27 wiąże się z PDMS i zapobiega adhezji komórek.

Po jednej godzinie inkubacji w roztworze chronic F1 27 w szalce Petri przykrytej folią aluminiową, można wypłukać F1 27 poprzez sekwencyjne zanurzanie w wodzie sterylnej, wodzie sterylnej i PBS. Po zanurzeniu w PBS i wypłukaniu produktu F1 27, można następnie zanurzyć podłoża eds w wybranym roztworze do hodowli komórkowej. Roztwór do hodowli komórkowej, w którym właśnie zanurzono EMPAs, może zawierać surowicę i/lub inne czynniki wzrostu i/lub suplementy, takie jak penicylina i streptomycyna.

Wszystkie te składniki są w pełni kompatybilne z zabiegami EMPAs. Kolejnym krokiem, po zanurzeniu eds w roztworze do hodowli komórkowej, jest wysianie wybranych komórek na eds. W tym konkretnym układzie eksperymentalnym wysieję komórki śródbłonka tętnicy płucnej bydła do trzech różnych naczyń.

Powodem, dla którego używam trzech różnych szalek, jest fakt, że dwie z nich potraktuję znanymi inhibitorami taktylności, aby zahamować ugięcia słupków, co pozwoli nam na przeprowadzenie analizy w późniejszym czasie. Aby wysiać komórki, po prostu pobieram odpowiednią ilość zawiesiny komórkowej do pipety i n nanoszę ją kroplami do każdej szalki. Dodaję tyle komórek, aby podczas badania mierzącego siły trakcyjne komórki występowały na podłożu jako pojedyncze komórki.

Ilość dodawanych komórek zależy od powierzchni wysiewu oraz tempa wzrostu konkretnego rodzaju komórek. Zazwyczaj wysiewamy od 1500 do 5 000 komórek na centymetr kwadratowy podłoża. Po zakończeniu wysiewu komórek lub dodawaniu zawiesiny komórkowej kroplami do hodowli, należy delikatnie kołysać naczyniem kilka razy w kierunkach ortogonalnych, aby równomiernie rozprowadzić zawiesinę komórkową w szalce hodowlanej.

Powtórz ten proces dla wszystkich używanych podłoży. Bezpośrednio po wysianiu komórek umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy odpowiednim poziomie dwutlenku węgla, aby buforować pH i pożywkę do hodowli komórkowej. Około dwóch godzin po wysianiu komórek należy je przepłukać, przenosząc podłoża z jednej szalki z pożywką do nowej szalki zawierającej tę samą pożywkę do hodowli komórkowej.

Powodem tego płukania jest fakt, że większość komórek po dwóch godzinach zacznie się już rozprzestrzeniać i osiągnie niemal ostateczną powierzchnię rozprzestrzenienia. Płukząc komórki i podłoża, usuwa się wszelkie komórki pływające w pożywce hodowlanej. W ten sposób w końcowym teście sił trakcyjnych pojawią się tylko te komórki, które przyczepiły się do EDS i rozpoczęły proces rozprzestrzeniania.

Jednym z testów, które można przeprowadzić na komórkach hodowanych na MPAs, jest obrazowanie poklatkowe (time-lapse imaging) w celu ilościowego zbadania dynamiki kurczliwości komórkowej. Szczególnie interesująca jest dynamika kurczliwości komórek w odpowiedzi na czynniki rozpuszczalne. Znane jest, że czynniki rozpuszczalne, takie jak związki biologiczne i syntetyczne, mogą zwiększać, zmniejszać lub wywierać nieznane efekty na kurczliwość komórkową.

W tym eksperymencie na żywych komórkach będziemy używać tego odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego. Na stoliku mikroskopu znajduje się mała komora inkubacyjna podłączona do regulatora termicznego w celu utrzymania temperatury 37 °C oraz stężenia 5% CO2. Obrazowanie będziemy przeprowadzać przy dużym powiększeniu, korzystając z obiektywu 60 x plan APO.

Teraz przygotujemy podłoże z implantem do obrazowania. Obiektyw 60x, którego używamy do obrazowania, ma odległość roboczą wynoszącą 200 mikronów, co jest wartością znacznie mniejszą niż grubość szalki hodowlanej, w której wcześniej wysiano komórki. W związku z tym nie możemy obrazować komórek na implantach znajdujących się w szalce hodowlanej.

Aby rozwiązać ten problem, stosujemy szalki z szklanym dnem. Przeniosę teraz substrat do szalki z szklanym dnem w pozycji odwróconej, tak aby komórki i końcówki słupków znajdowały się na styku z szklanym dnem szalki. Dzięki temu, po umieszczeniu zestawu pod mikroskopem, odległość robocza między komórkami a obiektywem wynosi mniej niż 200 micronów.

Teraz możemy umieścić próbkę pod mikroskopem w celu obrazowania. Otworzę teraz komorę inkubatora do żywych komórek, umieszczę w niej próbkę, a następnie zamknę pokrywę komory inkubatora. W tym momencie przeskanuję podłoże w poszukiwaniu odpowiedniej komórki.

Aby wykonać obrazowanie, najskuteczniejszą metodą jest użycie obiektywu fazowego 10x, co pozwoli na obejrzenie szerszego pola podłoża i szybsze znalezienie komórki. Moim kryterium wyboru odpowiedniej komórki jest znalezienie pojedynczej komórki.

Komórka nie powinna stykać się z żadną z sąsiednich komórek, a jej rozmiar powinien być średni w porównaniu do wszystkich pozostałych komórek na podłożu; znalazłem odpowiednią komórkę do obserwacji. W następnym kroku zmienię obiektyw na 60 x, aby obejrzeć komórkę przy dużym powiększeniu. Aby to zrobić, należy odogniskować obiektyw, aby nie uderzył on o stoлик podczas obrotu.

Podczas obracania rewolweru należy otworzyć komorę i częściowo obrócić obiektyw 60x. Obiektyw 60x jest soczewką imersyjną, dlatego na soczewkę obiektywu należy nanieść kroplę oleju imersyjnego. Teraz dokończymy obracanie rewolweru, aby ustawić obiektyw 60x w pozycji roboczej. Zamkniemy komorę inkubatora i ponownie ustawimy ostrość obiektywu, aby komórka była wyraźnie widoczna.

Po precyzyjnym ustawieniu pozycji i ostrości komórki przełączę się na kamerę CCD, aby wyświetlić podgląd komórki na ekranie komputera, a następnie rozpocznę obrazowanie poklatkowe. W tym doświadczeniu będę gromadzić obrazy zarówno w kontraście fazowym, jak i fluorescencyjnym w odstępach jednominutowych. Obrazowanie poklatkowe zostało rozpoczęte i będę je kontynuować przez 10 minut lub do uzyskania 10 klatek; w tym momencie dodam serum. Minęło już 10 minut. Teraz otworzę komorę i dodam serum do szalki, aby stymulować kurczliwość komórki.

Licznik wciąż działa, więc muszę działać szybko. Teraz będziemy kontynuować obrazowanie komórki przez 30 minut, aby śledzić wszelkie zmiany w kurczliwości. Po zakończeniu obrazowania poklatkowego obrazy można złożyć w sekwencję, tworząc pokazany film. Oto dwa filmy przedstawiające obrazy w fazie i fluorescencji.

Po lewej stronie znajduje się film w kontraście fazowym przedstawiający niemal przezroczystą komórkę obrysowaną czarną linią. Komórka jest rozpostarta na wierzchołkach 20 słupków, które stanowią okrągłe struktury rozmieszczone w sieci prostokątnej. Po prawej stronie znajduje się film fluorescencyjny tej samej komórki, na którym widoczne są jedynie słupki.

Odtwarzając te filmy, można zauważyć, że słupki przymocowane do komórki są początkowo słabe, odchylone i w niewielkim stopniu odbiegają od sieci prostokątnej. W połowie filmu dodałem do pożywki surowicę. Surowica stymuluje komórkę do zwiększenia kurczliwości.

W miarę jak komórka wywiera większe siły trakcyjne na znajdujące się pod nią słupki, te położone wzdłuż obwodu komórki zaczynają uginać się do wewnątrz. Na filmie fluorescencyjnym widać teraz, że słupki znacząco odchylają się od swoich pozycji w sieci prostokątnej. Jak opiszę później, przesunięcie pozycji tych słupków na obrazach może zostać wykorzystane do analizy sił trakcyjnych tej komórki.

Wcześniej zobaczyliśmy, w jaki sposób przygotowaliśmy podłoża mpad oraz jak je funkcjonalizujemy w celu hodowli komórek. Zauważyli Państwo zapewne, że gotowe podłoża mpad umieściłem w trzech różnych naczyniach hodowlanych. Komórki rosły przez noc, a teraz zamierzam potraktować każde z naczyń innym rozpuszczalnym czynnikiem, który w znany sposób moduluje kurczliwość.

Możemy następnie w sposób ilościowy zmierzyć siły trakcyjne, które powstały po utrwaleniu komórek po 30 minutach. Po dodaniu czynników rozpuszczalnych, 30 minut po dodaniu inhibitorów kurczliwości, nadszedł czas na utrwalenie komórek za pomocą paraformaldehydu, aby zablokować aktualny stan sił trakcyjnych. Aby to osiągnąć, ważne jest użycie paraformaldehydu zawierającego wapń i magnez; stosujemy paraformaldehyd o stężeniu objętościowym 3,7%. Metoda zanurzania podłoży w paraformaldehydzie jest taka sama, jak metoda zanurzania podłoży w różnych RIN podczas funkcjonalizacji.

Oznacza to, że ważne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia podłoży, ponieważ może to doprowadzić do zapadnięcia się struktur. Po przeniesieniu podłoży pozostawiam je do inkubacji w paraformaldehydzie przez 20 minut. Po upływie 20 minut wyjmujemy podłoża z paraformaldehydu; teraz, gdy komórki zostały utrwalone, możemy przetworzyć te próbki zgodnie ze standardową procedurą immunobarwienia.

Aby to zrobić, umieszczamy podłoża stroną wierzchnią do góry na paraformaldehydzie i pipetujemy wystarczającą ilość PBS, aby przykryć podłoże i utrzymać je pod warstwą PBS. Następnie płuczemy podłoże trzykrotnie PBS, aby usunąć wszelki paraformaldehyd, który mógł pozostać w kulturze. Po trzykrotnym wypłukaniu podłoża PBS, możemy przenieść je do dalszego barwienia immunocytochemicznego.

Wykonujemy to, chwytając podłoże pęsetą i zanurzając je do góry dnem w pierwszym kroku barwienia immunocytochemicznego, którym jest zastosowanie środka permeabilizującego. W tym przypadku używamy 0,2% Triton X w PBS. Użytkownik może jednak zastosować dowolny środek permeabilizujący, który jest najbardziej odpowiedni dla jego potrzeb.

Powtarzamy tę czynność dla wszystkich naszych podłoży i w ten sposób obchodzimy się z nimi podczas procesu barwienia immunocytochemicznego. Po barwieniu podłoża są montowane na standardowym szkiełku przedmiotowym o wymiarach jednej na trzy cale, które można następnie analizować na dowolnym mikroskopie epifluorescencyjnym, zarówno odwróconym, jak i prostym. Przetwarzając próbki na mikroskopie konfokalnym, możemy skupić się na podstawie słupków, aby uzyskać pozycje zerowe, czyli nieodchylone.

Następnie możemy ustawić ostrość na wierzchołki słupków, wykonać kolejne zdjęcie słupków, a porównując obraz górny z dolnym, możemy zmierzyć ugięcia słupków i obliczyć siły trakcyjne generowane przez komórki w celu wywołania takich ugięć. Przeprowadzając ten proces dla wielu różnych komórek w kilku różnych warunkach, możemy następnie porównać siły trakcyjne generowane w tych różnych warunkach. Po zebraniu obrazów komórek żywych i utrwalonych, naszym kolejnym zadaniem jest pomiar ugięcia oraz pomiar sił trakcyjnych w komórkach.

W tym celu napisaliśmy program komputerowy w środowisku matlab. Są to trzy obrazy, których użyjemy w tej analizie. Pierwszy obraz to obraz fazowy komórki.

Ułatwia to zidentyfikowanie położenia komórki. Drugi obraz jest obrazem fluorescencyjnym wierzchołków słupków. Używamy go do zlokalizowania pozycji słupków na ich końcach.

Jak widać, niektóre z tych słupków są odchylone i odbiegają od prostokątnej sieci, w której znajduje się większość słupków, tak jak ten słupek oraz ten słupek. Trzecim obrazem, którego użyjemy, będzie obraz bazowy, który rejestruje pozycję słupków w płaszczyźnie ogniskowej przechodzącej przez ich podstawy.

Na tym etapie zarówno słupki odgięte, jak i nieodgięte powinny znajdować się w swojej pozycji spoczynkowej, czyli w pozycjach nieodgiętych. W sieci prostokątnej widać, że słupki, które na drugim obrazie były odgięte u podstawy, znajdują się teraz w pozycji FL. Obraz ten służy do wyznaczenia pozycji słupka w jego stanie nieodgiętym.

Następnie uruchamiamy program MATLAB, który poprosi nas o wczytanie tych trzech obrazów. Nadaj plikowi nazwę. Widoczny jest obraz fazowy.

Obrysujemy ramką obszar wskazujący położenie komórki, aby program wiedział, które słupki należy przeanalizować. Następnie program przeprowadza analizę intensywności, progowanie i binaryzację wyciętego obrazu w celu wyznaczenia współrzędnych OID słupków. Po lewej stronie znajdują się zbinaryzowane obrazy słupków z obrazu górnego, natomiast po prawej zbinaryzowane obrazy tych samych słupków z obrazu podstawy.

Po uzyskaniu pozycji i współrzędnych OID, program może następnie wyznaczyć wektory przemieszczenia między wierzchołkiem a podstawą każdego słupka. Wektory przemieszczenia słupków można przekształcić w wektory siły, mnożąc je przez stałą sprężystości słupka. Siły komórkowe można analizować na kilka sposobów, na przykład obliczając średnią siłę na komórkę lub średnią siłę na słupek.

Jednym z przydatnych rezultatów jest wykres wektorowy (quiver plot), który pozwala zwizualizować przestrzenny rozkład sił. Jest to komórka, którą właśnie przeanalizowaliśmy; widać na niej nałożone na słupki żółte strzałki, których długość odpowiada wartości siły, a kierunek wskazuje jej zwrot. Powtarzając ten proces analizy obrazu dla sekwencji zdjęć, takich jak te wymagane do naszego filmu poklatkowego, możemy wygenerować sekwencję czasową.

Oto film przedstawiający komórkę, którą stymulowaliśmy surowicą. Jak widać, bezpośrednio po dodaniu surowicy zwiększyła się kurczliwość komórki, co spowodowało jeszcze większe odgięcie słupków. Ponadto możemy określić siły dla większej liczby komórek poddanych różnym warunkom, a następnie utrwalonych i zabarwionych, co obrazują te wykresy wektorowe (quiver plots) przedstawiające komórkę traktowaną związkiem kontrolnym w porównaniu z komórkami traktowanymi inhibitorami kurczliwości.

Jak widać, wektory sił działające na komórkę w przypadku kontrolnym są dłuższe, co oznacza większą wartość, niż wektory sił w dwóch przypadkach, w których zastosowano inhibitory kurczliwości. Omówiliśmy tutaj obszerny materiał opisujący podłoża ścieżkowe – od mikrofabrykacji, przez przygotowanie próbek, eksperymentowanie i analizę – aby zademonstrować wszechstronność tych podłoży.

Opisaliśmy dwa różne testy: obrazowanie żywych komórek oraz test próbek utrwalonych, a następnie przeprowadziliśmy analizę komórek uzyskanych w obu tych badaniach, prezentując wykresy wektorowe (quiver plots) oraz filmy wektorowe. Dzięki temu potężnemu narzędziu można przeprowadzić szereg analiz przestrzennych i czasowych kurczliwości komórek. Jak Państwo widzieli, metoda ta opiera się na wielu różnych dyscyplinach, w tym na mikrofabrykacji, podstawowej biologii komórki, nauce o powierzchniach, analizie i przetwarzaniu obrazu oraz wielu innych.

Właśnie dlatego, że metoda ta opiera się na kilku różnych technikach inżynieryjnych, parametry takie jak geometria słupka, indukowane czynniki rozpuszczalne oraz metody analizy ugięć słupka mogą być dostosowane do potrzeb użytkownika. Mamy nadzieję, że prezentacja wizualna tej metody, którą omówiliśmy w ciągu ostatnich 20–30 minut, może posłużyć jako punkt wyjścia do innych i bardziej pogłębionych analiz dotyczących regulacji, skutków funkcjonalnych oraz generowania komórkowych sił przyciągania.