Mikrofabrykowane detektory post-macierzowe (mPADs): podejście do izolacji sił mechanicznych

Cześć, nazywam się Nathan Snia Decky i jest ze mną dzisiaj Wes Ligan, Robbie Desai i Mike Yang. Pochodzimy z laboratorium Chrisa Chena na Uniwersytecie Pensylwanii. W tym filmie przedstawimy nasze podejście do pomiaru sił przyciągania komórkowego za pomocą mikro sfabrykowanej matrycy słupków.

Siły trakcyjne są generowane przez interakcje miozyny i aktonów i odgrywają ważną rolę w naszej fizjologii. Podczas rozwoju umożliwiają komórkom przemieszczanie się z jednego miejsca do drugiego w celu uformowania wczesnych struktur naszej tkanki. Pomagają również w procesie gojenia, ponieważ są niezbędne do zamykania ran lub migracji i pełzania leukocytów po naszym ciele.

Ale niestety te same siły mogą być szkodliwe dla naszego zdrowia w przypadku raka, przerzutów lub wzrostu naczyń w kierunku guza. Jest więc bardzo niewiele metod, które pozwalają na ilościowy pomiar tych sił trakcyjnych, zwłaszcza w mikro i nanoskali pojedynczych komórek. Większość powszechnych metod badania komórek in vitro opiera się na naczyniach ze szklanym dnem lub polistyrenowych, ale są to bardzo sztywne podłoża i tak nie jest, nie pozwalają nam fizycznie zmierzyć sił ciągnięcia i zniekształceń, które powoduje komórka.

Bardzo trudno było zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw sił trakcyjnych bez pewnego rodzaju fizycznego odczytu. W laboratorium Chrisa Chena mamy technikę, która pozwala nam przezwyciężyć te ograniczenia. Nasza metoda opiera się na pionowym układzie elastycznych wsporników, których sztywność i skala rozmiarów są takie, że poszczególne komórki będą rozprzestrzeniać się na wielu wspornikach i odchylać je w tym procesie.

Najczęściej używane przez nas wymiary to cylindryczne słupki o średnicy trzech mikronów, średnicy 10 mikronów wysokości z dziewięciomikronowym odstępem od środka do środka i prostokątnym układem. Jednak wymiary te można zmieniać, aby dostosować je do różnych badań komórkowych. Zaczynamy od sztywnego wzorca krzemowego, który można zobaczyć tutaj, a następnie przekładamy go na elastyczne wsporniki PDMS, które widzimy tutaj.

Korzystając z tej techniki, możemy zmierzyć ugięcia poszczególnych wsporników pod mikroskopem i cofnąć siły trakcyjne komórkowe o wielkości i kierunku wymaganym do wygenerowania takich ugięć. Obróciliśmy te podłoża w pady M do detektorów mikro post array, a w tym filmie pokażemy, jak wytwarzać pady M, zaczynając od wzorca silikonowego, poprzez replikację PDMS, a na końcu do obliczeń modulacji i kurczliwości komórkowej. Cześć, jesteśmy w naszym czystym pomieszczeniu laboratoryjnym.

Jest to pomieszczenie wolne od kurzu i wrażliwe na światło, które pozwala nam wykonać SU osiem słupków, które będą służyć jako mistrz krzemowy. Najpierw zaczniemy od wafla krzemowego, a następnie pokryjemy go fotorezysłem SU eight, SU ósemką jest rezystancją ujemną i jest wrażliwa na światło. Więc kiedy zaświecimy światłem przez tę maskę fotograficzną, spowoduje, że światło utworzy wzór na mikrosłupkach, a następnie utworzy trójwymiarową strukturę, która następnie będzie ośmioma słupkami SU, które następnie odlamy w PDMS.

Więc po wykonaniu całej naszej obróbki, wafel będzie wyglądał tak, gdzie mamy mikro filar, mikro struktury słupkowe już wytworzone w płytce. Tak więc, aby zrobić mistrzów, najpierw zaczynamy od gołej płytki krzemowej, która jest czyszczona za pomocą ozonowania przez siedem minut, a następnie odwadniamy tę płytkę przez 30 minut w temperaturze 120 stopni Celsjusza. Zamierzamy obrócić na to SU eight 2002, aby utworzyć bardzo cienką warstwę bazową dla słupków.

Więc ponieważ będziemy kręcić SU ósemkę, założę maskę przeciwgazową, ponownie załaduję wafel do tego uchwytu tutaj, odkurzę kurz, który może się tam znajdować, umieścimy go na błystce, sprawdzimy, czy jest wyśrodkowany, a następnie przystąpimy do wylewania na to SU ósemki 2002. A potem przejdziemy dalej i zakręcimy wafelkiem. Następnie kładziemy je na gorącej płycie, miękkie pieczenie.

Robimy to przez minutę później. Następnie bierzemy go i przenosimy na płytę grzejną o temperaturze 95 stopni. I robimy to przez dwie minuty.

A kiedy to się skończy, weźmiemy to teraz i pójdziemy zrobić naświetlanie w nakładce na maskę. Okej, więc właśnie obróciliśmy SU ósemkę, pierwszą warstwę SU ósemkę na tej płytce, a teraz musimy zalać całą płytkę, aby stworzyć pierwszą warstwę bazową dla mikro słupków. Musimy więc dać temu 70 milidżuli ekspozycji.

Musimy więc zmierzyć rzeczywiste natężenie światła w naszych nakładkach na maskę. Ładujemy więc miernik do wagi do nakładki maski. Następnie naświetlamy go światłem.

To jest tutaj światło UV. Ładujemy wafel silikonowy na nakładkę maski, umieszczamy ją w nakładce maski. I tym razem nie mamy maski, więc w ten sposób możemy naświetlić cały film.

Włączmy migawkę i zwiększajmy czas naświetlania o jedną minutę, a następnie naświetlajmy. Tak więc po minucie system jest gotowy, możemy wyjąć wafel. A teraz musimy zrobić pieczenie po ekspozycji.

Właśnie wystawiliśmy tę płytkę i zamierzamy teraz dodać ciepła, aby wywołać reakcję sieciowania dla tej pierwszej warstwy SU eight. Umieszczamy go więc na płycie grzejnej o temperaturze 65 stopni na minutę, a następnie przenosimy na płytę grzejną o temperaturze 95 stopni na dwie minuty. Po dwóch minutach wyłączamy płytę grzejną i pozwalamy wafli ostygnąć z powrotem do temperatury pokojowej, co zajmuje około 30 minut.

Więc nawlekliśmy naszą drugą warstwę SU ósemki na ten wafel. A teraz musimy to naświetlić przez maskę fotograficzną. Tym razem użyjemy filtra UV, aby zablokować to głębokie światło UV.

Jest to szkło optyczne Hoya, które można zdobyć, ale tym razem musimy ponownie zmierzyć intensywność. Użyjemy więc naszego światłomierza lub filtra na górze, aby zmierzyć intensywność, która została odfiltrowana. A potem załadujemy maskę do nakładki na maskę.

Ten przełącznik wytwarza podciśnienie, które utrzymuje maskę na miejscu. Następnie umieścimy go w nakładce na maskę. Następnie umieścimy filtr na wierzchu, a następnie załadujemy do niego naszą wafel.

Chcemy mieć pewność, że kontakt jest dobry, więc podnosimy go do kontaktu, a następnie rozpoczynamy naświetlanie Po ekspozycji wyjmujemy wafel z nakładki maski. Mamy więc obszary, które zostały wybiórczo wyeksponowane. Zabierzemy to do piekarnika, do gorących płyt, aby zrobić na nim pieczenie po ekspozycji.

Właśnie zrobiliśmy Po, końcowe wypieki po ekspozycji, a teraz zamierzamy rozwinąć ten wafel, abyśmy mogli uzyskać trójwymiarowe struktury. To, co zamierzamy zrobić, to umyjemy to, wywołamy to w P-G-M-E-A, co zmyje nienaświetloną ósemkę SU. Tak więc najpierw zaczynamy w jednym naczyniu P-G-M-E-A i siedzimy tutaj przez dwie minuty z lekkim mieszaniem.

Odpuszczę to sobie na dwie minuty. Przejdziemy więc do drugiego dania P-G-M-E-A. To usunie to nasycone P-G-M-E-A z SU ósemką.

Po 10 sekundach przeniesiemy go do IPA. To zmywa P-G-M-E-A. Wkładamy go tutaj na 20 sekund, ponownie z lekkim poruszeniem.

A teraz mamy wolnostojące konstrukcje słupowe. Umieścimy to w heksanie, który ma niskie napięcie powierzchniowe. Będziemy prać przez pięć sekund w jednym, a następnie w dwóch heksanach, a następnie jesteśmy gotowi do wysuszenia suszarką.

Właśnie opracowaliśmy wafel, a teraz umieścimy go na gorącej płycie i powoli zwiększymy temperaturę do 150. I co się dzieje, to ta wyższa temperatura dalej łączy SU ósemkę, aby uczynić ją bardziej strukturalnie sztywną i zostawiamy ją na tej gorącej płycie na noc. Tak więc od 14 do 20 godzin, a następnie wyłączymy płytę grzejną i pozwolimy jej ponownie ostygnąć do temperatury pokojowej.

Więc to, co musimy zrobić, to pokroić ten wafel w kostkę do mniejszego rozmiaru. Zasadniczo chcemy przeciąć tę płytkę krzemową i stworzyć mały chip z tego wewnętrznego wzoru tutaj. Będzie to wyglądało mniej więcej tak, jak ta struktura, gdzie użyją żywicy epoksydowej.

I zamierzamy przykleić ten chip do szklanego szkiełka w ten sposób. A to zapewnia wsparcie strukturalne. Tak więc krojenie wafla w kostkę jest w pewnym sensie sztuką, ale to, co możesz zrobić, to w zasadzie użyć rysownika diamentowego i zacząć od jednej krawędzi.

A ze względu na płaszczyzny kryształów, po prostu umieszczasz małe nacięcie, które teraz stworzyło pęknięcie, które mogę następnie stuknąć tym narzędziem, Możemy to oderwać i możemy zrobić więcej cięć tutaj, aż uzyskamy małą strukturę, taką jak ta. A potem szybko umieszczasz krzemowy chip na szkle i montujesz go na miejscu. I pozwalasz, aby to się stało.

A kiedy skończysz, będziesz miał, będziesz miał urządzenie, które jest podobne do tego. Tak więc zamontowaliśmy krzemowy wzorzec na tym szklanym szkiełku, a teraz zamierzamy nałożyć na niego powłokę z floy, która pomoże w późniejszym uwolnieniu tej struktury z PDMS. Więc umieścimy chip w tym osuszaczu, a następnie weźmiemy kilka kropelek tego tri Chloro Siling, umieść kilka kropel w osuszaczu.

Robimy to wewnątrz maski, ponieważ jest to produkt uboczny w postaci gazu solnego, który jest dość ostry. Śmiało i zamknij pokrywę, przymocuj ją do odkurzacza, a następnie idziemy dalej i pozwalamy temu siedzieć z próżni i pozostawiamy ten osad na noc, aby uzyskać ładną powłokę na całej płytce krzemowej. Cześć, nazywam się Wesley Ligan.

Jestem doktorantem w laboratorium Christophera Chena. W tym momencie Nate pokazał Ci, jak stworzyć silikonowy wzorzec dla naszych podłoży ED. Zanim jednak będziemy mogli użyć tego narzędzia do pomiaru kurczliwości komórkowej, konieczne jest najpierw odtworzenie sztywnych struktur fotostrukturalnych za pomocą elastomerowego polimeru silikonowego.

Naszym pierwszym zadaniem jest wygenerowanie negatywnego szablonu wzorca silikonowego, który wyprodukowaliśmy wcześniej. Robimy to za pomocą elastomeru krzemowego o nazwie PDMS lub Polymethyl Sloane do naszego polimeru PDMS. Teraz dodajemy stosunek 1 do 10 utwardzacza.

Po zważeniu roztworu konieczne jest dokładne wymieszanie polimeru PDMS i środka do wycieku krzyżowego. To mieszanie oczywiście wprowadza dużo pęcherzyków powietrza do naszego roztworu. Dlatego w tym momencie konieczne jest odkrycie go i odgazowanie w osuszaczu próżniowym.

Gdy PDMS zostanie całkowicie odgazowany, a wszystkie pęcherzyki wypłyną na powierzchnię i pękną, możemy usunąć je z osuszacza próżniowego. Możemy teraz użyć tej mieszaniny PDMS i środka sieciującego do wygenerowania ujemnej formy naszego wzorca krzemowego. Aby to zrobić, używamy formy do ciasta i umieszczamy nasz zamontowany silikonowy mistrz w jej środku.

Następnie ostrożnie wlewamy roztwór polimeru DGA do naczynia na wierzch płytki krzemowej, starając się zapobiec tworzeniu się dodatkowych pęcherzyków. Zazwyczaj staramy się wlać polimer o grubości około ćwierć cala. Widać, że proces ten nieuchronnie wprowadza do mieszanki kilka pęcherzyków powietrza.

Więc teraz odstawiamy to danie na około 30 minut, aby bąbelki wypłynęły na powierzchnię i pękły. Widzimy, że po pozostawieniu go w pozycji siedzącej, na powierzchni PDMS nadal znajduje się kilka pęcherzyków powietrza. Ponieważ jednak znajdują się one na górnej powierzchni, możemy teraz użyć szybkiego wybuchu azotu, aby przebić wszelkie pozostałe pęcherzyki.

W celu pełnego usieciowania rozwiązania PDMS i CROSSLINKER oraz wygenerowania sztywnego ujemnego szablonu naszego wzorca krzemowego, wypiekamy go w temperaturze 110 stopni Celsjusza przez 20 minut. Widzimy, że na wierzchu podłoża silikonowego znajduje się cienka warstwa PDMS. Zanim będziemy mogli je rozdzielić, należy najpierw odciąć tę warstwę.

Następnie możemy zaszczepić tę wierzchnią warstwę i delikatnie oderwać ją od podłoża silikonowego. W tym momencie możemy odwrócić i bardzo powoli oderwać ujemne podłoże krzemowe, ujemne podłoże PDMS z dala od wzorca silikonowego. Okej, robimy to, przytrzymując jeden koniec w dół i delikatnie odrywając podłoże PDMS.

Możesz zobaczyć przedni postęp, gdy podłoże odkleja się od silikonowego wzorca. Teraz, gdy wygenerowaliśmy formę ujemną A-P-D-M-S naszego silikonowego mistrza, możemy pociąć ją na cztery indywidualne formy negatywowe, aby uzyskać końcowe podłoża padów. W tym momencie ważne jest, aby nie dotykać górnej części ujemnego podłoża kleszczami ani rękawiczkami, aby uniknąć uszkodzenia powierzchni.

W tym momencie wygenerowaliśmy cztery indywidualne matryce ujemne z wzorca silikonowego, składające się z dołków o średnicy trzech mikronów i głębokości dziewięciu mikronów. W celu regeneracji podniesionych powierzchni wspornikowych, możemy ponownie odlewać na tych ujemnych formach z PDI PDMS wykorzystującego PDMS. Jednak zanim to zrobimy, konieczne jest najpierw uczynienie tych negatywowych form nieadhezyjnymi poprzez pokrycie fluorem.

Robimy to w stuwatowej komorze plazmowej z pełną mocą przez jedną minutę. Po umożliwieniu komorze pompowania powrotu do plazmy, generuje to pole jonowo-gazowe, które wytrawia górną powierzchnię PDMS i sprawia, że jest ona bardziej przyczepna do cząsteczek fluoru Cy Lane. Po usunięciu ujemnych form z osuszacza próżniowego, można tutaj zobaczyć, że to, co nam pozostaje, to szereg głębokich studzienek o wymiarach trzy mikrony na 10 mikronów w nieprzywierającej warstwie PDMS.

Aby zregenerować pionowe wsporniki, których używamy do podłoży mpad, konieczne jest ponowne odlanie ich przy użyciu naszej mieszanki PDMS, co pozostawi nam dodatni wolnostojący układ wsporników elastomerowych, które identycznie odzwierciedlają krzemowy master, który wyprodukowaliśmy wcześniej. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest przeniesienie naszych nieprzylepnych form negatywowych na przyrząd montażowy, który wykonaliśmy z pasków PDMS i szklanego szkiełka mikroskopowego. Powód tej platformy stanie się jasny w następnym kroku.

W tym momencie możemy zdeponować niewielką kroplę naszej tej samej mieszaniny PDMS w proporcji 10 do jednego, aby już usieciować Degasa na górnej powierzchni każdej z naszych negatywnych form. Potrzebna jest tylko niewielka ilość PDMS, aby nie spływała na krawędź form negatywowych. W tym momencie.

Aby w pełni rozprowadzić PDMS na górnej powierzchni form, możemy chwycić jedną za pomocą kleszczy, odwrócić ją i doprowadzić do kontaktu z sąsiednią formą, ostrożnie rozprowadzając się wokół PDMS, aby w pełni pokryć całe podłoże. Bądź bardzo ostrożny na tym etapie, aby nie wprowadzać dalszych pęcherzyków do górnej roztworu PDMS, który można następnie powtórzyć z pozostałymi dwoma studzienkami, pozostałymi dwiema pleśniami. Teraz, gdy mamy bardziej jednolitą powłokę PDMS na górnej powierzchni, możemy umieścić ten przyrząd w osuszaczu próżniowym, aby dodatkowo usunąć wszelkie pęcherzyki, które mogą zostać uwięzione w filmie PDMS na naszych formach negatywowych.

Ten proces trwa zwykle około 30 minut. Podczas gdy nasze formy negatywowe odgazowują się, możemy wyczyścić szklane podłoża o wymiarach 22 na 22 milimetry, które staną się ostatecznym miejscem montażu padów. Pierwszym krokiem w tym procesie jest zdmuchnięcie wszelkich cząstek pyłu za pomocą sprężonego azotu.

Szklaną pokrywę wystawimy na działanie plazmy gazowej, która spopieli powierzchnię i sprawi, że będzie ona bardziej przyczepna do PMS, którą przykleimy do niej w kolejnym kroku. Po pozostawieniu górnej warstwy PDMS do DGA przez około 30 minut i plazmie aktywującej szklane szkiełka nakrywkowe, możemy następnie usunąć nasz szablon i doprowadzić górną powierzchnię szklanych szkiełek nakrywkowych, która została wystawiona na działanie plazmy gazowej, do kontaktu z warstwą PDMS na wierzchu form negatywowych. Zazwyczaj pomaga to najpierw zetknąć jedną krawędź szkiełka szklanej pokrywy z PDMS, a następnie pozwolić, aby reszta szkiełka szklanej okładki osiadła w SH, tak aby PDMS rozłożył się w sposób przypominający arkusz

Pomaga to zredukować wszelkie pęcherzyki wprowadzone do folii PDMS. W tym momencie możemy delikatnie docisnąć szczypcami górną powierzchnię szkiełka nakrywkowego do szkła, aby wypchnąć nadmiar PDMS, a także popchnąć szkiełko nakrywkowe do krzyża PDMS pośrodku szablonu. Zapobiegnie to przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego podczas utwardzania PDMS.

Powtarzamy to dla innych podłoży. W tym momencie możemy przenieść cały szablon do piekarnika i piec w temperaturze 110 stopni Celsjusza przez 22 godziny. Po pozostawieniu całego zespołu do ostygnięcia do temperatury pokojowej, możemy następnie usunąć nasze podłoża, odwrócić je i ostrożnie odkleić ujemną formę od szkiełka nakrywkowego.

Ważne jest, aby robić to powoli i równomiernie, aby uniknąć zgniecenia słupków lub oderwania ich od szklanego podłoża. Widzimy, że po oderwaniu negatywnej formy, pozostaje nam szereg wsporników, które dokładnie naśladują Silicon Master, tylko że teraz, gdy się znajdują, są zbudowane z elastycznego elastomeru PDMS. Okej, więc w tym momencie przeprowadziliśmy Cię przez to, jak generujemy Silicon Master naszych podłoży Emad.

Następnie użyliśmy procesu formowania repliki, aby wygenerować dokładną replikę przy użyciu polimeru elastomerowego A-P-D-M-S, dzięki czemu wsporniki są teraz elastyczne, aby umożliwić ogniwo rozprzestrzenianie się, kurczenie i odchylanie wsporników w tym procesie. W tym momencie nasze substraty są gotowe do przetworzenia na hodowlę komórkową. Teraz, gdy już wiemy, jak wytwarzać i replikować formy do tworzenia EDS, zamierzamy wykonać kilka dodatkowych kroków, aby uczynić EDS funkcjonalnym, abyśmy mogli się hodować, a następnie analizować siły trakcyjne.

Ale zanim to zrobimy, musimy zrobić trzy rzeczy. Musimy sprawić, aby końcówki słupków były przyklejone do komórek. Po drugie, musimy oznaczyć PDMS fluorescencyjnie, aby pomóc w wizualizacji i analizie ugięć po słupkach.

I po trzecie, musimy sprawić, aby ściany boczne słupków, a także podstawa słupków były nieprzywierające do komórek, tak aby siły trakcyjne były wywierane tylko na końcówki słupków. Zobaczymy więc, jak te kroki będą przebiegać dzięki strategii opartej na drukowaniu mikrokontaktowym w kolejnych minutach. Ale najpierw następnym krokiem jest usunięcie nadmiaru P-D-S-P-D-M-S z eds.

Tak jak wspomniałem, pierwszym krokiem jest pobranie substratu EDS, który West właśnie pokazał, jak je wygenerować i przyciąć. Nadmiar PDMS, który powstał w wyniku utwardzenia szklanej pokrywy, ześlizguje się z ujemną formą i używa ostrego wykończenia żyletki. Nadmiar PDMS można zrobić poprzez, kładąc żyletkę pionowo w dół na podłożu na krawędzi filarów, a następnie zeskrobując

Możesz też jednym palcem przytrzymać szkiełko nakrywkowe na miejscu, aby szkiełko nakrywkowe się nie poruszało. Tak więc to, co otrzymujemy, to podłoże z podkładki M, które zostało oczyszczone z zanieczyszczeń, dzięki czemu jest łatwo dostępne. Tak więc w następnym kroku musimy nawiązać mikrokontakt, wydrukować MPA, aby końcówki słupków były samoprzylepne.

Aby to zrobić, musimy najpierw wygenerować pieczątki, a proces ten jest bardzo prosty. Po prostu mieszamy PDMS zamiast stosunku 10 do jednego, stosunku jeden do 30 do jednego. Wlewamy szalkę Petriego tak, aby wysokość PDMS wynosiła około jednego centymetra.

Niech się odgazuje. Oznacza to, że pozwól bąbelkom wznieść się na wierzch PDMS i utwardź reakcję sieciowania w piekarniku w temperaturze 60 stopni przez godzinę po wyjęciu naczynia z piekarnika i pozostawieniu go do ostygnięcia, jestem teraz gotowy do wycięcia stempli. Więc znowu, za pomocą tego samego rodzaju żyletki, po prostu tnij, naciskając pionowo w dół, aby wejść do PDMS, aż zetkniesz się z dnem szalki Petriego.

Teraz orientacja stempla jest czymś, na co chcemy zwrócić uwagę. Powierzchnia stempla będzie tą stroną PDMS, która została odlana na dno szalki Petriego, tak aby pozostała płaska. Tak więc w tym dużym kwadracie PDMS, który wyciąłem, powierzchnia stempla jest teraz skierowana do góry.

Teraz ten stempel jest znacznie większy niż podkładki M, więc zamierzam go ponownie przyciąć do rozmiaru pojedynczej podkładki M, przecinając żyletką, ponieważ bardzo trudno jest określić prawidłową orientację stempla na oko, zamierzam zrobić małe nacięcie w tym, co będzie tylną stroną stempla, czyli stroną bez twarzy, tak jak tutaj. Mogę wtedy usunąć stempel z większej płyty. I mam teraz pieczątkę A-P-D-M-S do następnego kroku.

Chcemy wyczyścić pieczątki PDMS. Ponieważ jest bardzo możliwe, że pył z atmosfery osiadł na stemplach PDMS podczas ich cięcia. Jest to proces, w którym wkładamy żądaną liczbę stempli PDMS do tego naczynia krystalizacyjnego i napełniamy naczynie do krystalizacji 100% etanolem.

Więc po prostu dodaj tyle etanolu, aby pokryć powierzchnię stempli, ale dokładna ilość dodanego etanolu nie jest ważna. A następnie umieść krążek krystalizacyjny w atorze i sonikuj stemple przez pięć minut. Po upływie pięciu minut zakończymy sterylizację stempli i wykonamy pozostałą część drukowania mikrokontaktowego, czyli funkcjonalizację elektrodów M w sterylnym kapturze do hodowli tkankowej.

Tak więc teraz jesteśmy w kapturze do hodowli tkankowej, gdzie możemy dokończyć sterylizację stempli. Aby to zrobić, wyjmujemy stemple z naczynia krystalizacyjnego, zanurzamy je w naczyniu pełnym etanolu, aby spłukać wszelkie pozostałe zanieczyszczenia, a na koniec zanurzamy je w naczyniu z wodą, aby spłukać etanol. Następnie strumieniem azotu suszymy stempelki, aż nie pozostaną już widoczne krople.

Następnym krokiem jest więc pomalowanie znaczków roztworem białka. Roztwór białkowy, którego używamy, to 50 mikrogramów fibryny na promil w wodzie DEI. Po prostu weź trochę roztworu białka do pipety i umieść krople roztworu białka na powierzchni stempla.

Chcesz to zrobić, umieszczając małe kropelki na krawędzi powierzchni stempla. Po pierwsze, powtórz to dla wszystkich pieczątek, których będziesz używać i powinienem był to zrobić z wyprzedzeniem. Tak więc następnym krokiem po umieszczeniu kropek na krawędziach wszystkich stempli jest połączenie tych kropelek i wypełnienie roztworu białka na powierzchni stempla.

Powodem, dla którego to zrobiliśmy, jest to, że roztwór białka w kropelkach i sos pod kropelkami sprawia, że powierzchnia stempla jest hydrofilowa, co ułatwia rozprzestrzenianie się białka macierzy zewnątrzkomórkowej. Więc znowu, powtórz to dla wszystkich stempli, których używasz teraz, gdy rozprowadzamy roztwór białka na powierzchni stempli, ostatnim krokiem w tuszowaniu znaczków jest upewnienie się, że krawędzie są zakryte. Aby to zrobić, po prostu ustawiamy pipetę pod kątem i przesuwamy ją wzdłuż powierzchni stempla, tak aby zetknąć się zarówno z rogiem stempla PDMS, jak i roztworem białka.

I ponownie, powtórz to dla wszystkich krawędzi wszystkich stempli, które tuszujesz. Teraz, gdy kończymy farbować stempele, ustawiamy te stemble, pozostawiamy stemplowanie w kapturze do hodowli tkankowej na godzinę, aby ułatwić całkowite wchłonięcie białka na powierzchnię stempla. Teraz, gdy czekaliśmy godzinę, aż białka dotrą do swojego magazynu, wchłoną się na powierzchnię stempla, teraz nadszedł czas, aby spłukać je wodą i wysuszyć azotem.

Aby to zrobić, bierzemy sterylną wodę i wlewamy sterylną wodę do naczynia zawierającego znaczki. Uważaj, aby nie wylać wody bezpośrednio na powierzchnię stempla i w razie potrzeby możesz użyć pipety. Dokładna ilość wody, którą miałeś, nie jest ważna, o ile podniesiesz poziom wody powyżej roztworu białkowego.

Następnie za pomocą sterylnej pęsety weź jeden stempel, zanurz go w nowym naczyniu z wodą i delikatnie wysusz azotem. Ponownie, będziesz wiedział, że jest suchy, kiedy zobaczysz, kiedy nie zobaczysz już kropelek roztworu białkowego na stemplu. I powtórz to dla wszystkich stempli, które przetwarzasz pojedynczo.

Teraz, gdy wypłukaliśmy stemple do sucha, nadszedł czas, aby aktywować podłoża mpad poprzez potraktowanie ich ozonem UV. Przez siedem minut zdejmuję pokrywkę szalki Petriego z góry, z górnej części naczynia. Ponieważ ty, ponieważ polistyren jest absorbentem UV, wkładam naczynie do ozonownika UV, zamykam szufladę, ustawiam czas na siedem minut i puszczam.

Tak więc teraz wracamy do kaptura do hodowli tkankowych i nadszedł czas, aby stemplować substraty mpad, które właśnie zostały poddane działaniu ozonu UV. W tym celu podnieś nasze wypłukane i wysuszone stemple za pomocą kleszczy. Stemple można dotykać po bokach, ale nie należy dotykać ich czoła.

Chcesz wyregulować stempel w kleszczach tak, aby strona białkowa była dostępna. Następnie odwracasz kleszcze, pamiętając, że strona białkowa jest skierowana w dół i powoli doprowadzasz stempel do kontaktu z eds. Od jednego do 30 stempli jest dość lepkich, więc może być konieczne użycie drugiej pary pęsety, aby uwolnić stempel z kleszczy.

Możesz zrzucić stempel z wysokości około dwóch milimetrów do około ośmiu milimetrów na emedy. Następnie przechyl miskę emedów do góry i delikatnie dociśnij kleszczem, aby stworzyć kontakt między stemplem a eds. O nawiązaniu kontaktu dowiesz się na jeden z dwóch sposobów.

Pierwszym z nich jest spojrzenie na powierzchnię ED przez bok stempla. Może to być trudne do zauważenia w aparacie, ale na oko wyraźnie widzę, że stempel styka się z powierzchnią, patrząc na powierzchnię przez bok stempla. Drugim sposobem zapewnienia kontaktu z p jest wyjęcie szalki Petriego z kaptura do hodowli tkankowej z założoną pokrywką i obejrzenie jej pod odwróconym mikroskopem.

Wizualizując wzorce interferencyjne za pomocą mikroskopu, powinieneś być w stanie stwierdzić, kiedy, czy i kiedy stempel styka się z eds. Po ustaleniu kontaktu, stempel musi tylko pozostać w kontakcie z podłożem ed przez kilka sekund. Nadszedł więc czas, aby usunąć pieczątkę.

Aby to zrobić, złóż Eds jedną parą pęsety i jednym płynnym ruchem odklej stempel. Pamiętaj, aby śledzić, które edycje ostemplowałeś i które stemple masz już wcześniej. I powtórz tę procedurę raz na EMPA dla każdego podłoża, którego chcesz użyć.

Teraz, gdy stemplujemy EMPA, następnym krokiem jest ich sterylizacja, a następnie inkubacja w lipofilowym barwniku zwanym barwnikiem oka. Dai jest cząsteczką lipofilową, która jest znakowana fluorescencyjnie, więc dyfunduje do PDMS w ciągu czasu, co pozwala nam uwidocznić ugięcia po mikroskopie. Więc to, co zamierzam zrobić, to wziąć każdy pojedynczy substrat empa pojedynczo i zanurzyć go w 100% etanolu, 70% etanolu DI woda, wodzie DI, wodzie DI, wodzie DI

I na koniec roztwór dii o stężeniu pięciu mikrogramów na promil. Roztwór DII jest fluorescencyjny, więc aby zminimalizować jego ekspozycję na światło otoczenia i zminimalizować wybielanie fotograficzne, przykrywamy naczynia folią aluminiową, podczas gdy inkubują się w kapturze do hodowli tkankowych przez godzinę. Teraz, gdy czekaliśmy godzinę na inkubację elektrod EM w roztworze DAI, możemy usunąć folię aluminiową i wypłukać roztwór DAI.

Spłukujemy go, wykonując trzy sekwencyjne zanurzenia w wysterylizowanej wodzie, a na koniec zanurzamy w roztworze 0,2%onic F1 27. To 0,2% masy na objętość Podczas wszystkich etapów zanurzania ważne jest, aby zminimalizować czas, w którym podkładki EM są wystawione na działanie powietrza. Ma to na celu zapobieżenie uszkodzeniom podłoży ED, a w szczególności zapobieżenie zapadaniu się dwóch słupków na siebie.

0,2%onic F1 27 to kopolimer trójblokowy, który składa się z domen hydrofilowych i hydrofobowych. Wiadomo, że domena hydrofilowa jest odporna na wchłanianie białek, a tym samym na adhezję komórek, podczas gdy domena hydrofobowa wiąże się z temperamentem z hydrofobowym PDMS. Tak więc, gdy PDMS jest nasączony F1 27, F1 27 wiąże się z PDMS i odpycha adhezję komórek.

Po godzinnej inkubacji w przewlekłym F1 27 na pokrytej folią aluminiową szalce Petriego, możemy wypłukać F1 27 poprzez sekwencyjne zanurzenia w sterylnej wodzie, sterylnej wodzie i PBS. Po zanurzeniu w PBS i wypłukaniu produktu F1 27, możemy zanurzyć substraty EDS w wybranym roztworze do hodowli komórkowych. Roztwór do hodowli komórkowych, w którym właśnie zanurzyłem EMPA, może zawierać surowicę i/lub inne czynniki wzrostu i/lub suplementy, takie jak penicylina i streptomycyna.

Wszystkie te składniki są w pełni kompatybilne z zabiegami EMPA. Teraz następnym krokiem, po zanurzeniu EDS w roztworze do hodowli komórkowej, jest zasianie wybranych komórek na EDS. W tej ex szczególnej konfiguracji eksperymentalnej będę wysiewać bydlęce komórki śródbłonka aorty płucnej do trzech różnych szalek.

Powodem, dla którego używam trzech różnych naczyń, jest to, że będę traktować dwie z nich znanymi inhibitorami dotyku, aby zahamować ugięcia słupków, co będziemy mogli ocenić w późniejszym czasie. Tak więc, aby wysiać komórki, po prostu biorę zawiesinę komórek, pobieram odpowiednią ilość do pipety i pipetuję kroplami do każdego naczynia. Dodaję tyle komórek, że kiedy wykonuję test mierzący siły ciągnięcia, komórki istnieją jako pojedyncze komórki na eds.

Ilość, którą dodasz, będzie zależeć od obszaru rozprzestrzeniania się, a także od tempa wzrostu poszczególnych komórek. Zazwyczaj wysiewamy od 1500 do 5 000 komórek na centymetr kwadratowy podłoża. Po zakończeniu wysiewu komórek lub edycji zawiesiny komórek, kroplami do kultury delikatnie kołysz kulturę kilka razy w przód iw tył w prostopadłych kierunkach, aby wymieszać zawiesinę komórkową z naczyniem hodowlanym.

Powtórz ten proces dla wszystkich podłoży, których używasz. Natychmiast po wysianiu komórek należy umieścić je w inkubatorze o temperaturze 37 stopni przy odpowiednim poziomie dwutlenku węgla, aby zbuforować pH i pożywkę do hodowli komórkowych. Dwie godziny, około dwie godziny po wysianiu komórek, należy przepłukać komórki, przenosząc substraty z jednego naczynia z pożywką do świeżego naczynia z tą samą pożywką do hodowli komórkowych.

Powodem tego płukania jest to, że większość komórek zacznie się rozprzestrzeniać i osiągnie prawie ostateczną powierzchnię rozprzestrzeniania się w ciągu dwóch godzin. Płucząc komórkę, substraty, usuwasz wszelkie pływające komórki z pożywki do hodowli komórkowych. W ten sposób tylko komórki, które przyczepiły się do EDS i rozpoczynają proces rozprzestrzeniania się, pojawią się w końcowym teście sił trakcyjnych.

Jednym z testów, które możemy wykonać na komórkach, które zostały wyhodowane na MPA, jest obrazowanie poklatkowe w celu ilościowego zbadania dynamiki kurczliwości komórek. W szczególności, że interesująca jest dynamika kurczliwości komórek w odpowiedzi na czynniki rozpuszczalne. Wiadomo, że czynniki rozpuszczalne, takie jak związki biologiczne i związki syntetyczne, zwiększają, zmniejszają lub mają nieznany wpływ na kurczliwość komórek.

W tym eksperymencie z żywymi komórkami użyjemy tego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego epi. Na stoliku mikroskopowym mam małą skrzynkę inkubatora, która została podłączona do regulatora termicznego, aby utrzymać temperaturę na poziomie 37 stopni Celsjusza przy 5% CO2. Będziemy obrazować w dużym powiększeniu za pomocą obiektywu APO o powiększeniu 60x.

Teraz zajmiemy się przygotowaniem podłoża uderzeniowego do obrazowania. Obiektyw 60 x, którego używamy do obrazowania, ma odległość roboczą 200 mikronów, która jest znacznie cieńsza niż grubość naczynia do hodowli tkankowej, w którym wcześniej zasialiśmy komórki. Dlatego nie możemy, nie możemy obrazować komórek na implantach w naczyniu do hodowli tkankowej.

Aby obejść ten problem, używamy tych naczyń ze szklanym dnem. Przeniosę teraz podłoże do szklanego naczynia z dnem do góry nogami, tak aby komórki i końcówki słupków znajdowały się na styku szklanego dna naczynia. Dlatego, gdy jest on umieszczony w mikroskopie, odległość robocza między komórkami a obiektywem jest mniejsza niż 200 mikronów.

Teraz jesteśmy gotowi, aby umieścić to pod mikroskopem w celu obrazowania. Teraz otworzę komorę inkubatora z żywymi komórkami, umieszczę w niej próbkę i założę pokrywę komory inkubatora. W tym momencie zeskanuję podłoże w poszukiwaniu odpowiedniej komórki.

Do obrazu. Najskuteczniejszym sposobem, aby to zrobić, jest użycie obiektywu Face phase one 10 x, który pozwoli mi zobaczyć szersze pole podłoża i szybciej znaleźć komórkę. Moje kryterium dobrej komórki to pojedyncza komórka.

Nie powinien dotykać żadnych sąsiednich komórek, a także powinien być mniej więcej średniej wielkości w porównaniu do wszystkich innych komórek na podłożu, znalazłem odpowiednią komórkę do obejrzenia. Następną rzeczą, którą zrobię, to przestawię obiektyw na 60 x, aby spojrzeć na komórkę w dużym powiększeniu. Aby to zrobić, rozogniskowujemy cel, aby nie uderzać w scenę podczas obracania.

Podczas obracania wieżyczki otwórz komorę, częściowo obróć obiektyw 60 x wywiad 60 x 60 x x jest soczewką zanurzeniową olejkową, więc musimy umieścić kroplę olejku immersyjnego na soczewce obiektywu. Teraz zakończymy obracanie murawy, aby ustawić 60 x na miejscu. Zamkniemy komorę inkubatora i ponownie skupimy się na celu, aby komórka ponownie była ostra.

Po dostrojeniu pozycji i ostrości komórki przełączam się na kamerę CCD, aby wyświetlić podgląd komórki na ekranie komputera, a następnie rozpocząć obrazowanie poklatkowe. W tym eksperymencie będziemy zbierać zarówno obrazy fazowe, jak i fluorescencyjne w odstępie jednej minuty, więc obrazowanie poklatkowe już się rozpoczęło i pozwolę mu działać przez 10 minut lub 10 klatek, a w tym momencie dodam surowicy, że minęło już 10 minut. W tym czasie otworzę komorę i dodam surowicę do naczynia, aby pobudzić kurczliwość komórki.

Zegar nadal działa, więc muszę się z tym spieszyć Teraz będziemy kontynuować obrazowanie komórki przez 30 minut, aby śledzić wszelkie zmiany w kurczliwości. Po zakończeniu obrazowania poklatkowego obrazy można sekwencjonować w wyświetlany film. Oto dwa filmy przedstawiające obrazy fazy i fluorescencji.

Po lewej stronie znajduje się film fazowy a, przedstawiający przeważnie przezroczystą komórkę obrysowaną na czarno. Komórka jest rozłożona na końcach 20 słupków, które są okrągłymi strukturami ułożonymi w prostokątną siatkę. Po prawej stronie znajduje się film fluorescencyjny przedstawiający tę samą komórkę, ale widoczne są tylko słupki.

Jeśli odtworzę te filmy, zobaczysz, że słupki przymocowane do komórki są początkowo słabe, odchylone i bardzo mało odchylają się od prostokątnej siatki. Mniej więcej w połowie filmu dodałem serum do mediów. Serum stymuluje komórkę do zwiększenia kurczliwości.

Ponieważ komórka wywiera większe siły trakcyjne na leżące poniżej słupki, słupki wzdłuż obwodu komórki zaczynają odchylać się do wewnątrz. Na filmie fluorescencyjnym widać teraz słupki znacznie odchylające się od swoich pozycji w prostokątnej siatce. Jak opisałbym później, przemieszczenie tych pozycji słupków na tych zdjęciach może być wykorzystane do analizy sił trakcyjnych tego ogniwa.

Wcześniej widzieliśmy, w jaki sposób generujemy substraty mpad i jak je funkcjonalizujemy, aby hodować komórki. Teraz zapewne zauważyliście, że gotowe substraty mpad umieściłem w trzech różnych naczyniach do hodowli komórkowych. Komórki rosły przez noc, a teraz zamierzam potraktować każdą pojedynczą szalkę z hodowli komórkowej innym rozpuszczalnym środkiem, który moduluje kurczliwość w znany sposób.

Następnie możemy zmierzyć w sposób ilościowy siły trakcyjne, które powstają Po utrwaleniu komórek w ciągu 30 minut. Po dodaniu rozpuszczalnych czynników 30 minut po dodaniu inhibitorów kurczliwości, nadszedł czas, aby utrwalić komórki za pomocą aldehydu paraformowego, aby zablokować obecny stan sił trakcyjnych. Aby to zrobić, ważne jest, aby użyć aldehydu paraform zawierającego wapń i magnez, a my używamy aldehydu paraform w procentach objętościowych 3,7%Metoda zanurzania substratów w aldehydzie paraformowym, przepraszam, jest taka sama, jak metoda zanurzania substratów w tym, w różnych RIN podczas funkcjonalizacji.

Oznacza to, że ważne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia podłoży, ponieważ może to prowadzić do zawalenia się. Po przeniesieniu, przeniosłem substraty, pozwoliłem im inkubować w paraform aldehydu przez 20 minut. Po upływie 20 minut usuwamy substraty z aldehydu paraformowego, a teraz, gdy komórki zostały utrwalone, możemy przetworzyć te próbki do standardowego barwienia immunologicznego.

Aby to zrobić, umieszczamy substraty stroną zadrukowaną do góry na param i pipetujemy na wystarczającej ilości PBS, aby pokryć substrat i trzymać go pod PBS. Następnie trzykrotnie spłukujemy podłoże PBS, aby usunąć wszelkie aldehydy paraformowe, które mogą pozostać w kulturze. Po trzykrotnym przepłukaniu podłoża PBS, możemy przenieść podłoże do dalszego barwienia immunologicznego.

Robimy to, dotykając podłoża za pomocą pęsety i odwracając na pierwszym etapie barwienia immunologicznego, czyli środka przenikającego. W tym przypadku używamy 0,2%Triton X w PBS. Jednak użytkownik może użyć dowolnego agenta izacyjnego, który jest najbardziej odpowiedni dla jego potrzeb.

Powtarzamy to dla wszystkich naszych substratów i w ten sposób obchodzimy się z podłożami podczas procesu barwienia immunologicznego. Po barwieniu immunologicznym podłoża są montowane na standardowym szkiełku podstawowym o wymiarach jeden cal na trzy cale, które można następnie przetworzyć na dowolnym mikroskopie fluorescencyjnym epi, zarówno odwróconym, jak i pionowym. Przetwarzając próbki pod mikroskopem konfokalnym, możemy skupić się na dolnej części słupków, aby uzyskać pozycje nieodchylone, czyli zerowe.

Następnie możemy skupić się na końcach słupków, zrobić kolejny obraz słupków, a porównując górny i dolny obraz, możemy zmierzyć ugięcia słupków i obliczyć siły pociągowe komórek, które komórki wygenerowały w celu wytworzenia takich ugięć. Wykonując ten proces dla wielu różnych komórek w kilku różnych warunkach, możemy następnie porównać siły trakcyjne generowane w różnych warunkach. Teraz, gdy zebraliśmy obrazy zarówno żywych, jak i nieruchomych komórek, następnym zadaniem jest zmierzenie ugięcia, zmierzenie sił ciągnących w komórkach.

Aby to zrobić, aby to zrobić, napisaliśmy program komputerowy w matlabie. Są to trzy obrazy, których użyjemy w tej analizie. Pierwszy obraz jest obrazem fazowym komórki.

Jest to pomocne w określeniu lokalizacji komórki. Drugi obraz to fluorescencyjny obraz wierzchołków słupków. Używamy tego obrazu, aby zlokalizować pozycje słupków na ich końcu.

Jak widać, niektóre z tych słupków są odchylone i odchylają się od prostokątnej siatki, w której znajduje się większość słupków, takich jak ten słupek. I ten post. Trzecim obrazem, którego użyjemy, jest obraz podstawowy, który uchwycił położenie słupków w płaszczyźnie ogniskowej, która przecina ich podstawę.

Na tym poziomie zarówno odbite, jak i nieodchylone słupki powinny znajdować się w pozycji spoczynkowej, nieodchylonej. W prostokątnej siatce widać, że słupki, które zostały odchylone na drugim zdjęciu u podstawy, znajdują się w pozycji FL. Ten obraz służy do znalezienia pozycji postu, który jest, jest pod odbitą pozycją.

Następnie ładujemy program MATLAB, który poprosi nas o załadowanie tych trzech obrazów. Nadaj plikowi nazwę. Widzisz obraz fazy.

Narysujemy pole wokół wskazujące, gdzie znajduje się komórka, aby program wiedział, które posty przeanalizować. Następnie program wykonuje intensywność, progowanie i izację przyciętego obrazu, aby określić współrzędne OID słupków. Po lewej stronie znajdują się zobrazowane obrazy postów z górnego obrazu, podczas gdy po prawej stronie znajdują się zobrazowane obrazy tych samych postów z obrazu podstawowego.

Po uzyskaniu słupków, współrzędnych OID, program może następnie określić wektory przemieszczenia między końcówką a podstawą każdego słupka. Te wektory przemieszczenia słupka można przekształcić w wektory siły, mnożąc je przez stałą sprężystości słupka. Możemy analizować te siły komórkowe na wiele sposobów, takich jak średnia siła na komórkę lub średnia siła na słupek.

Jednym z przydatnych wyników jest wykres kołczanu, na podstawie którego możemy zobrazować przestrzenny rozkład sił. To jest komórka, którą właśnie przeanalizowaliśmy i widać, że nałożyłem żółte strzałki na słupki, które korelują z wielkością siły i wskazują kierunek siły. Powtarzając ten proces analizy obrazu dla sekwencji obrazów, takich jak te, które są wymagane w naszym filmie poklatkowym, możemy wygenerować sekwencję czasową.

Oto film z komórką, którą stymulowaliśmy surowicą. Jak widać, tak jak dodano surowicę, tak komórka zwiększyła kurczliwość i jeszcze bardziej odchyliła słupki. Ponadto możemy określić ilościowo siły dla większej liczby komórek, które zostały poddane różnym warunkom, a następnie utrwalone wybarwione, czego przykładem są te wykresy kołczanów pokazujące komórkę traktowaną związkiem kontrolnym w porównaniu z komórkami traktowanymi inhibitorami kurczliwości.

Jak tylko możesz. Jak widać, wektory siły na, w komórce w przypadku kontrolnym są większe niż większe pod względem długości niż wektory siły. W dwóch przypadkach, w których zastosowano inhibitory kurczliwości, omówiliśmy tutaj wiele materiału materiałowego, aby opisać substrat ścieżki od mikrowytwarzania do przygotowania próbki, eksperymentów i analizy, aby zademonstrować wszechstronność tych substratów.

Opisaliśmy dwa różne testy, obrazowanie żywych komórek i test stałej próbki, a także przeprowadziliśmy analizę komórek uzyskanych z obu tych testów i pokazaliśmy wykresy kołczanów i filmy z kołczanami. Za pomocą tego potężnego narzędzia można przeprowadzić różnorodną analizę przestrzenną i czasową kurczliwości komórek. Jak widzieliście, metoda ta czerpała z wielu różnych dyscyplin, w tym z mikrofabrykacji, podstawowej biologii komórki, nauki o powierzchni, analizy i przetwarzania obrazu oraz wielu innych.

I właśnie dlatego, że jego metoda opiera się na kilku różnych technikach inżynieryjnych, parametry takie jak geometria słupka, indukowane czynniki rozpuszczalne i metody analizy ugięć słupków można dostosować w zależności od potrzeb użytkownika. Mamy nadzieję, że wizualna demonstracja tej metody, którą przedstawiliśmy w ciągu ostatnich 20, 30 minut, może być wykorzystana jako punkt wyjścia do innych i głębszych analiz dotyczących regulacji, konsekwencji funkcjonalnych i generowania sił przyciągania komórkowego.